Transcript 아미노산 자동분석기의 분석원리 및 응용 실례

아미노산 자동분석기의
분석원리 및 응용 실례
전북대학교 바이오 식품 소재개발 및 산업화 연구센터
2008. 5. 28
Amino Acid Analysis
1. 아미노산 분석
-
아미노산 이란?
아미노산 분석 방법 및 비교
2. 아미노산 자동 분석기
-
아미노산 자동 분석기 장점
ARACUS 소개
2
Amino Acid Analysis
아미노산 (Amino Acid)
Nonpolar & Hydrophobic
Polar & Hydrophilic
3
Amino Acid Analysis
아미노산 분석 (Amino acid analysis)
- 식품, 임상, 제약, 사료 분야 등 광범위한 분야에서 다양한 목적으로 분석
- 두 가지 형태의 아미노산 분석
1) 가수분해 아미노산 (Protein hydrolysis)
: 단백질을 구성하는 기본 아미노산 18개
2) 유리아미노산 (Physiological (free) amino acid)
: Taurine, Asparagine, Glutamine 등
- 분석 방법 : HPLC or Amino acid analyzer
4
Amino Acid Analysis
Why?
 식품 : 맛을 결정하는 요소
1) 단맛 : Glycine, Alanine, Valine, Proline, Hydroxy Proline, Histidene, Serine, Tryptophan
2) 쓴맛 : Isoleucine, Arginine
3) Flavor enhancing : Glutamic acid
 음료 : 기능성 식품
- 아미노산 함유 음료
 사료 : 영양 balance, Met/Cys
 생물학 & 제약 : Cell culture medium, 수액제재 등
 임상 : 선천성 대사이상 질환
- 페닐케톤뇨증 (Phenylketonuria), 호모시스틴뇨증 (Homocystinuria),
단풍당뇨증 (Maple syrup urine disease) 등
5
Amino Acid Analysis
Protein hydrolysis
 Must be hydrolysed to cleave the peptide bonds between amino acid
NH2
COOH
6N HCl at 110℃ for 24hrs
 Methionine & Cysteine  Methionine sulfone & Cysteric acid
- Oxidation : Must be transformed to their stable oxidized form before hydrolysis
- Destroy of Tyrosine & Histidine during oxidation steps
 Hydrolysis with methanosulfonic acid
- Pure protein or peptide
 Alkaline hydrolysis
- Tryptophan analysis (preserved for 80%)
- Destroy more amino acid
6
Amino Acid Analysis
표준분석법
 분석원리
1) 유도체화의 필요성
a) 아미노산은 single bond  UV/VIS 에 대한 absorbance 가 없음
b) Tryptophane, tyrosine, phenylalanine  자체 UV/VIS absorbance가 존재
c) 발색을 위한 유도체화 필요
UV/VIS
2) 유도체화 reagent
a) Ninhydrin
absorvance
b) OPA (ortho-phthalaldehyde)
c) PITC(phenylisothocyanate), FMOC(fluorenylmethoxycarbonyl chloride)
 컬럼 후 유도체화 (Post-column derivatiztion)
1) Cation exchange column 에서 분리된 아미노산을 검출기로 들어가기 전 유도체화
2) On-line mixing & derivatiztion
7
Amino Acid Analysis
Ninhydrin
 가장 대표적인 reagent
Column 에서 분리된 a.a
a.a 와 ninhydrin mixing
Reactor  Purple
VIS : 570 & 440nm
8
Amino Acid Analysis
HPLC vs Amino Acid Analyzer
 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
9
Amino Acid Analysis
HPLC vs Amino Acid Analyzer
 Amino Acid Analyzer
10
ARACUS
Amino Acid Analyzer
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Buffer container
Autosampler
Main system
12
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
왜?! 자동분석기를 사용하는 가?
- HPLC 를 이용한 분석 시, 어렵고 불편함
1) 분석조건 확립
a) Hydrolysis or physiological sample
b) Buffer의 농도 및 pH 조건
c) Column 의 선택 및 온도 조건
2) 재현성
3) Data 분석
13
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
1. Don’t exchange column & buffers !
다양한 아미노산을 동시에 분석
동일한 column 과 buffers 로 hydrolysis & physiological amino acid 모두 분석
- Sample에 따른 column 및 buffer 구입비용 절약
14
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
왜?! 자동분석기를 사용하는 가?
