Transcript TP Hemostasia

HEMATOLOGIA
2014
CLASE TEORICO-PRACTICA
PRUEBAS PARA EVALUAR EL
MECANISMO HEMOSTÁTICO
Mariana Raviola
HEMOSTASIA
Comprende el proceso que previene
el sangrado cuando un vaso
sanguíneo es dañado y al mismo
tiempo mantiene la sangre en estado
fluido dentro del árbol vascular
HEMOSTASIA
FASES:
-Respuesta vascular: Vasoconstricción
localizada a nivel del área afectada
-Hemostasia Primaria: Formación de un
agregado o trombo de plaquetas sobre la
superficie de vascular lesionada.
-Coagulación: Formación de fibrina que
refuerza el trombo plaquetario.
-Fibrinolisis: Eliminación de los depósitos de
fibrina.
INDICACIONES PARA EL PACIENTE
Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas
tratando de realizar el menor esfuerzo físico posible
FICHA DE ANTECEDENTES DEL
PACIENTE









- Motivo de consulta
-Trombosis actual o anterior
-Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis
-Sangrado post extraccion dentaria
-Hemorragia post parto o post cirugia
-Menstruacion abundante
-Petequias
-Antecedentes familiares de trombosis o sangrado.
-Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos,
heparina, etc
HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS
-Anticoagulante: EDTA
-Material adecuado: tubos de polipropileno,
vidrio siliconado
-Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de
tejido
HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS
Métodos manuales
-sangre venosa anticoagulada con EDTA
Dil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn: 150400x103/mm3)
Contadores hematológicos.
HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS
Es conveniente observar un frotis de
sangre periférica donde
se controlará el número, forma y tamaño
plaquetario.
HEMOSTASIA PRIMARIA
Tiempo de sangría
Prueba global de la hemostasia primaria. Evalúa
interacción: Plaquetas-Pared vascular “in vivo”
Depende de:
cantidad y calidad funcional de las plaquetas
cantidad y calidad funcional de vWF
calidad del colágeno.
Duke
VN < 3 min
Ivy
VN < 4.5 min
Simplate VN < 9.5 min
Cohibir cuando tpo > 2 VN
Tiempo de sangría
TS:
  sensibilidad -  especificidad - 
reproducibilidad
Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad,
presión del corte, dirección de la incisión,
“barrido” excesivo
HEMOSTASIA PRIMARIA
Retracción del Coagulo
Se produce a través de la interacción de la GPIIbIIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP
como fuente de energía, depende de varios
factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de
fibrinógeno, hematocrito, es poco sensible, y muy
influenciada por la limpieza del material
RETRACCION DEL COAGULO
HEMOSTASIA PRIMARIA
Retracción del Coagulo
Se coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de
vidrio bien limpio, se mantiene a 37C°,a la hora
se observa la magnitud de la retracción.
El resultado se expresa en cruces. Cuando el
coagulo se ha despegado por completo de la pared
del tubo se considera retracción total(+++), cuando
no hay retracción es aretráctil, y cuando queda un
cuello de fibrina y un sedimento de hematíes se
llama fibrinocruorico.
HEMOSTASIA PRIMARIA
Prueba del Lazo
Evalúa fragilidad capilar aplicando una presión
positiva que aumenta la presión sanguínea por
obstrucción del recorrido venoso.
Depende de calidad y cantidad de plaquetas,
calidad del vaso y los tejidos adyacentes y del
gradiente de presión que tiende a generar la
extravasación
HEMOSTASIA PRIMARIA
Prueba del Lazo
Se coloca el esfigmomanómetro en el antebrazo y
se deja 5 min. a una presión media entre la
máxima y la mínima, se quita la presión y se
observa la aparición de petequias luego de unos
minutos.
VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de
diámetro. Se informa la positividad en cruces
HEMOSTASIA PRIMARIA
ADHESIVIDAD
PLAQUETA
vW
SUPERFICIE
•In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157)
•In Vitro : Hellem II (superficie de vidrio)
Scand J Haemat 1970, 7: 37
HEMOSTASIA PRIMARIA
ADHESIVIDAD
In Vivo : Borchgrevink
Adhesividad (%)= 100 *( RT0 – RT2 / RT0 )
RT0 : recuento de Pq. de muestra de sangre venosa
extraída con EDTA
RT2 : recuento de Pq. Luego de 2 min de TS.
VN: 30-70%
ADHESIVIDAD: método de Hellen II
•Sangre entera
•Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de
vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna.
•Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.
columna
cp
EDTA 2%
bomba
sp
EDTA 2%
%Adh = 100
VN = 27- 70%
SP- CP
SP
HEMOSTASIA PRIMARIA
AGREGACIÓN
La agregación plaquetaria es el resultado final de
un complejo proceso metabólico. Cuando el
endotelio se daña se exponen una serie de
agonistas capaces de activar a las plaquetas, estos
son el colágeno de la pared vascular, la trombina
generada, la adrenalina y el ADP.
La agregacion plaquetaria in vitro se define como
la interaccion Pq-Pq medida sobre PRP.
Agregación plaquetaria in vitro
Método óptico (Born, 1980)
Método potenciométrico
(Challen, 1982) IIHEMA-ANM
Condiciones del ensayo:
-Sangre obtenida por punción sobre citrato de sodio 3.8%
(1:9)
-Tubos de polipropileno
-Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a
150-200 rpm
-Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a
altas rpm.
-Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – 300 109/ m3
-Tapar tubos para evitar cambios de pH
- Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs
posteriores a la extracción.
AGREGACION
Agonistas panel de rutina:
ADR: 10 uM ( adrenérgicos)
Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa)
AA: 0.5 mM (receptor de Tx)
ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12)
Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II)
Agonistas especiales
TRAP6 : PAR1, PAR4
U46619: análogo de TX
Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza
Ionóforos (A23187): movilización de Calcio
AGREGACION
COAGULACIÓN
HMWK
MI
VII
XII
PK
XI
IX
ME
VIII
X
V
II
I
TC
TOMA DE MUESTRA
 Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 %
 No se aconseja utilizar sangre capilar.
 La sangre venosa debe ser obtenida por punción rápida
y precisa, evitando la formación de espuma, el éxtasis
venoso y la contaminación con tromboplastina tisular,
(torniquete menos de un minuto)
TOMA DE MUESTRA
 La sangre arterial debe ser obtenida por punción
directa no traumática.
 Evitar la extracción por catéter, de ser indispensable,
realizar la extracción con doble jeringa y descartar los
primeros 5 a 10ml de sangre.
TOMA DE MUESTRA
 No se aconseja la extracción con tubos de vacío,
aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar la
sangre una vez abiertos.
 Relación ac / sgre, 1+9
TOMA DE MUESTRA
 La relación Anticoagulante / Sangre varía cuando el Hto. se
encuentra fuera del rango de 25 – 50%. Para calcular el
citrato a utilizar se usa la siguiente fórmula:
Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55
1 – Hto en (v/v)
TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
Cualquiera sea la distancia se remitirán las
muestras congeladas, con hielo seco, y en
un recipiente adecuado para su
conservación, acompañadas de controles
normales procesados de igual forma.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Descartar los tubos que no mantengan
adecuada relación ac/ sgre , y aquellos que
muestren hemólisis visible.
Centrifugar las muestras y separar los plasmas
con pipetas de plástico lo mas rápido posible.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
a-Plasma citratado rico en plaquetas (prp)
centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el
plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs
b-Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp)
centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las
4 hs .
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
c- Preparación de pool de plasmas normales
Se extrae sangre a como mínimo 10 sujetos
normales con básico de coagulación normal , y
se prepara ppp se fracciona y se conserva
a -80° C hasta 6 meses o solo 1 mes si se
guarda a -20 ° C
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
d-Preparación de plasma adsorbido
Es plasma desprovisto de los factores vitamina K
dependientes, factores II ,VII, IX y X, que quedan
adsorbidos en sulfato de bario.
