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Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos
Nutrición
• Dependencia metabólica del hospedero • Capacidad biosintética limitada • Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies • Single omission tests: difícil sacar conclusiones • Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas
Nutrición - Mecanismos
• Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas • Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad • Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración • Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis
Glúcidos
• • Transporte mediado en membranas celulares
T. brucei
: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina •
T. equiperdium
: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol •
E. histolytica
: glucosa por 2 sitios, paso limitante • Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.
Caso: Metabolismo de Galactosa en
Trypanosoma brucei
.
• El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de
T. brucei
.
• Gal está presente en cantidades importantes en las VSG • Los transportadores de hexosas de
T. brucei
son
incapaces
de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP glucosa 4´epimerasa (galE).
Glicoconjugados de superficie en
Trypanosoma brucei
Mutante condicional null para galE
• Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal.
• Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE • Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar.
Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.
Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de
T. brucei
y contenido de nucleótidos (A) Growth of
galE
-cKO with and without Tet (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the
galE
-cKO without Tet (C) Sugar nucleotide levels of the
galE
cKO Tet cells.
•Los niveles celulares de UDP galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.
Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG
El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina
Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG
El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol
Aminoácidos
• • Translocación – mediada en su gran mayoría • • • Endocitosis de proteínas.
T. brucei
: 4 sitios operativos
T. cruzi
: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala
Plasmodium
: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma
Caso: la Arginina es un aa esencial para
Toxoplasma gondii
• En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato •
T. gondii
carece del gen de la CPSI • Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.
Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos
Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48hs medio normal B: 48hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg
Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium
Hemoglobina
95% de las proteínas totales de GR Abundante (>300 mg/ml o approx 5 mM) 60-80% es degradada durante el estadio eritrocitario 110 g (en un total de 750) se consumen en 48 hs con una parasitemia del 20%
Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR
Endocitosis del citoplasma eritrocitario
cytostome food vacuole pinocytosis (rings)
Camino endocítico
Vacuola Digestiva
Un lisosoma especializado ATP
• • •
digestion de hemoglobina H + (pH 5-5.4) Proteasas de la vacuola plasmepsinas I & II (aspártico) falcipainas I - III (tiol) falcilysinas (metallo) ADP citoplasma parasitario
El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb
a-
F33/L34
•
Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α)
–
‘región bisagra’
– –
conservada Importante para estabilizar el tetrámero
•
Se forman fragmentos grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior
–
Se libera Heme
La digestión de la Hb es un proceso ordenado
hemoglobina plasmepsina fragmentos de globina grandes falcipaina plasmepsin heme (20 aa)
• •
Exopeptidasa?
Amino acidos libres?
falcilysina Fragmentos chicos (6-8 aa)
La vacuola Digestiva de Plasmodium Un lisosoma especializado ATP ADP H + hemoglobin
plasmepsin
heme + globin fragments proteins
falcipain plasmepsin falcilysin
small fragments (6-8 amino acids)
Pfmdr-1?
amino acids
amino peptidase
ATP ADP
El Heme libre es tóxico
• • •
Desestabiliza y lisa membranas Las hidrolasas se liberan en el citoplasma del parásito El parásito muere
• • •
Posible Mecanismos de Detoxificación heme
hemozoína (pigmento malárico) Degradación mediada por H 2 O 2 o GSH heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)
Hemozoína =
b
-Hematina
heme
b
-hematina
b
-hematina forma cristales insolubles 'biocristalizacion' or 'biomineralización'
La vacuola digestiva
Un lisosoma especializado O 2 Fe 3+ O 2
O 2 hemoglobin Fe 2+
plasmepsin
heme + globin fragments H +
?
falcipain
Fe se oxida después de liberarse de la Hb
La oxidación promueve la formation of ROI
Estrés oxidativo hemozoin
plasmepsin falcilysin
small fragments (6-8 amino acids)
Pfmdr-1?
ATP ADP amino acids
amino peptidase
ATP ADP
Nucleótidos
• No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo • Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos • En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina • Locus para transporte de nucleósidos • • Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie
Plasmodium
: hipoxantina es fuente de purina
Transportadores de purinas en
Plasmodium
Vías de salvataje de purinas en parásitos
Lípidos
• Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados • Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora • Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria • Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto
Metabolismo del colesterol en
Toxoplasma gondii
METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS
Generalidades
Objetivos del metabolismo energético • a) Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía • b) Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas
Esquema de Metabolismo Energético
KINETOPLASTIDOS
•
Trypanosoma brucei
como modelo: • a) Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol • b) Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes • c) Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma • d) Flujo glicolítico es relativamente alto • e) Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas
Glicólisis
• Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200.
• Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas.
Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O 2 dentro de la mitocondria • Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa.
• Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.
• Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO 2 , ALA y ASP
•
Glicólisis y glicosomas
Metabolismo energético en formas circulantes y proçíclicas de
T. brucei
Amebas Intestinales y Giardia
• Glicolisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO 2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol • Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa • Sin citocromos • Almacenan glucógeno • Toleran bajas concentraciones de oxígeno
Glucolisis
Glucolisis anaerobia
Mitosomas
- Descrito en
E. histolytica
,
G. lamblia
- El origen mitocondrial del mitosoma está apoyado por: - i) Doble membrana - ii) localización de proteínas de la maquinaria del clusters de Fe-S (ej. Ferredoxina) - iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales
Enzimas glicolíticas de
Entamoeba histolytica
Trichomonas
• Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO 2 y H 2 O • La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones • La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H + es el aceptor final de los electrones
Hidrogenosomas
• Organelos de eucariotes anaeróbicos que generan hidrógeno molecular • 1 um, doble membrana • Comparten ancestro con mitocondrias • Tricomonas, ciliados anaerobios, hongos
CO 2 Pyruvate NAD(P)H NAD(P)+ NAD(P)-FO 2Fd ME [Fe]Hyd 2Fd Malate Transit peptides N H 2 2H+ ASCT Acetyl-CoA PFO Succinate hsp70 cpn60 ADP Acetate Succinyl-CoA CoASH CO 2 Fungi and Trichomonas Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Unknown ancestry ATP STK ADP + P i Protein import AAC ATP Double membrane Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993)
Generación de ATP en Hidrogenosomas
Acidocalsomas
Organelos ácidos Almacenan calcio En varios microorganismos Primero definidos en tripanosomátidos Alta densidad electrónica Alta concentración de fosfatos, Ca++., Mg++
Apicoplastos
Organelo cloroplasto-símil -Vias biosintéticas de origen cianobacteriano -Producto de la endosimbiosis secundaria de una cianobacteria y un eucariote -En Apicomplexa -Semiautónomos, genoma propio reducido