- HPLC 를 이용한 분석 시, 어렵고 불편함
1) 분석조건 확립
a) Hydrolysis or physiological sample
b) Buffer의 농도 및 pH 조건
c) Column 의 선택 및 온도 조건
2) 재현성
3) Data 분석
15
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
2. Pre-designed program for amino acid analysis
1) Amino acid analysis에 최적화된 program 내장 : iControl
2) Sample 특성에 따라 손쉽게 변경가능
16
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
17
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
왜?! 자동분석기를 사용하는 가?
- HPLC 를 이용한 분석 시, 어렵고 불편함
1) 분석조건 확립
a) Hydrolysis or physiological sample
b) Buffer의 농도 및 pH 조건
c) Column 의 선택 및 온도 조건
2) 재현성
3) Data 분석
18
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Ready-to-use reagent kit !
1) 세분화된 5종류의 buffer system (Li-base)
2) 정확한 test 후 사용자에게 제공
3) 우수한 재현성 보장
 8회 반복 실험결과
19
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
• 왜?! 자동분석기를 사용하는 가?
- HPLC 를 이용한 분석 시, 어렵고 불편함
1) 분석조건 확립
a) Hydrolysis or physiological sample
b) Buffer의 농도 및 pH 조건
c) Column 의 선택 및 온도 조건
2) 재현성
3) Data 분석
20
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Data data acquisition and analysis software
1) 여러 개의 분석 결과를 compiler program 이용 하여 비교 가능
2) 각각의 분석 결과를 개개의 report 로 documentation
21
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
ARCUS system 분석개요
22
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
ARACUS 의 각 부분별 특징
1. Autosampler
1) Samples
 2 x 54 vials (1.5ml) or 2 x 96 well plate
 최대 4 x54 vials or 4 x 96 well plate (Option)
2) Temperature : 8℃
3) “Cybergear” technique : X-Y-Z robot (patented)
 1 ㎕ 의 volume도 sample loss 없이 injection
4) 1~40 ㎕ in 1 ㎕ step programable
5) Extremely high reproducibility
6) Manual injection 가능
23
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
ARACUS 의 각 부분별 특징
2. Pump
1) Dual piston pump
2) Pump head : PEEK
3) Max. pressure : 400 bar
4) Flow rate : 0.01 ~ 9.9 ml/min
5) Reproducibility of flow rate : 0.1% (RSD) at 100 ㎕/min
3. Column unit
1) Cation exchange resin : 3 ㎛
2) Stainless steel or PEEK
3) Temperature control : Peltier element
4) Temperature range : 20 ~ 100 ℃
5) Temperature accuracy : 0.1℃
24
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
ARACUS 의 각 부분별 특징
4. Reactor
1) Temperature control : Peltier element
2) Temperature range : 50 ~ 150℃
3) Auto-shut-down, failure alarm
5. Micro-Photometer
1) Ninhydrin detection : 570 & 440 nm
2) Maintenance free
6. Software
1) System control & analysis : iControl
2) Data acquisition & handling : iPeak
25
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Physiological Standard
26
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Hydrolysate Standard
27
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Green tea - Theanine
28
600
500
700
10
26.087' Glu
20
30
40
44.859' Cys
46.790' Met
48.516' Ile
50.128' Leu
51.975' Nle
53.581' Tyr
400
50
29
300
60
70
80
90
102.143' Arg
94.439' NH4
96.352' EOHNH2
72.468' His
57.842' Phe
800
41.886' Val
900
92.585' Lys
34.527' Gly
35.938' Ala
20.945' Thr
22.516' Ser
1000
15.965' Asp
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Shrimp meat
1200
mV
1100
200
100
min
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Fish feed
mV
840
Lys
780
720
660
Met
Nle
600
540
NH4
480
Arg
g-ABA
Glu
Gly
Ala
Val
300
Tau
360
Thr
MetSON
420
240
9
18
27
36
45
30
54
63
72
81
90 min
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
Tomato juice
1100
NH3
Glu
mV
1000
800
g-ABA
Asp
900
700
600
500
AsN
400
Arg
Lys
Trp
Orn
His
Phe
Tyr
Gly
Met
Ile
Leu
0
P-Ser
Tau
Urea
100
Thr
Ser
200
Val
Ala
300
-100
9
18
27
36
45
54
31
63
72
81
90
min
ARACUS
- Amino Acid Analyzer (아미노산 자동 분석기)
아미노산 분석의 Total Solution !
ARACUS
32