A partir de sangre extraída con oxalato de sodio en
relación 1+9, se prepara ppp y se mezcla con sulfato
de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba a 37°C 15
min. ,se centrifuga dos veces y se recoge el
sobrenadante, que debe tener un TP mayor de 60 seg.
El plasma adsorbido posee los factores:
I,V,VIII,XI,XII
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
e-Preparación de suero
Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI Y XII.
Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo de
vidrio por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min. a
3000 rpm .Se puede mantener a 4°C por 24 horas o
fraccionar y congelar
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
f-Preparación de plasma envejecido
Deficitario en factor V, se extrae sangre con oxalato de
sodio 0.1 M en proporción 9+1, se obtiene ppp, y se
lo coloca en un enlenmeyer a 37°c.
Se controla el decaimiento de la actividad del factor
V mediante el TP hasta un valor de 60 seg. Alicuotar
y guardar a -20°C
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TPR
 -Tiempo de plasma recalcificado
 -Se basa en reiniciar la cadena de activación del
sistema de la coagulación al agregar un exceso de
iones calcio al plasma citratado y se mide el tiempo
que tarda en coagular
 -Evalúa numero y función de plaquetas
 Muestra: prp
 Reactivo: cloruro de calcio 0,025 M
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TPR
 Procedimiento: incubar unos segundos a 37°C 200 ul
de prp y disparar el cronometro al agregar cloruro de
calcio 0,025 M, medir en intervalos de 30 seg el
tiempo que tarda en coagular
 Se realiza por duplicado y se informa el promedio
 VN: 1-3 min.
 Prolongado: Déficit de factores de la vía intrínseca y
del numero y función de las plaquetas.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
 -Tiempo de protombina
 -Mide el tiempo de coagulación de un plasma
citratado en presencia de tromboplastina (FT) e iones
calcio
 -Evalúa la vía extrínseca
 -Se usa para monitorear la terapia con ACO
 -Refleja cambios en los niveles de los factores
II,VII,X,V
 -En cuanto al fibrinógeno solo una disminución por
debajo de 50 mg lo afectan.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
Tromboplastina
Apoproteina + Fosfolipidos
 Fuentes: plantas, cerebro de conejo, ratón o mono,
recombinarte (humana) a la que se le agregan
fosfolipidos naturales o artificiales
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
 Muestra: plasma citratado ppp
 Reactivo: tomboplastina calcica
 Procedimiento: incubar 100 ul de ppp 1 min a 37°C,
disparar el cronometro al agregar 200 ul de reactivo a
37°C, medir el tiempo de coagulación
 Los resultados se informan:
-En segundos informando entre paréntesis el valor del
testigo( 11 recombinante, 12-14 de conejo)
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
-En % de actividad o tasa de trombina:
Se preparan diluciones de un pool de plasmas
normales y se determina el TP por duplicado, con
los datos se grafica una curva, en papel doble log, de
TP vs % de actividad, asignando al pool de normales
el 100% de actividad.
Teniendo el TP del paciente se busca en la curva el %
o tasa que le corresponde.
VN: 70-100%
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
 Valores prolongados se observan en:
-Deficiencia congénita o adquirida de uno o varios de
los siguientes factores: II,V,VII,X
-Hipofibrinogenemia
-Enfermedad hepática
-Deficiencia de vitamina K
-Tratamiento con ACO
-Presencia de inhibidores de alguno de los factores
involucrados
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
 -Tiempo de tromboplastina parcial activado
 -Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma
citratado ppp en presencia de tromboplastina parcial,
un activador, e iones calcio.
 -Evalúa la vía extrínseca
 -Se utiliza para controlar la terapia de anticoagulación
con heparina
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
 Tromboplastina parcial: fosfolipidos de la
tromboplastina que se obtienen de tejido animal o de
fuentes vegetales (cefalina)
 Activador :- particulado, caolín, celite, sílica
micronizada.
