Transcript II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

II - Visualiser les
molécules dans les cellules
vivantes
Généralités
• Techniques de microscopie
optiques (les moins
traumatisantes)
• Marquage fluorescent des
molécules à suivre
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Concentrations ioniques
• Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-,
Ca++) mais pas rapide
• Indicateurs sensibles aux ions
– luminescents (aequorine de la
méduse)
– fluorescents
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Autres indicateurs
fluorescents
• Autres ions
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Injection intra-cytoplasmique
de molécules marqueur
• Anticorps
• Protéine cellulaire purifiée marquée
• Exemple tubuline
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Fig 18-21
tubuline
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Fig 16-12
tubuline
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Injection intra-cytoplasmique
de molécules pour bloquer une
fonction
• Anticorps anti myosine-II dans un œuf
d'oursin bloque la division sans bloquer la
mitose
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Quatre méthodes d'introduction
de molécules dans la cellule
• Microinjection
• Électroporation
• Vésiculation
• Projection à haute vitesse…
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Fig 9-40 (AB)
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Fig 9-40 (CD)
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Molécules captives
• Synthèse d'une forme inactive de
la molécule
• Introduction dans la cellule
• Activation à un temps et moment
donné par un faisceau lumineux
• eg : molécules captives pour Ca++,
AMPc, GTP, IP3
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Fig 9-41 Caged molecules
• La molécule X devient active après le
flash d'UV
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Application
• Molécules fluorescentes piégées
• Grosse modification de la molécule
qui doit rester active  grosse
difficulté 
• Tâtonnement pour créer de
nouvelles molécules
• eg : tubuline
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Avant UV
Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique
Après 1,5 mn
Après 2,5 mn
Fig 9-42 Caged tubuline
fluorescéine
• Tubuline rhodamine (rouge)
• Dapi ADN (bleu)
• Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et
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invisible avant le rayon d'UV)
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Desai,A1998
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Green Fluorescence
Protein
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Fig 9-43 GFP
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GFP 3D
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GFP
GFP Topol
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GFP mice
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GFP
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III - Culture cellulaire
• Isolement
• Séparation (FACS)
• Culture primaire et secondaire
• Milieu de culture
• Lignée cellulaire
• Transformation
• Congélation
• Clone
• Hybride
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Facs
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Hybride cellulaire
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Production AC
monoclonaux
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Culture SEM
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Immuno gold en ME
ME Immuno-gold
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Pistage de molécules dans
la cellule
• Pulse-chase
• Patch-Clamp
• Molécules « piégées »
• Les anticorps
– immunofluorescence directe
– immunofluorescence indirecte
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Fig 9-46
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Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas
Fig 9-47
Après 10 mn de chasse
Après 45 mn de chasse
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Fig 9-48
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IV - Fractionnement des
cellules et analyse des
molécules
• Techniques biochimiques
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