Transcript Document 7584448

Fabrício Pereira
Francine Ribeiro
Helene de Abreu
Fibrose Cística
Deficiência de Glutationa sintetase
Alcaptonúria
Fibrose Cística
• Doença genética autossômica recessiva;
• Crônica;
• Resulta em alterações nas secreções causando um distúrbio
funcional das glândulas exócrinas acometendo principalmente
os pulmões, pâncreas, intestinos, fígado, glândulas
sudoríparas e sistema reprodutor;
• Mais comum em caucasianos;
• Acomete células de vários órgãos.
• O gene foi mapeado em 1989.
Genética
O gene da FC localiza-se no braço longo do
cromossomo 7, no lócus q31, formado por 250Kb
de DNA, com 27 éxons e codifica um RNAm de
6,5Kb.
Esse gene codifica para uma proteína chamada de
reguladora da condutância transmembrana para
fibrose cística (CFRT)
A CFTR é também chamada de canal de cloro e é
essencial para o transporte de íons pela membrana
celular, estando envolvida na regulação do fluxo de
cloro, sódio e água.
Genética
 Podem ocorrer mais de mil mutações nesse gene;
 A mais conhecida é a deleção de três pares bases nitrogenadas
no éxon 10 do gene CFTR, acarreta perda do aminoácido
fenilalanina na posição 508 da molécula da proteína CFTR.
 Conhecida como mutação ΔF508.
Os tipos de mutações podem ser agrupados e
m 6 classes:
1‐CFTR não é produzida;
2‐defeitos no processamento;
3‐regulação defeituosa;
4‐condutância defeituosa;
5‐produção parcialmente defeituosa
6‐regulação defeituosa de outros canais
•Classe 1‐3 de mutações são mais comuns
Fisiopatologia
As mutações no gene da fibrose cística,
provocam redução na excreção do cloro.
Com o aumento da eletronegatividade
intracelular, há maior fluxo de sódio para
preservar o equilíbrio eletroquímico e
secundariamente de água para a célula, por
ação osmótica.
Manifestações clínicas
 Extremamente variadas;
 Forma clássica:
 Tosse
crônica;
 Diarréia crônica;
 Desnutrição;
 Suor salgado;
Diagnóstico
 O exame padrão é o teste do suor com dosagem de sódio e
cloro.
 Diagnóstico Molecular- Baseia na análise das mutações, cuja
maioria é particular em populações específicas ou grupos
étnicos;
Terapia Gênica
 Introdução de cópias simples do cDNA normal correspondente à
sequência codificadora do gene FC em células portadoras do
defeito FC;
 Restaurando sua função normal de condutância do Cloro.
 O gene pode ser liberado para um número suficiente de células in
vivo e a função normal da proteína será restabelecida, podendose prevenir as manifestações da doença ou amenizá-las.
Cópias de
cDNA
vetores
Célula
portadora
de defeito
função
normal da
proteína
Terapia Gênica
 Muito indicada, mas ainda sob pesquisa;
 Vetores virais e não virais estão sendo estudados;
 Ainda não se chegou a um sistema de vetor ideal.
Métodos para detectar mutações
 Muitas técnicas estão disponíveis para identificar na
sequência do gene da CFTR.
 As metodologias podem ser:
 genotipagem- técnicas que detectam variantes alélicas
conhecidas;
 triagem- técnicas que procuram por qualquer alteração em
determinada região.
 As técnicas de genotipagem para análise do gene CFTR
são:
 análise de polimorfismo de comprimentos de fragmentos
de restrição (RFLP),
 ensaio qualitativo de PCR em tempo real, entre outras.
• Entre o método de triagem pode ser destacado:
 análise de dissociação em alta resolução (HRM)
• O sequenciamento pode ser usado para confirmar o
método de triagem ou ser usado diretamente para
identificar as mutações.
HRM
Análise de dissociação em alta resolução
 Fluoróforo se intercala no DNA de dupla fita é
adicionado na PCR antes da amplificação.
 Gera uma curva onde a fluorescência é coletada e
decresce conforme a desnaturação.
A identificação da alteração é através da
distorção que ocorre na curva quando
comparadas com amostras de controle.
A amostra que apresenta distorção deve
ser sequenciada para identificar a mutação
HRM
 Não precisa de processamento entre a amplificação de
PCR;
 Análise do produto apresentam vantagens para o
diagnóstico molecular;

risco de contaminações e tempo.
Proteção das células
contra danos
oxidativos.
Manutenção de grupos
sulfidrilas de
proteínas no estado
reduzido
envolvimento
no transporte
de
aminoácidos
Glutationa
Participação na
desintoxicação de
compostos estrangeiros
Co-fator para um
número de enzimas
 Estudos genéticos revelaram que as mutações no gene GS
humanos que levam à deficiência de SG e sugerem a
perda completa da função é provavelmente letal ( Shi et
al 1996., ; Dahl et al 1997., )
A
frequência é baixissima sendo
aproximadamente 70 casos no mundo todo
registrados
Duas formas da doença
Moderada
Causada por uma deficiência GS limitada
aos eritrócitos, resultando em anemia
hemolítica crônica e icterícia neonatal.
