Transcript 离 子 交 换 层 析 ion exchange chromatography

离子交换层析
ion exchange chromatography
一、原理
离子交换层析是用离子交换剂（具有离子
交换性能的物质）作固定相，利用它与流动
相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离
子型化合物的层析方法。
 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交
换反应的过程。
带电荷量少，亲和力小的先被
洗脱下来，带电荷量多，亲和力大
的后被洗脱下来。
离子交换过程示意：
起始 吸附 解吸
完成
x+ : 起始缓冲离子
y+ ：待分离离子
z+ ：待分离离子
二、离子交换剂的种类
 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即
离子交换剂。
（一）按活性功能基团带电荷性质不同
阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换
阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换
（二）按载体种类不同
1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂
苯乙烯+二乙烯苯
 聚苯乙烯
（单体）（交联剂）
二乙烯苯
交联度 = ———————— × 100%
苯乙烯 + 二乙烯苯
 交联度大，网孔变小，大分子量的离子不
能进入树脂颗粒内发生离子交换。
 在不影响分离的情况下，以采用交联度较
高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子
的选择性 。
目数：离子交换树脂的颗粒直径大小
Dowex 50 为20-50目
Dowex 20 840m
50 297m
100 149m
（代表二乙烯苯的百分含量）
树脂resin（据所含交换基团的性质分）
阳离子交换树脂
强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H)
中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4)
弱酸型 含酚基、羧基
阴离子交换树脂
强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3]
弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2
阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离
子交换树脂稳定。
2.离子交换纤维素
 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素
pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙
胺乙基
 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一
般pH>4条件下使用,具有羧甲基
3.离子交换凝胶— 分离大分子物质
如 ： 葡 聚 糖 （ Sephadex）、 聚 丙 烯 酰 胺
（PAG）、琼脂糖（Sepharose）
三、操作注意点
（一）离子交换剂的选择
原则：根据被分离物质的性质选择—同一性
质离子交换剂中选用对被分离物质各组分
之间结合力差异大的型号交换剂，以保证
通过离子交换层析后能得到比较满意的结
果。
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷
2.被分离物质分子的大小
大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素
3.被分离物质所处的环境
4.被分离物质的物理化学性质
5.被分离物质的大概数量
根据分离过程的实验条件
强酸强碱—应用广泛
弱酸型—只能在碱性pH范围内使用
弱碱型—只能在酸性pH范围内使用
（二）缓冲液的选择
原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样
品一致。避免使样品变性
(三)洗脱剂
原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活
泼的离子或基团
改变pH或离子强度
增强洗脱液与离子交换剂的结合力
降低分离物与离子交换剂的结合力
洗脱方式：梯度洗脱
四、应用
分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他
带电的生物分子
离子交换层析法分离氨基酸及测定
[原理]
所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液，
分 别 属 酸 性 氨 基 酸 ( pI2.77)、 碱 性 氨 基 酸
( pI7.59)， 用 强 酸 型 阳 离 子 交 换 树 脂
Dowex50，在一定的洗脱条件下洗脱，将它
们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有
色化合物进行氨基酸鉴定。
与水含茚三酮的反应：
O
O
OH
OH
R CH COOH
+
NH2
R
N CHCOOH
£- 2H2O
O
O
O
O
R
N CH2
£- CO2
O
O
O
O
OH
OH
O
O
H
N
O
O
O
H2O
O
O
H
NH2
RCHO +
H
R
N CH
O
H
N
O
O
紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色

 pH4.2
 pH >10
Asp
His
[器材]
1. 层析柱等
2. 沸水浴
[试剂]
 Dowex50
 0.1mol/L NaOH
 pH4.2柠檬酸缓冲液
 样品液：氨基酸混合液
 茚三酮混合液
[操作]
1 、 层 析 ： 将 Dowex50 装 柱 后 ， 用 0 . 1 mol/L
NaOH清洗树脂5分钟。再用pH4.2柠檬酸缓
冲液平衡10分钟。（方法同凝胶层析法）
加样8滴。当样品进入树脂后，加入pH4.2
柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集，每管
收集3ml（控制流速15滴/分钟）。当第一
峰一出现，换用0.1mol/L NaOH作洗脱液，
直至第二峰收集完毕。用pH4.2缓冲液再平
衡10分钟，再生。
2、检测：从第2管起每收集管中加入2ml茚三
酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自
来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反
应，若生成紫色化合物，则说明收集到氨
基酸。
Separation of amino acids on a cation exchange column
Different types of ion exchange resins (a) Cation exchanger (b) Anion exchanger.