Transcript Modifide Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 in rice

การพ ัฒนาวิธห
ี า Aflatoxin B1 ในข้าวด้วยการใช ้
Direct Competitive Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay
Modifide Direct Competitive
Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay for
Aflatoxin B1 in rice
ผู ้ร่วมจัดทำ
น.ส. นัดติยำ ประกอบแสง
D4810056
ั
น.ส. รัตนำ เกียรติทรงชย
m4810131
วัตถุประสงค์
 เพือ
่ ตรวจสอบและหำปริมำณของ alflatoxin B1 ในข ้ำว
้
กำรนำไปใชประโยชน์
 เพือ
่ ตรวจหำระดับของ alflatoxin B1 ทีป
่ นเปื้ อนอยูใ่ น
ื่ มโยงไปถึงกำรปนเปื้ อนในนำ
ข ้ำว นอกจำกนั น
้ ยังเชอ
ข ้ำวและพืน
้ ทีใ่ กล ้เคียง
หลักกำร
 ประยุกต์จำกวิธท
ี ดสอบของ Chu (1989) ในกำร
ทดลองของเรำจะ coat แต่ละ well ของ microtiter
plate ด ้วย aflatoxin B1-oxime-BSA และ incubate
ไว ้ หลังจำกล ้ำงก็จะเติม ตัวอย่ำงข ้ำวทีต
่ ้องกำร
ทดสอบหรือ aflatoxin B1 มำตรฐำน กับ antiaflatoxin B1- BSA- HRP conjugate ลงไปพร ้อมๆ
กัน แล ้ว incubate ต่อ สำรพิษทีอ
่ ยูใ่ นสำรละลำยข ้ำว
หรือใน aflatoxin B1 มำตรฐำน จะแย่งจับกับ antigen
ทีต
่ ด
ิ อยูก
่ บ
ั ผิวของ microtiter plate
และจะจับตรงบริเวณที่ antibody จะมำจับ หลังจำก
ล ้ำงอีกรอบ ก็จะตรวจสอบปริมำณของ antibody ทีจ
่ ับ
อยูบ
่ นผิวของ microtiter plate ได ้โดย incubate กับ
ี ำกกำรทำปฏิกริ ย
สำรละลำย substrate ผลของสจ
ิ ำจะ
้ อ
วัดโดยใชเครื
่ ง spectrophotometer ปริมำณของ
aflatoxin B1 ในตัวอย่ำงข ้ำวจะหำได ้โดยกำรเทียบกับ
กรำฟของ aflatoxin B1 มำตรฐำน
บทนำ
ื้ รำ
 Aflatoxin : สำรพิษสร ้ำงจำกเชอ
พวก Aspergillus flavus สำรพิษตัวนี้
จะทำลำยเซลล์ตบ
ั อย่ำงรุนแรง และ
ยังเป็ นสำรก่อมะเร็งทีร่ น
ุ แรงมำกอีก
ด ้วย
ื้ รำพวก Aspergillus flavus
• เชอ
ื้ ตำ่ เชน
่
มักจะเจริญได ้ในทีท
่ ม
ี่ ค
ี วำมชน
ในเมล็ดธัญพืชทัง้ ถั่ว ข ้ำว เป็ นต ้น
วิธก
ี ารเตรียมสารเคมี
้
 ใชสำรเคมี
ระดับ AR grade
 สำรละลำยสกัดตัวอย่ำง (Sample extraction solvent )
 Carbonate coating buffer
 Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 เข ้มข ้น 10
เท่ำ
 PBS-Tween
 Conjugate buffer
 Substrate buffer
 Enzyme Substrate
 Aflatoxin B1-BSA เข ้มข ้น 500 เท่ำ
 Anti-Aflatoxin (B1) Peroxidase conjugate
 Blocking 1%
 Colour stop reagent 0.5 N
รูปแสดง ข้าวกะเทาะเปลือก ข ัดขาว
บดละเอียด
วิธท
ี าการทดลอง
 coat plate ด ้วย Aflatoxin B1-BSA (sigma A6655)
100 ไมโครลิตร ต่อ well จะมีปริมำณ 2 ไมโครกรัม
ต่อมิลลิลต
ิ ร
 Incubate ใน moist chamber ที่ 4°C ข ้ำมคืน
 ล ้ำงด ้วย PBS-T 3 ครัง้
 block ด ้วย BSA 1% 200 ไมโครลิตรต่อ well ที่
