Transcript 하워드곰팡이검사법
Howard Mould Count Method 하워드곰팡이계수측정법 www.HUKOBIO. com 휴코FS㈜ 서울시 서초구 서초동 1355-8 중앙빌딩 1704호 Tel)02-3473-5421/018-211-8115 Fax)02-3474-7601 E-mail) [email protected] Section I. 하워드몰드 검사방법 1.하워드몰드 계수측정 Chamber 그림1. Howard mould counting chamber 2.Chamber 세척방법 • Chamber와 cover glass는 비눗물, 암모니아수 희석액 또는 알코올에 담근 후 렌즈용 천으로 닦 아서 말린다. • 위에서 세척한 chamber와 cover glasss의 청결 한 정도는 chamber에 cover glass를 올려놓고 chamber의 양 쪽 턱(shoulder)을 누른 다음 빛 에 반사시켜 무지개색(newton’s ring)이 나타나 는지를 통해 확인한다. ※단, chamber에 teflon코팅이 되어 있는 경우 확 인할 필요가 없다. 3.시료의 준비과정 시약 -1% NaOH : ready to use -Silica gel 소포제 또는 2-octanol : ready to use -5% 안정액 : 고속 교반기에서 85℃ 물 475㎖을 넣고 25g의 팩틴을 조금씩 넣으며 용해시켜 만든다. 10,000rpm 10,000rpm + 고추가루 시료 5g + 1% NaOH 30㎖ 10,000rpm에서 5초간 혼합 Silicagel 또는 2-octanol3~4방울 을 첨가해 거품을 제거한다. 1%NaOH 70㎖로 혼합기 내벽의 부착물을 씻 어내리고 10,000rpm에서 3분간 혼합한다. 5% 안정액 25ml 약 800㎕시료를 하워드곰팡이 계수 슬라이드에 점적 하여 관 찰한다.. 4.검사 chamber의 제작 • 오른쪽의 사진과 같이 적 당한 도구를 사용하여 시 료를 chamber에 올려놓 되 마이크로 피펫을 사용 해도 무방하다. ※단, 시료를 접정할 때는 한 번에 한다. 올려놓은 시료가 모자란다고 해서 절대 더해서는 안 된다. 이 과정은 여러 차례 연습 을 통해 숙달하도록 한다. 사진1. 시료 접정법 5.Cover glass 올려놓는 방법 • 오른쪽 사진과 같이 cover glass를 장치한 다. • Cover glass를 45° 각 도에서 부터 적당한 속도로 덮도록 한다. ※너무 빠르게 덮으면 시료가 shoulder로 흘 러나오게 되고, 너무 느리면 시료가 골고루 퍼지지 않게 된다. 사진2. Cover glass 걸치법 6.검경 전 체크할 내용 • 각 필드(전체 25개 중)에서 검사할 시료는 현미경상에서 매우 적 은 양(1/250 drop)이기 때문에 정확한 데이터를 얻기 위해서는 다 음의 사항을 체크한다. a. Newton’s ring – 본 제품은 teflon 코팅이 되어있기 때문에 생략한 다. 시료의 불균등한 분포 – 이 경우 곰팡이 균사가 한 쪽으로 모여있 을 수 있다. 골(moat)과 턱(shoulder)에 시료의 유무 – 골 또는 턱에 시료가 흘러나와 있으면 cover glass가 제 위치에 자리잡을 수 없다. 공기방울 – Chamber에 공기방울이 들어가 있으면 현미경상에서 곰팡이로 오인하고, 양성판정을 내릴 수 있다. b. c. d. 위의 사항 중 하나라도 발견되면 chamber를 세척하여 다시 제작한다. 7.현미경 규격 조절 1. 2. 3. Chamber의 검경 부분의 왼편에(그림1의 경우 오른편) 두 개의 미세한 선 이 보이는데, 이것을 기준으로 현미경 시야(field)를 조절한다. field가 적절하게 조절이 되면 두 기준선과 접하게 된다. Micrometer를 장착하고 field안에 총 36개의 격자가 외접해 보이도록 조절 한다. 위와 같이 조절하면 field는 직경 1.382mm가 된다. 관찰자 X10 Micrometer를 장착한 상태 에서 본 field(녹색부분) 그림2. Stage위의 chamber 그림3. 관찰자 시점 1.382mm 8.계수측정의 패턴 • 그림4와 같이 임의의 25개 관찰할 위치를 정해두고 붉은색 화살표와 같은 패턴으로 움직여서 관찰하는데 혼란이 생기 지 않도록 한다. ※25개의 field는 규칙적으로 그리고 균사의 유무에 관계없이 선정하는 것이 필수적이다. 그림4. 계수측정 패턴 9.최종 검사 • 그림 6, 그림 7과 같이 25개의 field를 검사하고 각각 의 field에서 음성 또는 양성을 판별한다. 1 3 2 4 그림5.양성 field의 예1~5 6 7 그림6.음성 field의 예 6~7 5 10. 계산방법 • 같은 샘플을 2회에 걸쳐 검사하는 것을 원 칙으로 한다. 양 성 필 드 X 100 = 샘플당 양성비(%) 관찰한 필드(50개 필드) Section II. 곰팡이 균사체의 현미경 사진 파괴된 균사, 혹 그리고 분지된 균사의 실사 파괴된 균사 온전한 상태의 균사 – 세포벽이 평행하고, 격벽, 분지된 모습을 볼 수 있다. 분지된 상태의 균사로 세포벽이 견고하게 보인다. 또한 화살표가 가리키는 부분은 둥근 모양으로 이것은 성장하여 분지된 것을 보여준다. 균사체와 혼동할 수 있는 조직의 모습. 화살표가 가리키는 곳을 보면 끝이 풀어진 모습이고, 세포벽이 울퉁불퉁하다