-no particulado, ac. Elagico
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
 Muestra: plasma citratado ppp
 Reactivos: -cefalina - caolin
-cloruro de calcio 0.025 M
 Procedimiento: incubar100 ul de ppp con 100 ul de
rvo a 37°C durante 3 min, disparar el cronometro al
agregar 100 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir el
tiempo que tarda en coagular.
 VN: 30- 40 seg.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
 Valores prologados se observan en:
-Déficit congénito o adquirido de factores II, V, VIII,
IX, X, XI, y XII
-Tratamiento con heparina
-Presencia de inhibidores
-Tratamiento ACO instaurado
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TT
Evalúa la etapa de fibrinoformación midiendo el tiempo
que tarda en coagular el plasma citratado en presencia
de trombina, independientemente de las alteraciones
que podrían afectar el MI o el ME
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TT
Muestra: ppp
Reactivo: solución de trombina comercial (liofilizada) o
preparada a partir de plasmas de dadores, se ajusta la
dilución de manera tal que el testigo sea
aproximadamente 15 seg
Procedimiento: incubar 100ul de muestra 1 min a 37° C
agregar 100 ul de trombina diluida y tomar el tiempo
que tarda en coagular.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TT
Se considera prolongado cuando el plasma del paciente
difiere en mas de 4 segundos con el normal.
Valores prolongados se observan en :
-Niveles bajos de Fibrinógeno o Disfibrinogenemia
-Tratamiento con heparina no fraccionada
-Presencia de inhibidores adquiridos
PRUEBAS ALTERADAS
Déficit de factores
o presencia de inhibidores?
Mezclas con plasma normal (1+1)
corrige
cuantificación de
factores
no corrige
detección de
inhibidores
PRUEBAS DE CORRECCIÓN
Para orientarnos sobre las causas que provocan la
alteración de las pruebas podemos realizar
correcciones mezclando partes iguales del plasma en
estudio con:
- Plasma adsorbido: aporta los factores
I,V,VIII,XI,yXII.
-Suero: aporta los factores VII,IX,X,XI, yXII
-Plasma envejecido: carece de factor V
DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA EXTRINSECA
II, V, VII, X
TP
• plasma
seg
» patrón/pool de plasma
normal(curva de
seg
calibración)
pac
» paciente diluido
• plasma deficiente en el
factor a medir
• tromboplastina - calcio
% pac
% factor
DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA INTRINSECA
VIII, IX, XI, XII
KPTT
• plasma
» patrón/pool de plasma
normal (curva de
calibración)
seg
seg
pac
» paciente diluido
• plasma deficiente en el
factor a medir
• cefalina - kaolín
• Cl2Ca
% pac
% factor
DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA
FINAL : FIBRINOGENO (método
gravimétrico)
trombina
fibrinógeno
fibrina
-Se recoge el coagulo con varilla de vidrio
-Se lava con agua destilada
-Se deshidrata con alcohol, y se deja secar a 80° C
-Se pesa la fibrina en balanza de precisión, la masa final
de fibrina es directamente proporcional a la
concentración de fibrinógeno
DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA FINAL :FIBRINOGENO
(método de Claus)
método básico = TT
seg
• plasma
» patrón mg/dl (curva de
calibración)
seg
pac
» paciente
• trombina
mg/dl pac
mg/dl
SANGRADO SIN ALTERACION DE LA
PRUEBAS GLOBALES
Determinación de factor XIII
La fibrina formada en ausencia de factor XIII se
disuelve en urea 5 M
Procedimiento: Se hace coagular 200ul de ppp con
200ul de cloruro de calcio 0.025 M, y 100 ul de
trombina, incubar 30 min a 37°C agregar solución de
urea 5 M, desprender el coagulo de las paredes y
dejar a temperatura ambiente 24 horas. Observar a los
30min, 1,2,4,y 24 horas la disolución del coagulo
Valor normal: no disolución a las 24 horas.