37°C เป็ นเวลำ 1 ชวั่ โมง
 ล ้ำงด ้วย PBS-T 3 ครัง้
 เติมสำรละลำยตัวอย่ำง 50 ไมโครลิตรต่อ well แล ้ว
ตำมด ้วย Anti-AFB1- peroxidase conjugate 50
ไมโครลิตรต่อ well
 Incubate ใน moist chamber ที่ 37°C 45 นำที
 ล ้ำงด ้วย PBS-T 3 ครัง้
 เติม Enzyme Substrate 100 ไมโครลิตรต่อ well
 Incubate ในทีม
่ ด
ื 10-15 นำที
 หยุดปฏิกริ ย
ิ ำด ้วย Colour stop reagent 25
ไมโครลิตรต่อ well
 อ่ำนค่ำกำรดูดกลืนแสงที่ 492 นำโนเมตร
ผลการทดลอง
ตารางที่ 1 แสดงค่าการดูดกลืนแสงของ standard aflatoxin B1
ความเข้มข้น(ug/kg)
ค่าการดูดกลืนแสงที่ 492 nm
7.5
0.215
15
0.218
30
0.220
60
0.212
120
0.213
240
0.215
480
0.196
960
0.207
1920
0.189
3840
0.137
7610
0.103
ตารางที่ 2 แสดงค่าการดูดแสงของต ัวอย่างข้าวทงั้ 17 ต ัวอย่าง
ต ัวอย่างข้าว
ค่าการดูดกลืนแสงที่ 492 nm
1 ทองมา
0.387
2 นางเอียด
0.406
3 สมยศ
0.376
4 นางบุญเรือน
0.382
5 ประเสริฐ เคมี
0.402
5 ประเสริฐ อินทรีย ์
0.380
6 ราพ ัก
0.359
7 ก ัญญา
0.415
8 นายเรียบ
0.384
9 นายทอง
0.368
10 นางทอน
0.374
11 นายสนอง
0.370
12 ฮวด
0.348
13 ชวน
0.361
14 คามี
0.369
15 นายนุ
0.347
16 นายมะลิ
0.361
ี ากการทดสอบ standard aflatoxin ใน microtiter 96 well
 รูปที่ 2 แสดงสจ
plate
สรุปผลการทดลอง
 ไม่พบ aflatoxin ในปริมำณทีเ่ กินกำหนด จำกตัวอย่ำง
ข ้ำวทัง้ 17 ชนิด
เอกสารอ้างอิง

Anonymous. 1991. Aflatoxin analysis in groundnuts and
groundnut products. Pages 195-278 in. The groundnut
Aflatoxin problem: review and database (Mehan, V.K.,
Mcdonald, D., Haravu, L.J., and Jayanthi, S. eds.).
Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research
Institute for the Semi-Arid Tropics.

Fan, T.S.L., and Chu, F.S. 1984. An indirect ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) for detection of
aflatoxin B1 in corn and penut butter. Journal of Food
Protection 47: 263-266

Chu, F.S. 1989. Current immunochemical methods for analysis of
Aflatoxin in groundnuts and groundnut products. Pages 101-172.
In Aflatoxin contamination of groundnuts : proceedings of the
International workshop, 6-9 October 1987, ICRISAT Center,
India. Patancheru, AP. 502324, India :International Crops
Research Institute for the Semi-Arid Tropics.

Wilson, D.M. 1989. Aflatoxin analytical methods for groundnut.
Pages 191-199. Ibid

Anajaiah, V., Mehan, V.K., Jayanthi, S., Reddy, D.V.R. and
Mcdonald, D. 1989. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) for alflatoxin B1 estimation in groundnuts. Pages 1983189. Ibid