Transcript Virológica y Diagnostico Influenza A H1/N1 SALUD

SALUD
Virológica y Diagnostico Influenza A
H1/N1
Objetivo
SALUD
• Describir las características generales del
Virus de Influenza A H1/N1
• Describir los Criterios Diagnósticos del
virus A H1/N1y uso de las herramientas de
Laboratorio
Influenza
LA INFLUENZA ES PRODUCIDA POR UN VIRUS DE LA FAMILIA
ORTOMIXOVIRIDAE (ortomixovirus)
●
ESFÉRICO-PLEOMÓRFICO
●
DIAMETRO DE 80 A 120 nm
●
RNA DE CADENA SENCILLA, SEGMENTADO Y SENTIDO
NEGATIVO
●
COMPUESTO POR PROTEÍNAS ESTRUCTURALES
●
PROTEÍNAS DE SUPERFICIE: HEMAGLUTININA Y
NEURAMINIDASA
SALUD
SALUD
SALUD
SALUD
Influenza A
Influenza B
Influenza
SALUD C
Estructura
genética
8 segmentos
genéticos
10 proteínas
virales
8 segmentos
genéticos
11 proteínas
virales (NB única)
7 segmentos
genéticos
9 proteínas virales
(HEF única)
Huésped que
infecta y datos de
variación
antigénica
Humanos, cerdo,
equinos, aves,
mamíferos marinos
Hace cambios de
“shift” y de “drift”
Solo humanos
Humanos y cerdos
Solo hace “drift”,
Solo hace “drift”
puede circular más Múltiples variantes
de una variante
Datos Clínicos y
epidemiológicos
Epidemias y
pandemias
Animales y
humanos y en
todas las edades
Enfermedad grave Enfermedad leve,
en adultos
esporádica sin
mayores o
estacionalidad
personas en riesgo
No se ha
presentado en
pandemias
Subtipos:
Hemaglutinina = H1, H2,
H3
Neuraminidasa = N1, N2
Nomenclatura de los virus de la Influenza
SALUD
A/Singapore/6/86
Virus tipo A
Tipo de virus
Sitio de aislamiento
H1N1*
Codigo del Lab/número
del cultivo
Año de aislamiento
HA subtipo
NA subtipo
* subtipos para el virus A solamente
TIEMPO DE APARICION
SALUD
VIRUS DE INFLUENZA A EN HUMANOS
Influenza
AVIAR
H9
H5
FLU Hong
Kong
Influenza
ESPAÑOLA
FLU
ASIATICA
H2
H1N1
1918
H1 SOIV
H3
H1
1957 1968 1977
(A/WS/1933)
H7
H5
1997
2005 2009
12/3/09
14/3/09
16/3/09
18/3/09
20/3/09
22/3/09
24/3/09
26/3/09
28/3/09
30/3/09
01/4/09
03/4/09
05/4/09
07/4/09
09/4/09
11/4/09
13/4/09
15/4/09
17/4/09
19/4/09
21/4/09
23/4/09
25/4/09
27/4/09
29/4/09
01/5/09
03/5/09
05/5/09
07/5/09
09/5/09
11/5/09
13/5/09
15/5/09
17/5/09
19/5/09
21/5/09
23/5/09
25/5/09
27/5/09
29/5/09
31/5/09
02/6/09
04/6/09
06/6/09
08/6/09
10/6/09
12/6/09
14/6/09
16/6/09
18/6/09
20/6/09
22/6/09
24/6/09
26/6/09
28/6/09
30/6/09
02/7/09
04/7/09
06/7/09
08/7/09
10/7/09
12/7/09
14/7/09
16/7/09
18/7/09
20/7/09
22/7/09
24/7/09
26/7/09
28/7/09
30/7/09
01/8/09
03/8/09
05/8/09
07/8/09
09/8/09
11/8/09
13/8/09
15/8/09
17/8/09
19/8/09
21/8/09
23/8/09
25/8/09
27/8/09
29/8/09
31/8/09
02/9/09
04/9/09
06/9/09
08/9/09
10/9/09
12/9/09
800
600
Defunciones
Curva epidémica
Casos sospechosos
Casos influenza estacional
Fuentes: Base de datos InDRE y CONAMED.
