Transcript ADN recombinante Dr. Mora

ADN recombinante
Dr. Luis A. Mora B.
Cátedra de Bioquímica
UCIMED
IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico

Medicina forense

Terapia génica

Producción de medicamentos
insulina
factores de la coagulación
activador del plasminógeno
hormona de crecimiento

Producción de vacunas
Antihepatitis B
IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN
(base molecular de la enfermedad)
• Hipercolesterolemia familiar
• Drepanocitosis
• Talasemias
• Fibrosis Quística
• Distrofia Muscular
ESTRUCTURA MOLECULAR
DEL ADN

Forma (doble hélice de nucleótidos)

Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces
fosfodiéster)

Apareamiento de las bases (A:T, G:C)

Pares de bases en genoma haploide humano (3x109)

Longitud de genes (3x103)

Empacamiento del ADN (histonas)
ESTRUCTURA MOLECULAR
DEL ADN
EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

Replicación

Transcripción (Exones e intrones)

Traducción

Síntesis de proteínas
EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE

Aislamiento del ADN

Desnaturalización

Manipulación
Endonucleasas
Polimerasas

Formación de moléculas quiméricas
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
endonucleasas

Endonucleasas:

enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir
de una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ;
estos tienen entre 4 y 12 pb.
Cortan
ADN
de
hebra
doble,
donde
reconocen
secuencias
palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos
extremos: romos y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas.

Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina
humana.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:
endonucleasas
Organismos procarióticos (bacterias)
 Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para
distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio.
 No pueden cortar ADN metilado.
Isoesquizómeros:
 de diferentes especies
 idéntica diana
dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos
de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos:
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GGATCC
CCTAGG
BamHI
2. Abruptos:
AATATT
TTATAA
SspI
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
AAGCTT
AACGAA
HindIII
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
endonucleasas
Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan).
o
cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo)
o
dejan extremos cohesivos
o
Necesitan ATP
o
Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores.
Tipo 2: Sólo restricción.
o
otras enzimas metilan.
o
cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy
cerca de él.
o
son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas)
o
sólo requieren Mg+2 como cofactor.
o
no necesitan ATP.
Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades)
o
cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos.
o
requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la
misma cadena de ADN.
o
Necesitan ATP, Mg y SAM.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Nomenclatura
El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:
1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo:
Escherichia coli (Eco)
2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )
3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una
misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.
4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero
usualmente se omite.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:
vectores
Definición
Vectores
Plásmidos
bacterianos
ADN circular de doble banda
Inserción de 6-10 Kb
Fagos
virales
ADN lineal de doble banda
inserción de 10-20 Kb
Cósmidos
Son plásmidos con características de fagos
ADN circular de doble banda
inserción de 35-60 Kb
YAC
Son cromosomas artificiales de levaduras
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Propiedades de los vectores
Replicaciones independientes del ADN de la célula
hospedera


Secuencias de ADN conocidas

Copias únicas

Cromosoma más pequeño que el del hospedero
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
CLONACIÓN
Definición:
1.
m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos,
originado por reproducción asexual a partir de una única célula u
organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.
2.
m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico
obtenidos a partir de una misma secuencia original.
CLONACIÓN
Gracias