Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

Nutrición

• Dependencia metabólica del hospedero • Capacidad biosintética limitada • Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies • Single omission tests: difícil sacar conclusiones • Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

Nutrición - Mecanismos

• Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas • Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad • Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración • Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

Glúcidos

• • Transporte mediado en membranas celulares

T. brucei

: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina •

T. equiperdium

: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol •

E. histolytica

: glucosa por 2 sitios, paso limitante • Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.

Caso: Metabolismo de Galactosa en

Trypanosoma brucei

.

• El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de

T. brucei

.

• Gal está presente en cantidades importantes en las VSG • Los transportadores de hexosas de

T. brucei

son

incapaces

de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP glucosa 4´epimerasa (galE).

Glicoconjugados de superficie en

Trypanosoma brucei

Mutante condicional null para galE

• Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal.

• Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE • Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar.

Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de

T. brucei

y contenido de nucleótidos (A) Growth of

galE

-cKO with and without Tet (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the

galE

-cKO without Tet (C) Sugar nucleotide levels of the

galE

cKO Tet cells.

•Los niveles celulares de UDP galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG

El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG

El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

Aminoácidos

• • Translocación – mediada en su gran mayoría • • • Endocitosis de proteínas.

T. brucei

: 4 sitios operativos

T. cruzi

: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala

Plasmodium

: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

Caso: la Arginina es un aa esencial para

Toxoplasma gondii

• En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato •

T. gondii

carece del gen de la CPSI • Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos

Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48hs medio normal B: 48hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg

Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

   

Hemoglobina

95% de las proteínas totales de GR Abundante (>300 mg/ml o approx 5 mM) 60-80% es degradada durante el estadio eritrocitario 110 g (en un total de 750) se consumen en 48 hs con una parasitemia del 20%

Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR

Endocitosis del citoplasma eritrocitario

cytostome food vacuole pinocytosis (rings)

Camino endocítico

Vacuola Digestiva

Un lisosoma especializado ATP

• • •

digestion de hemoglobina H + (pH 5-5.4) Proteasas de la vacuola plasmepsinas I & II (aspártico) falcipainas I - III (tiol) falcilysinas (metallo) ADP citoplasma parasitario

El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb

a-

F33/L34

 •

Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α)

–

‘región bisagra’

– –

conservada Importante para estabilizar el tetrámero

•

Se forman fragmentos grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior

–

Se libera Heme

La digestión de la Hb es un proceso ordenado

hemoglobina plasmepsina fragmentos de globina grandes falcipaina plasmepsin heme (20 aa)

• •

Exopeptidasa?

Amino acidos libres?

falcilysina Fragmentos chicos (6-8 aa)

La vacuola Digestiva de Plasmodium Un lisosoma especializado ATP ADP H + hemoglobin

plasmepsin

heme + globin fragments proteins

falcipain plasmepsin falcilysin

small fragments (6-8 amino acids)

Pfmdr-1?

amino acids

amino peptidase

ATP ADP

El Heme libre es tóxico

• • •

Desestabiliza y lisa membranas Las hidrolasas se liberan en el citoplasma del parásito El parásito muere

• • •

Posible Mecanismos de Detoxificación heme



hemozoína (pigmento malárico) Degradación mediada por H 2 O 2 o GSH heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)

Hemozoína =

b

-Hematina

heme

b

-hematina

b

-hematina forma cristales insolubles 'biocristalizacion' or 'biomineralización'

La vacuola digestiva

Un lisosoma especializado O 2 Fe 3+ O 2



O 2 hemoglobin Fe 2+

plasmepsin

heme + globin fragments H +

?

falcipain 

Fe se oxida después de liberarse de la Hb



La oxidación promueve la formation of ROI



Estrés oxidativo hemozoin

plasmepsin falcilysin

small fragments (6-8 amino acids)

Pfmdr-1?

ATP ADP amino acids

amino peptidase

ATP ADP

Nucleótidos

• No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo • Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos • En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina • Locus para transporte de nucleósidos • • Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie

Plasmodium

: hipoxantina es fuente de purina

Transportadores de purinas en

Plasmodium

Vías de salvataje de purinas en parásitos

Lípidos

• Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados • Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora • Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria • Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

Metabolismo del colesterol en

Toxoplasma gondii

METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS

Generalidades

Objetivos del metabolismo energético • a) Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía • b) Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

Esquema de Metabolismo Energético

KINETOPLASTIDOS

•

Trypanosoma brucei

como modelo: • a) Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol • b) Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes • c) Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma • d) Flujo glicolítico es relativamente alto • e) Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas

Glicólisis

• Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200.

• Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas.

Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O 2 dentro de la mitocondria • Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa.

• Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.

• Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO 2 , ALA y ASP

•

Glicólisis y glicosomas

Metabolismo energético en formas circulantes y proçíclicas de

T. brucei

Amebas Intestinales y Giardia

• Glicolisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO 2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol • Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa • Sin citocromos • Almacenan glucógeno • Toleran bajas concentraciones de oxígeno

Glucolisis

Glucolisis anaerobia

Mitosomas

- Descrito en

E. histolytica

,

G. lamblia

- El origen mitocondrial del mitosoma está apoyado por: - i) Doble membrana - ii) localización de proteínas de la maquinaria del clusters de Fe-S (ej. Ferredoxina) - iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales

Enzimas glicolíticas de

Entamoeba histolytica

Trichomonas

• Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO 2 y H 2 O • La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones • La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H + es el aceptor final de los electrones

Hidrogenosomas

• Organelos de eucariotes anaeróbicos que generan hidrógeno molecular • 1 um, doble membrana • Comparten ancestro con mitocondrias • Tricomonas, ciliados anaerobios, hongos

CO 2 Pyruvate NAD(P)H NAD(P)+ NAD(P)-FO 2Fd ME [Fe]Hyd 2Fd Malate Transit peptides N H 2 2H+ ASCT Acetyl-CoA PFO Succinate hsp70 cpn60 ADP Acetate Succinyl-CoA CoASH CO 2 Fungi and Trichomonas Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Unknown ancestry ATP STK ADP + P i Protein import AAC ATP Double membrane Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993)

Generación de ATP en Hidrogenosomas

Acidocalsomas

Organelos ácidos Almacenan calcio En varios microorganismos Primero definidos en tripanosomátidos Alta densidad electrónica Alta concentración de fosfatos, Ca++., Mg++

Apicoplastos

Organelo cloroplasto-símil -Vias biosintéticas de origen cianobacteriano -Producto de la endosimbiosis secundaria de una cianobacteria y un eucariote -En Apicomplexa -Semiautónomos, genoma propio reducido