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BMM 세포얻기
원광대학교 곽성철/이창훈
출처 : << Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes Dev. 2003 Sep>>
파골세포(osteoclast)의 분화실험은 마우스의 경골(tibia)과 대퇴골(femur)에서
골수세포(BMC:bonemarrow cell)를 얻는 것으로부터 시작합니다.
골수강 안에 있는 세포를 얻고 적혈구나 다른 세포들 제거하는 일련의 과정을 거칩니다.
BMC에 M-CSF를 처리하여 3일간 배양하면
골수세포로부터 유래한 마크로파지(BMM:bonemarrow-derived macrophage)를 얻게 됩니다.
이렇게 얻어진 BMM에 M-CSF와 RANKL을 처리하면 osteoclast로 분화하게 됩니다.
BMM 분리 전에 미리 준비를 해놓습니다.
클린벤치 안에 은박지를 깔고
가위,
핀셋,
3X HBSS가 담긴 3cm접시,
1X α-MEM가 담긴 3cm접시 2개
5주령 ICR 마우스를 밀폐상자에 넣고
CO2가스로 안락사 시킵니다.
희생된 마우스에 70%에탄올을
뿌리고 클린벤치 안에 넣습니다.
먼저 가위로 가자미근과 햄스트링
근육을 뼈에 가깝게 잘라냅니다.
핀셋으로 정강이 쪽 피부를 벗겨 냅니다.
아킬레스 건을 자르고 발목관절을
발바닥 쪽으로 꺾어 탈골시켜 발목을
분리해냅니다.
경골의 나머지 근육을 가위로
정리하고 무릎관절을 반대쪽으로
꺾어 경골을 분리해 냅니다.
대퇴골 몸체부위에 가위의 양날을 밀어 넣고
근육을 무릎 쪽으로 긁어 올립니다.
무릎 부위에서 적당한 힘을 주어 꺾으면
대퇴골의 성장판 부위가 부서지면서
분리해 낼 수 있습니다.
대퇴골 몸체부위에서 양날을
대퇴골두 쪽으로 근육과 함께 긁어 내리고
대퇴골두 부분에서 뼈를 가위로 절단해서
대퇴골을 분리해 냅니다.
분리된 다리뼈를 갈고리 핀셋으로 긁어
뼈 외에 근육이나 다른 조직을 최대한
깔끔하게 정리 합니다.
1X α-MEM을 주사기에 넣고 다리뼈
양끝의 막혀있는 골단 부위를 가위로
절단합니다.
핀셋으로 다리뼈를 단단히 잡고 주사기
바늘을 골수강 안으로 찔러 넣습니다.
주사기 내의 α-MEM을 쏘아 골수강 내의
골수 세포들을 반대편으로 나오게 합니다.
2~3차례 반복하고 반대편에서도 쏘아
최대한 많은 골수세포를 얻도록 합니다.
1600 RPM에 5분 동안 원심분리 합니다.
RBCL로 1~2분 정도 흔들어주어 골수세포에
섞여있는 적혈구를 터트립니다.
튜브 안에 있는 액체배지를 제거하고
탭핑 후 RBCL을 넣습니다.
PBS로 튜브를 채워 희석시킨 후
1600 RPM에 5분 원심분리 합니다.
액체배지를 제거하고 탭핑합니다.
10% α-MEM을 넣어줍니다.
골수 세포를 거름망에 걸러 다른
조직이나 이물질을 제거 합니다.
M-CSF 10ng/ml을 처리하고 마우스
한 마리당 10cm culture dish 1개로
나누어 1일 동안 배양 합니다.
접시에 아직 붙지 않은 세포들을
미디어와 함께 튜브에 담습니다.
접시에 붙은 세포는 버립니다.
1300 RPM에 5분 원심분리 합니다.
M-CSF 30ng/ml 처리 후 culture dish 1개당 4~5개의
10cm petri dish에 옮겨 3일간 배양합니다.
3일 동안 배양한 후 스크레퍼로 세포를 긁어
튜브에 한데 모읍니다.
저장 튜브에 원하는 셀 수만큼
계산하여 넣고 미디어 양의 10%의
DMSO를 넣어 줍니다.
세포 수를 셉니다.
isopropranol 박스에 넣고 -80°C 냉장고에
8시간 이상 보관 한 뒤 -190°C 액체질소 통에
냉동 보관합니다.
Osteoclast 분화 실험
BMM에서 파골세포로 분화하는 과정에서의
약물의 효과를 알아보는 실험입니다.
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예시)
48well 접시에 4개의 군으로 나누어 각각 3well씩
약물을 0 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM씩 넣기로 계획을
세우고 각각의 well 배치를 오른쪽 그림처럼 설계합니다.
실험에 필요한 10% α-MEM양과 BMM세포 양을
미리 계산 해놓습니다.
BMM세포를 질소탱크에서 꺼냅니다.
온수조에서 녹입니다.
저장 튜브 표면을
70% 에탄올로 닦아준 뒤
클린벤치로 가져 갑니다
튜브로 BMM을 옮겨 담습니다.
튜브에 10% α-MEM을 넣어줍니다.
살짝 흔들어줍니다.
1300RPM에서 5분 동안 원심분리 합니다.
꺼냅니다.
계산한 양만큼 α-MEM을 넣어 주고
세포가 골고루 섞일 수 있도록
피펫 에이드로 잘 풀어줍니다.
액체 배지를 제거하고 탭핑해 줍니다.
M-CSF를 30ng/ml 넣어
줍니다.
계산한 수만큼 세포를 각각의 well에 넣습니다.
현미경으로 관찰합니다.
아직 세포가 접시에 붙지 않아 동굴동굴한
모양입니다.
12시간 정도 지나면 접시에 달라붙어 길쭉한
모양으로 변합니다.
약물을 1시간 정도 전처리 후 RANKL을 넣어
파골세포로 분화시킵니다.
3일정도 배양 후부터 파골세포로
분화가 간 세포들이 관찰되기
시작합니다.
0μM
10μM
25μM
50μM
4~5일 째 세포 고정 후 TRAP 염색을 하여
약물 농도에 따른 파골세포 분화 양상을
확인할 수 있습니다.
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