Transcript ADN recombinante Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED

ADN recombinante
Dr. Luis A. Mora B.
Cátedra de Bioquímica
UCIMED
IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico

Medicina forense

Terapia génica

Producción de medicamentos
insulina
factores de la coagulación
activador del plasminógeno
hormona de crecimiento

Producción de vacunas
Antihepatitis B
IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN.

Identificación de las bases moleculares de la enfermedad

Hipercolesterolemia Familiar
•
Drepanocitosis
•
Talasemias
•
Fibrosis Quística
•
Distrofia Muscular
ESTRUCTURA MOLECULAR
DEL ADN

Forma

Componentes

Apareamiento de las bases

Pares de bases en genoma haploide humano. 3x109

Longitud de genes. 3x103

Empacamiento del ADN
EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

Replicación

Transcripción (Exones e intrones)

Traducción

Síntesis de proteínas
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE

Aislamiento del ADN

Desnaturalización

Manipulación
Endonucleasas
Polimerasas

Formación de moléculas quiméricas
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
También conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces
fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia de nucleótidos que
reconocen (diana de restricción ) ; estos tienen entre 4 y 12 pb.
Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina humana.
Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos:
romos y cohesivos o escalonados. Estos pueden unirse por ligasas.
ADN vector: capaz de replicarse independientemente del de la célula anfitriona:
plásmidos.
 De organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de
defensa, para degradar material genético extraño. Las bacterias tienen la
capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y
el ADN propio. No pueden cortar ADN metilado.
Isoesquizómeros: distintas, de diferentes especies, idéntica diana , dejan el

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan).Al reconocer cortan al azar en
sitios distintos , ya sea corriente arriba o abajo, dejan extremos cohesivos. Necesitan ATP
para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el
sitio del corte (unas 1000 pb), S adenosil metionina (SAM) y Mg +2 como cofactores.
Tipo 2: Sólo restricción. Otras enzimas metilan. Cortan de manera consistente y
predecible en el sitio que reconocen o muy cerca de él. Por ello son muy utilizadas en
clonación, pues se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como
cofactor. No necesitan ATP.
Tipo 3 : Restricción y modificación. Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas
las actividades. Cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos
cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la
misma cadena de ADN. Necesitan ATP, Mg y SAM.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Nomenclatura
Se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:
1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo:
Escherichia coli (Eco)
2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )
3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una
misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.
4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función
pero usualmente se omite.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de
cortes:
1. Cohesivos o pegajosos:
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GGATCC
CCTAGG
BamHI
2. Abruptos:
AATATT
TTATAA
SspI
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
AAGCTT
AACGAA
HindIII
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Definición
Vectores
Plásmidos
bacterianos
ADN circular de doble banda
Inserción de 6-10 Kb
Fagos
virales
ADN lineal de doble banda
inserción de 10-20 Kb
Cósmidos
Son plásmidos con características de fagos
ADN circular de doble banda
inserción de 35-60 Kb
YAC
Son cromosomas artificiales de levaduras
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Propiedades de los vectores
Replicaciones independientes del ADN de la célula
hospedera


Secuencias de ADN conocidas

Copias únicas

Cromosoma más pequeño que el del hospedero
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
CLONACIÓN
Definición:
1.
m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos,
originado por reproducción asexual a partir de una única célula u
organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.
2.
m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico
obtenidos a partir de una misma secuencia original.
CLONACIÓN
Gracias