Grave
GS
Glutamilcisteína
Glutamil ciclotransferase
Avaria de
inibição por
feedback -
5-oxiprolina + cisteína
5-oxiprolinase
Acumulo de oxiprolina em tecidos corporais  Leva a 5 oxoprolinuria
e acidose metabólica
Muitos pacientes que sofrem da forma grave da doença são
mentalmente retardadas e alguns apresentam distúrbios da
função motora
Localização
 Localizado no Cromossomo 20q11.2 e contém 12 éxons
Caracterização do Gene
 O gene foi mapeado na região 20q11.2 através de FISH
(Hibridação in situ por fluorescência)
 Doença autossômica recessiva
 Constituído de 12 éxons
 Duas regiões não traduzidas uma 3’ e uma 5’
 Tem aproximadamente 23 Kb de tamanho
Caracterização do Gene
 Para detecção de mutações foi utilizado PCR(Reação em
cadeia da polimerase) e sequenciamento das amostras.
 Também
foram analisadas regiões flanqueadoras
(éxon/intron) através de sequenciamento
Caracterização do Gene
 Para produção do cDNA foi usado RT-PCR com RNA
extraído de fibroblastos do Rim.
 Devido as mutações promoverem a criação de sítios de
restrição para enzimas específicas, foi possível o uso de
RFLP.
Modelo de expressão
 Foram utilizados dois modelos de expressão: a Levedura
S. pombe(Schizosaccharomyces Pombe) e a bactéria E.
coli para avaliação da atividade das enzimas mutantes.
Detecção das mutações
Detecção das mutações
Efeitos estruturais da mutação em pacientes com
deficiência da glutationa sintetase
Métodos
 Clonagem da região 5’ flanquiadora do gene GSS de
humanos
 Usando 5'-RACE (amplificação rápida de extremidades do
cDNA) análise, para determinar o sítio de iniciação
transcricional em células Chang (linhagem de células
humanas do fígado)
Métodos
 Construção 5'- construção de deleções
 Mutagênese proximal e distal sítios NFE2 no promotor
GSS humanos
 Análise da construção de promotores em cultura de
células Chang
 Análise Northern Blot
Métodos
 EMSA (ensaio mudança mobilidade eletroforética)
 CHIP (imunoprecipitação de cromatina) análise
Tratamento
 Vitamina C
 Vitamina E
 Bicarbonato
100 mg/kg/dia
10mg/kg/dia
Correção da acidose
 N-ACETILCISTEÍNA  Neurotóxica
Etiologia.
 Causada
pela falha na atuação
homogentistato-1,2 dioxigenase.
da
enzima
 Causa um acúmulo de ácido homogentístico, o qual é
eliminado na urina, é oxidado no ar e deixa a urina
escurecida.
 Tecidos conectivos ficam com uma cor azulada ou negra
devido ao acúmulo do metabólito.
Pigmentação característica
Gene HGD
 Codifica
para a enzima homogentistato-1,2
dioxigenase, a qual participa do metabolismo de
aminoácidos como a fenilalanina e tirosina, a qual
atua principalmente no fígado e nos rins.
 É constituído por 14 éxons.
Estudos moleculares
 O gene foi clonado por Fernandez-Canon a partir da
sequência de um gene similar, hmgA, encontrado no
fungo Aspergillus nidulans .
 O gene foi mapeado com o uso de PCR e de FISH
(Fluorescent In Situ Hibridization) na região 3q.13.33.
Mutações
 Fernandez-Canon identificaram mutações de sentido
contrário relacionadas a casos da doença.
 Gerhig estudou dois casos em que os pacientes possuíam
uma substituição A-G com subseqüente substituição de
uma glicina por uma arginina.
 Os pacientes que são homozigóticos para a mutação
apresentavam a doença.
 Outros dois pacientes possuíam uma inserção que
causava uma parada prematura da transcrição.
 Pacientes com heterozigozidade não apresentavam
sintomas, comprovando a característica recessiva da
doença
Hot spots
 Em 1999, Beltran de Bernabe, descobriu dois novos
polimorfismos e concluiu que as repetições de
nucleotídeos CCC são hot spots, visto que mutações
nestes pontos são encontrados em mais de 30 %
dos casos.
 Rodriguez et al. (2000) ao estudarem mutações que
afetavam a conformação final da proteína se utilizaram
da bactéria E. coli como modelo de expressão.
 Foram utilizados vetores plasmidiais para a
transformação da bactéria e o meio de cultivo
continha ampicilina e cloranfenicol, cujo objetivo
era de selecionar os microrganismos que
receberam o plasmídio.
 Também foi feita uma analise de mutações no gene do
fungo Aspergillus nidulans.
 Foi utilizado um meio contendo fenilalanina, a qual,
ao não ser metabolizada pelos organismos mutantes
permite a distinção das colônias.
 As
colônias mutantes são distinguíveis pelos
pigmentos ocronômicos.
 O DNA foi clonado por PCR (reação em cadeia da
polimerase).
O
produto da PCR foi analisado através do
sequenciamento direto.
 As linhagens mutantes foram cruzadas com linhagens
normais, sendo que menos de dois por cento da
progênie tinha o fenótipo mutante.
Diagnóstico
 O diagnóstico é feito de forma clínica, através da análise
do paciente ou através de análises sanguíneas ou de urina
 Existem empresas que fazem a análise molecular,
incluindo uma que faz análises pré-natal.
Referências
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/607474
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8782815
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9069115
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9154114
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9529363
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10205262
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11001939
OBRIGADO