SALUD
Evolución de los casos y defunciones confirmadas por influenza A(H1N1)
(según fecha de inicio de síntomas de los pacientes)
1400
1200
1000
400
200
0
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Fecha de inicio de síntomas
Casos AH1N1
Defunciones AH1N1
Todo el país
Total de casos confirmados: 24,686
SALUD
Diagnóstico de influenza
Dr. Jorge Duque Rodríguez
SALUD
● ¿Cómo hacemos el diagnóstico de este virus
antes
y en la pandemia actual?
● ¿Qué utilidad tienen las pruebas rápidas?
● En que consiste la prueba de PCR en tiempo real
● ¿ Para que se requiere el diagnóstico?
● ¿A quién muestrear?
● ¿Como se toman y transportan las muestras?
● Conclusiones
SALUD
ESTRUCTURA DE LOS VIRUS DE
INFLUENZA
Proteína
M2
RNA viral
Neuraminidasa(NA)
9 diferentes
Hemaglutinina
(HA) 16 diferentes
Membrana
lipidica
SALUD
Duración de excreción viral como base de la
muestra para el diagnóstico:
●
●
●
●
●
●
●
●
La duración de excreción viral es desconocida
Los datos actuales son respecto de Influenza estacional
El diagnóstico debe ser para Influenza
La mayor excreción viral constante y accesible para detección, es en vía
respiratoria superior
El virus se ha demostrado que se excreta en heces, orina y otras
secreciones
La técnica estándar de diagnóstico es en secreciones de vía respiratoria
Se asume que las personas infectadas pueden ser potencialmente
infectantes mientrás dura la fiebre o hasta 7 días de la enfermedad
Se asume que niños pequeños y los inmunocomprometidos pueden
excretar por más días.
Toma de la muestra
SALUD
Tipo de muestra
Método
Medio/contenedor/ forma
de envío
Nasofaríngeo o
Faríngeo
Hisopo: usar sólo hisopo
estéril de dacrón o rayón
con mango de plástico
Tubos estériles con 2.5 ml de medio
de transporte viral.
Usando triple embalaje
Enviar con refrigerantes de 4 a 8°C
Durante la fase inicial de la
enfermedad (primeros 4 días de
iniciado los síntomas).
Inmunofluorescencia
Cultivo viral
RT-PCR
La muestra debe ser
tomada sólo por un
médico o una persona
experimentada en el
proceso (Hospital).
Tubos estériles en 3 ml de medio de
transporte viral.
Usando triple embalaje
Enviar con refrigerantes de 4 a 8°C
Cuando sea clínicamente
apropiado en paciente
intubado, con enfermedad
pulmonar severa. (primeros 4
días de iniciado los síntomas).
Inmunofluorescencia
Cultivo viral
RT-PCR
Conjuntiva
Hisopo: usar sólo hisopo
de dacrón o rayón con
mango plástico.
Viales estériles en 2.5 ml de medio
de transporte viral.
Usando triple embalaje
Enviar con refrigerantes de 4 a 8°C
En caso de conjuntivitis, tan
rápido como sea posible en el
curso de la enfermedad.
(primeros 4 días de iniciado los
síntomas).
Inmunofluorescencia
Cultivo viral
RT-PCR
Suero
Por venopunción, en
tubos sin anticoagulante
>1ml
Enviar con refrigerantes de 4 a 8°C
Fase aguda: tan rápido como
sea posible (hasta 7 días)
Detección de anticuerpos
totales por inhibición de la
hemaglutinación
Pulmón
Contenedor estéril con medio de
transporte viral.
Usando triple embalaje
•Fresco, congelado a -70°C
(primeros 4 días de iniciado los
síntomas).
Inmunofluorescencia.
Cultivo viral
RT-PCR
Lavado
bronquioalveolar
Tejido (autopsia)
Tiempo
Técnica
diagnóstico de influenza
SALUD
La batería de métodos para diagnóstico de
influenza por laboratorio se puede agrupar :
Detección directa del virus, material genético o
moléculas virales
Detección de anticuerpos en contra del virus
Consideraciones para uso de método diagóstico
1. Sensibilidad
2. Especificidad
3. Tiempo de obtención de resultados
4. Disponibilidad de la prueba en los laboratorios
5. Facilidad de realización
6. Costos asociados con la misma.
A quién tomar
muestra?