FUNCIONES DEL SISTEMA
FIBRINOLITICO
ELIMINACIÓN DE LA FIBRINA QUE QUEDA
ADHERIDA A LAS PAREDES DE LOS VASOS
DESPUÉS DE LA COAGULACION (intravascular)
INTERVIENE EN LAS REPARACIONES
HÍSTICAS
INTERVIENE EN LA ACTIVACION DE LOS
MACROFAGOS (extravascular)
SISTEMA FIBRINOLÍTICO
Está compuesto por una
enzima clave: plasmina (Plm),
cuyo precursor inactivo es el
plasminógeno ( Plg ).
Esta activación puede
producirse por :
Activador tisular del
plasminógeno: t-PA
Activador tipo uroquinasa: uPA
Factor XIIa y calicreína
SISTEMA FIBRINOLÍTICO
La plasmina produce clivaje tanto del fibrinógeno como de la fibrina.
_____________________________________________________
Degradación del fibrinógeno.(Fibrinogenolisis)
fragmentos X, Y, D, E ( PDF)
Fisiológicamente esto no ocurre ya que las pequeñas cantidades de
plasmina que se generan son inhibidas por la antiplasmina.
_____________________________________________
Degradación de fibrina. (Fibrinolisis)
fragmentos de distinto PM , en su mayoría fragmento D
entrecruzado ( D-Dímero)
El hallazgo de Dímero D aumentado implica que hubo formación de
fibrina entrecruzada y posterior lisis de la misma.
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
PRUEBAS GLOBALES
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO.
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE
ENTERA DILUIDA.
TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO
 2 ml de sangre.Incubar a 37 ºC
 Tomar el tiempo de lisis.
 Se informa el tiempo de lisis
 Normal un tiempo mayor de 24 hs
 < de 24 hs--- aumento de la act.fibrinolitica
 < 6hs----asociado a hemorragias.
 Poco sensible.Sirve en los def. de alfa2-AP
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE
ENTERA DILUIDA
 Sangre diluida 1/10 en buffer fosfato y con el
agregado de trombina.30 min en heladera
 Dejar a 37 ºC.Examinar cada 10 min.Anotar tiempo
de lisis.
 Resultado variable. < de 2 hs ---Hiperfribrin.
 > de 20 hs----Hipofibrinolísis
 Evaluar junto a la lisis de euglobulinas
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS
La dilución y acidificación del plasma provoca la
precipitación de las euglogulinas( fracción proteica
que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los
activadores del plasminógeno y la plasmina), luego se
resuspende en buffer alcalino, se coagula y se incuba
a 37°C, para registrar el tiempo de lisis del coágulo,
este procedimiento elimina los inhibidores de la
fibrinolisis.
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS
El tiempo de lisis del coagulo es inversamente
proporcional a la actividad fibrinolítica del plasma
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
Procedimiento: en tubo de vidrio se agregan 4ml de
agua destilada,70ul de acido acético, y 250ul de ppp,
se mezcla y deja 30 min a 4° C, se centrifuga 5 min a
bajas rpm, en el sobrenadante quedan los inhibidores
que se descartan, se deja escurrir y se resuspende con
solución de borato de sodio en baño a 37°C hasta
disolución y se coagula agregando cloruro de calcio
Se registra el tiempo desde la coagulación hasta la
disolución total del coagulo.
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
VN: el coagulo se lisa entre 1h 30 min y 4 hs.
Tiempos de lisis inferiores demuestran un aumento de la
fifrinolisis a expensas del aumento de los activadores
del plasminógeno, pudiéndose asociar con
hemorragias.
Tiempos de lisis superiores reflejan disminución de la
actividad fibrinolítica y pueden asociarse a perdidas
embriofetales.
La prueba se ve afectada por los niveles de fibrinógeno
y de plasminógeno.