Marcatori Molecolari
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Transcript Marcatori Molecolari
Marcatori Molecolari
Introduzione
Marcatori RAPD
Marcatori proteici
Marcatori STS
DNA
Marcatori AFLP
Marcatori RFLP
Tecniche elettroforesi
PCR
Considerazioni
Applicazioni
Introduzione
I fattori ambientali possono influenzare i
caratteri morfologici
I marcatori molecolari (MM) focalizzano la
diversità del materiale genetico e misurano le
variazioni controllate da geni
I MM possono essere usati per :
misurare diversità genetica
costituire mappe genetiche
selezione assistita (MAS)
supporto all’isolamento genico (PC)
Che cosa sono i
Marcatori Molecolari ??
Marcatori Molecolari
sequenze proteiche e di DNA facilmente individuabili e
la cui eredità può essere controllata
Polimorfismo in proteine
proteine del seme
isoenzimi ed alloenzimi
Polimorfismi di DNA
nucleare
citoplasmatico
Proprietà desiderabili
Polimorfico
Eredità codominante
Distribuito in tutto il genoma
Facile e veloce da individuare
Poco costoso
Riproducibile / Trasferibile
Nessun marcatore le possiede tutte
Marcatori proteici
Breve introduzione alle proteine
Proteine di conservazione del seme
Isoenzimi
Alloenzimi
Struttura delle proteine
Struttura delle proteine
Struttura primaria – backbone del polipeptide
Struttura secondaria – legami ad idrogeno locali
Struttura terziaria – legami che coinvogono i gruppi R
Struttura quaternaria – interazione tra polipeptidi
Proteine ed ambiente
La struttura tridimensionale delle proteine è il
risultato dell’interazione con l’ambiente.
Bisogna quindi tenere conto della denaturazione delle
proteine ….
…. e della diversità della loro funzione …
…facilitata dalla complessità di struttura
Proteine seed storage
Perché usiamo le proteine del seme ??
•
•
•
i semi sono ricchi di proteine
le proteine sono disponibili in sufficiente quantità
i semi sono uno stadio dello sviluppo ben definito
La metodologia
•
•
•
si estraggono le proteine e si separano in elettroforesi
si visualizzano sul gel con la colorazione (staining)
si analizza il pattern delle bande
Considerazioni ed Applicazioni
Considerazioni
•
•
•
co-migrazione
pattern delle bande complesso
variazione intraspecifica
Applicazione della tecnica
•
•
es. frumento, orzo
recentemente anche melanzana
Isoenzimi ed Alloenzimi
Forme multiple dello stesso enzima
• isoenzima : un enzima, più di un locus genico
• alloenzima : un enzima, un locus genico
Metodologie
• tessuti macerati
• enzimi separati per elettroforesi
• visualizzazione per colorazione istochimica
• analisi del pattern
Interpretazione del pattern
Omozigote o eterozigote ??
Struttura quaternaria dell’enzima
Numero di loci
Numero di alleli
Analisi genetiche spesso necessarie
Formazioni di eteromeri
Applicazioni
Metodo potente e riproducibile per :
•
•
•
caratterizzare/identificare genotipi
studi di genetica di popolazione
esaminare patterns di variazione geografica
Limitato numero di enzimi disponibili
Marcatori su DNA
Le basi del DNA
Metodo RFLP
Metodi basati sulla PCR
Marcatori STS
Marcatori AFLP
Tecniche elettroforesi
Le basi del DNA
La sintesi del DNA
Marcatori RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Gli RFLP esaminano differenze in peso molecolare di specifici frammenti di DNA ristretti
Usualmente si utilizza il DNA totale
Richiedono DNA puro e di alto peso
molecolare
Metodologia RFLP
Tagliare il DNA in piccoli frammenti
Separare i frammenti in gel eletttroforesi
Trasferire i frammenti di DNA su filtro
Metodologia RFLP
Visualizzazione dei frammenti di DNA
• sonde radioattive
• sonde non-radioattive
Analisi dei risultati
• bande selezionate per presenza/assenza
• differenze nel pattern riflettono differenze
genetiche
La scelta di sonda ed enzima di
restrizione è cruciale
Interpretazione dei Risultati
Esempio di Analisi
RFLP su fragola
RFLP : vantaggi e svantaggi
Riproducibili
Marcatori codominanti
Tecnica semplice
Tecnica lunga e costosa
Utilizzo di sonde radioattive
Marcatori su DNA
Le basi del DNA
Metodo RFLP
Metodi basati sulla PCR
Marcatori STS
Marcatori AFLP
Tecniche elettroforesi
PCR
Polymerase Chain Reaction
Potente tecnica per amplificare il DNA
Prevede l’utilizzo di cicli di temeperature
• step di denaturazione
• step di annealing
• step di elongazione
Il DNA amplificato viene separato su gel
elettroforesi
I tre passaggi della PCR
PCR : componenti reazione
Utilizzo della Taq polimerasi
Condizioni di reazione
Importanza della standardizzazione
Una reazione contiene :
• target DNA
• Taq polimerasi
• uno o più starter o primer
• 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• buffer di reazione con il cofattore MgCl2
PCR : riassunto
DNA polimerasi
Apparecchio Thermal Cycler
Profilo delle temperatura (programma)
Concentrazione del DNA target
Concentrazione dello ione Mg
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando
primer arbitrari
Metodo veloce per individuare polimorfismi
Marcatori dominanti
Problemi di riproducibilità
Interpretazione dei RAPDs
I marcatori RAPDs sono anonimi
I marcatori RAPDs sono dominanti
Problemi di co-migrazione
una banda, un frammento ?
stessa banda, stesso frammento ?
RFLP : vantaggi e svantaggi
Semplici e veloci
Poco costosi
Non utilizza radioattivo
Marcatori dominanti
Problemi di riproducibilità
Problemi di interpretazione
Marcatori su DNA
Le basi del DNA
Metodo RFLP
Metodi basati sulla PCR
Marcatori STS
Marcatori AFLP
Tecniche elettroforesi
STS
Sequence-Tagged Sites
Utilizzano la PCR a partire da :
Sequence-Tagged Microsatellites (STMS)
Oligonucleotidi ancorati a MS
inter-simple sequence repeat (ISSR)
Sequence-characterized amplified regions
(SCARs)
Cleaved amplified polymorphic sequence
(CAPS)
Marcatori Microsatelliti
Sequence-Tagged MS
In genere single locus multiallelico
Codominante
Inter-simple sequence repeats
Amplificano segmenti adiacenti
sequenze ripetute (repeats)
Marcatori dominanti
SCARs and CAPS
SCARs – sequence characterized amplified
regions
marcatore single locus derivante da frammento
RAPD
CAPS – cleaved amplified polymorphic
sequence
Marcatore locus specifico
Prodotto di amplificazione RAPD utilizzato come
sonda RFLP
Marcatori su DNA
Le basi del DNA
Metodo RFLP
Metodi basati sulla PCR
Marcatori STS
Marcatori AFLP
Tecniche elettroforesi
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
Tecnicamente sfruttano la combinazione tra
RFLP e PCR
Il risultato è un fingerprint altamente
informativo
Il metodo diviene sempre più popolare
AFLP
La Tecnica
AFLP : vantaggi e svantaggi
Altamente sensibili
Altamente riproducibili
Largamente applicabili
Costosi
Tecnicamente difficili
Necessari radioisotopi
Problemi di interpretazione
Analisi RAPD
su melanzana
Esempio di Analisi
AFLP su vite