SALUD
Enfermedad tipo influenza (ETI): Persona de cualquier edad que presente o
refiera haber tenido fiebre mayor o igual a 38°C, tos, y cefalea, acompañadas de
uno o más de los siguientes signos o síntomas: rinorrea, coriza, artralgias,
mialgias, postración, odinofagia, dolor torácico, dolor abdominal, congestión nasal,
diarrea. En menores de cinco años de edad, se considera como un signo cardinal
la irritabilidad, en sustitución de la cefalea. En mayores de 65 años, no se requerirá
la fiebre como síntoma cardinal.
Infección respiratoria aguda grave (IRAG): Persona de cualquier edad que
presente dificultad al respirar, acompañada de fiebre mayor o igual a 38°C y tos,
con uno o más de los siguientes síntomas: ataque al estado general, dolor torácico,
polipnea,
Defunción Síndrome de Insuficiencia Respiratoria Aguda (SIRA)
Defunción por neumonía grave con sospecha de influenza: toda defunción por
infección respiratoria aguda grave según se define en el párrafo anterior.
(Cultivo celular)
AyB
Tabla I. Métodos de diagnóstico
Detección de ácidos
nucleicos (RT-PCR)
Método
Aislamiento viral
(Cultivo celular)
Inmunofluorescencia
Detección de ácidos
nucleicos (RT-PCR)
Pruebas rápidas
Serología
Inmunofluorescencia
(HAI, MN, fijación de
complemento)
A, B, y C
Tipo de
Influenza
que detecta
oro. Es vital para
vigilancia virológica y
formulación de vacunas
la muestra. Los
resultados no están
disponibles en tiempos
clínicamente relevantes
Altamente sensible y
Puede no identificar
específico,
rápido.
Permite
nuevas cepas
de Influenza por laboratorio
tipificar y subtipificar.
circulantes o
Puede detectar virus que
pandémicas
no se aíslan en cultivo, y
Desventajas
múltiplesVentajas
virus
respiratorios
AyB
AyB
Específico.
Resultados el
Sensible y específico.
mismo
día. Una otros
misma
Puede detectar
virus
muestra
puede
evaluarse
respiratorios. Estándar de
para
múltiples
patógenos.
oro. Es
vital para
Se
puede virológica
realizar a ypartir
vigilancia
de
cultivo
o
formulación directamente
de vacunas
de la muestra clínica
Relativamente
complejo.
Técnicamente muy
Requiere
laborioso.personal
Depende del
experimentado.
transporte y calidad de
Depende
enLos
gran
la muestra.
medida
de no
la calidad
resultados
están de
la
muestra
disponibles en tiempos
clínicamente relevantes
A, B, y C
Altamente sensible y
Específico.
Simple Permite
y
específico, rápido.
rápido.
tipificar Permite
y subtipificar.
tratamiento
efectivo
Puede detectar
virusyque
quimioprofilaxis.
Los y
no se aíslan en cultivo,
resultados
positivos son
múltiples virus
útiles
en
vigilancia
de
respiratorios
influenza estacional
Puede no identificar
Sensibilidad
nuevas cepasy VPP
bajos.
Los resultados
circulantes
o
negativos
requieren
pandémicas
confirmación. No hay
manera de monitorear la
calidad de muestra
Específico. Resultados el
mismo
día. Una misma
Puede detectar
muestra
puede
infecciones
queevaluarse
resultaron
para
múltiples
patógenos.
negativas al aislamiento.
Se
realizar
a partir
Muypuede
útil como
herramienta
de
cultivo
o directamente
para
investigación
y
de
la
muestra
clínica
vigilancia epidemiológica
Relativamente complejo.
Requiere
personal
Sensibilidad
y
experimentado.
especificidad variables.
Depende
en meramente
gran
Diagnóstico
medida
de la calidad
de
retrospectivo.
Requiere
la
muestrapareadas.
muestras
Limitada utilidad clínica
A y/o B
AyB
A, B y C
(3-14)
días
$$
SALUD
<1 día
$$$$
Tiempo
Costo
relativo
~5
(3-14)
~4días
horas
<1 día
30 a 60
minutos
~4 horas
2a4
semanas
$$
$
$$$$
$$ - $$$
$
$
SALUD
Tabla I. Métodos de diagnóstico de Influenza por laboratorio
Método
Aislamiento viral
(Cultivo celular)
Detección de ácidos
nucleicos (RT-PCR)
Inmunofluorescencia
Tipo de
Influenza
que detecta
Ventajas
AyB
Sensible y específico.
Puede detectar otros virus
respiratorios. Estándar de
oro. Es vital para
vigilancia virológica y
formulación de vacunas
Técnicamente muy
laborioso. Depende del
transporte y calidad de
la muestra. Los
resultados no están
disponibles en tiempos
clínicamente relevantes
A, B, y C
Altamente sensible y
específico, rápido. Permite
tipificar y subtipificar.
Puede detectar virus que
no se aíslan en cultivo, y
múltiples virus
respiratorios
Puede no identificar
nuevas cepas
circulantes o
pandémicas
Específico. Resultados el
mismo día. Una misma
muestra puede evaluarse
para múltiples patógenos.
Se puede realizar a partir
de cultivo o directamente
de la muestra clínica
Relativamente complejo.
Requiere personal
experimentado.
Depende en gran
medida de la calidad de
la muestra
AyB
Desventajas
Tiempo
Costo
relativo
~5
(3-14)
días
$$
<1 día
$$$$
~4 horas
$
SALUD
Tabla I. Métodos de diagnóstico de Influenza por laboratorio
Método
Aislamiento viral
Serología
(Cultivo celular)
(HAI, MN, fijación de
complemento)
Detección de ácidos
nucleicos (RT-PCR)
Microscopía
electrónica
(Tinción negativa)
Inmunofluorescencia
Tipo de
Influenza
que detecta
AyB
A, B y C
A, B, y C
A, B y C
AyB
Ventajas
Desventajas
Tiempo
Costo
relativo
~5
(3-14)
a4
2días
semanas
$$
$
Sensible
y específico.
detectar
Puede
Puede detectar
otros virus
que resultaron
infecciones
respiratorios.
Estándar de
al aislamiento.
negativas
oro.
Es
vital
para
Muy útil como herramienta
vigilancia
virológicay y
investigación
para
formulación
de vacunas
epidemiológica
vigilancia
Técnicamente
y muy
Sensibilidad
laborioso. Depende
del
variables.
especificidad
transporte y meramente
calidad de
Diagnóstico
la
muestra.
Los
retrospectivo. Requiere
resultadospareadas.
no están
muestras
disponibles
en tiempos
clínica
utilidad
Limitada
clínicamente relevantes
Altamente
y de
situaciones
ensensible
Rapidez
específico, rápido.
Permite
Sólo se
emergencia.
tipificar
y
subtipificar.
requiere una muestra y se
Puedetomar
detectar
virus que
directamente
puede
no paciente.
se aíslan en
puede y
Se cultivo,
del
múltiples
virus
relacionar con la
respiratorioscuando se
enfermedad
conoce el origen de la
Específico. Resultados el
muestra
mismo día. Una misma
muestra puede evaluarse
para múltiples patógenos.
Se puede realizar a partir
de cultivo o directamente
de la muestra clínica
Puede
no identificar
entre los
discrimina
No
nuevas cepas
tipos.
diferentes
circulantes
o
muy
Requiere personal
pandémicas
<1 día
experimentado.
Requiere fuerte inversión
~ 1 hora
inicial en equipo e
infraestructura
Relativamente complejo.
Requiere personal
experimentado.
Depende en gran
medida de la calidad de
la muestra
~4 horas
$$$$
$
$
SALUD
Inmunofluorescencia :
1. Solo define INF A o B
2. Sensibilidad de 70-100% (80%), especificidad entre 80 y 100%
3. Técnica de opción cuando se requieren resultados relativamente
rápidos
4. Aprobada por la OMS
Epidemia actual en México:
En un universo de 6,503 muestras provenientes de todo el país,
Sensibilidad de 31.2%
Especificidad de 98.5%.
IFI no tiene la suficiente sensibilidad como prueba tamiz para la
vigilancia del S-OIV de la epidemia en México (manuscrito en
preparación).
VPP = 89.3%, VPN = 77.9%
Pruebas rápidas
SALUD
● Tienen la ventaja de no requerir instalaciones de laboratorio BSL-2
●
●
●
●
●
●
ni BSL-3 y se usan en consultorio.
Solo detectan INF A y B y no detectan diferencia entre los subtipos
humanos (H1N1 y H3N2) o sub-especies aviares (H5N1, H7N1,
etc.).
No discrimina entre Inf A y el nuevo virus S-OIV
La sensibilidad para este tipo de pruebas está en el rango entre 40 80%, y depende básicamente del tipo de muestra analizada y del
tipo de paciente de quien derivan.
La sensibilidad en pacientes adultos es más baja que las reportadas
en niños y jóvenes.
La mayoría de las pruebas rápidas para la detección de virus de
influenza B tienen una sensibilidad más baja que aquellas que
detectan virus de influenza A
Las especificidades reportadas varían entre el 85 y el 100%
Pruebas rápidas
SALUD
● CDC realizó una evaluación preliminar de múltiples pruebas rápidas vs PCR
Tiempo real: Los resultados mostraron que, aunque las pruebas rápidas
pudieron detectar INFA correspondiente al virus S-OIV 2009 a partir de
muestras respiratorias con mas altos niveles de virus
● La sensibilidad para S-OIV = 51% (IC 35-67%)
AH1 estacional = 65% (IC 39-82%)
AH3 estacional = 31% (IC 14-37%)
Especificidad de 99%
• Otros estudios entre 10-51%
● La prueba Quidel QuickVue (Quidel Corp., San Diego, CA.) utilizada durante la
epidemia en México solo presentó una sensibilidad de 34.0% y una
especificidad de 97.6%, con VPP y VPN de 75.6% y 86.2% respectivamente,
cuando se comparó contra rRT-PCR en el InDRE (manuscrito en preparación)
SALUD
RED DE LABORATORIOS ANALIZANDO
MUESTRAS DIAGNOSTICO INFLUENZA, A
H1N1/swl
Protocolo de CDC para RT-PCR en tiempo real de la influenza A (H1N1)swl
28 de abril de 2009
Revisión 1 (30 de abril de 2009)
El Centro Colaborador de la Organización Mundial
de la Salud (OMS) para la influenza en los CDC de
Atlanta, EUA, ha puesto a disposición el protocolo
adjunto para la realización de la prueba RT-PCR
en tiempo real para la influenza A (H1N1)/Swl
Diagrama de flujo establecido para
detección
y
SALUD
caracterización de Influenza S-OIV
Recepción de Muestras
1 h por cada 150 muestras
Tratamiento e inactivación
de muestras
Preparación de
reactivos
Extracción RNA
Montaje de placas
Instrumentación
rRT-PCR
Interpretación
1:20 h x cada 30 muestras
1:00 a 1:15 h x cada 44 muestras
2:30 h x máquina por corrida x c/22 muestras
15 a 30 minutos interpretación x
máquina x ciclo
Total 5.5 horas para una
muestra
Unión de la sonda de hidrólisis
SALUD
SALUD
PANEL ESPECÍFICO VIRUS SWINE
MARCADOR
FUNCION
GENE
InfA
Pan A
Seg 7-Matrix (M)
SW InfA
Universal Swine
Seg 5Nucleocapside
SW H1
Específico H1
Swine
Seg 4Hemaglutinina
RP
RNA humano
RNAsa P
PANEL EXTENDIDO
MARCADOR
FUNCION
GENE
InfB
Pan B
Seg 7-Matrix (M)
H1
Human H1
Seg 4Hemaglutinina
H3
Human H3
Seg 4Hemaglutinina
Iniciadores y
sondas para cada
segmento: doble
control de
identificación
SALUD
RESULTADOS
Influenza A H1/Swl
INF-A humana
NEG
SALUD
INTERPRETACION
InfA
+
+
+
+
-
Marcadores
SwInfA Sw-H1
+
+
-
+
+
-
Resultado
RP
humana
+
InfA H1/Swl
+
+
+
InfA H1/Swl
InfA H1/Swl
InfA
+
-
Negativo
Repetir
Como trabaja la nueva red de
diagnóstico
Sistema de Vigilancia Sentinela-SISVEFLU
Va de local-regional- InDRE
Preparación de reactivos
Un área de apertura de muestras,
alícuotas e inactivación (BSL2, con prácticas BSL3
Extracción RNA
Área exclusiva para master mix
Instrumentacion
rRT-PCR
Lectura de
resultados
Logística informática para todo el
proceso, emisión de resultados,
análisis de resultado y reporte
SALUD
ALGORITMO
PROPUESTO
LESP CON rRT-PCR ,
IFI (26 ESTADOS)
DIAGNÓSTICO DE INFLUENZA Y OTROS VIRUS RESPIRATORIOS
SALUD
Recepción de la Muestra en el
LESP (C.S., Hospitales)
INSTRUMENTACION RT- PCR TIEMPO REAL:
Marcadores
Result
a)
Inf A
Univ Sw
H1-Sw
RP hum
Tratamiento de la muestra (2 alicuotas)
+
-
-
+
Inf A
+
-
+
+
A S-OIV
+
+
-
+
A S-OIV
+
+
+
+
A S-OIV
-
-
-
+
Negativo
-
-
-
-
N/A
1
Extracción de RNA
(Kit Qiagen o Roche)
Negativo
Negativo
* Si existe duda en algún resultado se repite la prueba, un resultado
similar en la repetición se reporta como NA (No Adecuada)
Influenza B
PCR en Punto Final (c)
Instrumentación
rRT-PCR (a)
INSTRUMENTACION RT- PCR PUNTO FINAL:
Marcadores A Subtipo
b)
Marcador
Resultado
Inf AH1
Inf AH3
+
-
Inf AH1
-
+
Inf AH3
-
-
A N/S
Inf B
c)
Influenza A S-OIV
+
Inf B
-
Negativo
NOTAS:
• Si se llega a rebasar la capacidad instalada el InDRE
podrá hacer los cambios pertinentes para la selección de las muestras.
• Estándar del servicio para entrega de resultados en el estado 24 a 48 horas.
• Envío de muestras al InDRE o al LESP regional para aislamiento una vez
identificado debe ser de 5 días hábiles .
• Se requieren 3 personas
• Capacidad instalada para 20-30 muestras diarias (jornada de 8 horas).
1
Influenza A (Estacional)
Notificación inmediata
al Plataforma de Reporte SINAVE
A N/S: Influenza A no subtipificada
Diagnóstico Diferencial otros virus
respiratorio (IFI), casos graves,
defunciones o
inmunocomprometidos
Resultado
Captura de resultados LESP o Instituto
Impresión de resultados
Subtipificación
Punto Final (H1 y H3) (b)
Influenza AH1
o Influenza AH3
Entrega de resultados
Enviar al InDRE o al Laboratorio Regional correspondiente:
El 100 % de las muestras con resultado positivo por rRT-PCR para aislamiento viral (muestras de pacientes graves,
Inmunocomprometidos y defunciones)
Enviar al InDRE 100% de las muestras influenza tipo A No S-OIV y que no se pudieron subtipificar.
Las muestras de los casos graves y defunciones que resulten negativas al panel de Influenza se enviarán para
diagnóstico del agente viral en el InDRE
Influenza A N/S
Enviar InDRE
CONCLUSIONES
SALUD
Pandemia (H1N1) S-OIV
● Antigenicidad similar, mutaciones puntuales no
●
●
●
●
significativas (hasta ahora)
No se reconoce evidencia de marcadores de
virulencia
Casi todos sensibles a inhibidores de nauraminidasa
(oseltamivir y zanamivir)
Casos recientes aislados de resistencia a
oseltamimivir
Inevitable la variación genética del virus, no podemos
predecir si eso resulta en más virulencia o más
resistencia