Transcript 13-Microarray

MICROARRAY (Matrici ad Alta Densità)
Molecole “esca” vengono immobilizzate in un’area “molto piccola” e
testate per varie “attività biochimiche”
I MICROARRAY PERMETTONO ANALISI RAPIDE E SEMPLICI DI
MIGLIAIA DI ELEMENTI CONTEMPORANEAMENTE
Negli ultimi anni sono stati progettati array di vario tipo:
9DNA microarrays
9Tissue-arrays
9Living cell-arrays
9Antibody/antigen arrays
9Carbohydrate arrays
9Peptide arrays
9Protein arrays
9Small-molecule arrays
Vantaggi della tecnologia microarray:
9 Elevata intensità di segnale
elevata sensibilità.
9 Ottimo rapporto segnale/rumore.
9 Economica (i chip possono essere usati più volte. Occorrono
minime quantità di campione e di reattivi)
È fondamentale mantenere
preservandone la struttura.
le
proteine
nel
loro
stato
Le proteine legate possono essere:
• IDENTIFICATE
• QUANTIFICATE
• CARATTERIZZATE (attività, modifiche, interazioni……)
attivo,
L’uso della tecnologia microarray per le proteine è “difficoltoso”
PROTEIN ARRAY
9 Supporto solido (SLIDE) su cui i REAGENTI sono deposti
(“spottati”, “stampati”, ….), in modo ORDINATO e ad una specifica
DENSITÀ (fino a 500 molecole/spot; spot 30-150 µm);
9 REAGENTI: proteine, peptidi, anticorpi, allergeni……
I REAGENTI catturano proteine target presenti nei campioni da analizzare
(es. lisati cellulari, sieri, cellule, ….)
PRODUZIONE DI ARRAY:
9 SPOTTING
9 SINTESI IN SITU
NB: La preparazione di protein array è più complessa rispetto a quella di DNA o RNA array.
LETTURA DEL CHIP:
tipicamente con apparecchi in grado di leggere
fluorescenza ( appositi scanner o microscopi confocali….)
la
Le proteine che si legano al chip vengono identificate o mediante marcatura con
un fluorocromo (Cy3, Cy5, Alexa….) o mediante associazione con un anticorpo
marcato con una sonda fluorescente. Esistono anche metodi label free.
Si ottengono informazioni QUALITATIVE ( avvenuto legame fra il
“reagente” sulla slide e il suo target proteico e QUANTITATIVE
(l’intensità di fluorescenza è proporzionale alla quantità di campione legato).
Metodica molto sensibile; limite inferiore 150 fg/ml.
Problemi di saturazione oltre 1 mg/ml.
Con un Protein Microarray è teoricamente possibile definire, per ogni
proteina del campione:
9 QUANTITÀ
9 MODIFICHE
9 ATTIVITÀ
9 LOCALIZZAZIONE
9 INTERAZIONE
In pratica:
Non più di 1-2 parametri contemporaneamente per proteine selezionate
I PROTEIN MICROARRAY consentono la determinazione
simultanea di un ampio numero di parametri da una piccola
quantità di campione in un unico esperimento
UTILIZZATI SOPRATTUTTO PER:
9 Identificazione e quantificazione di proteine
9 Studi di interazione proteica
Caratteristiche principali:
- ELEVATA SENSIBILITA’
- USO DI PICCOLISSIME QUANTITA’ DI CAMPIONE
- LE QUANTITA’ DI PROTEINA LEGATA RIFLETTONO
LE REALI CONCENTRAZIONI IN SOLUZIONE
- OTTIMO RAPPORTO SEGNALE/RUMORE
Proprietà dei PROTEIN CHIPS
I protein chips devono:
9 Legare le proteine “ad alta densità”, nel loro stato attivo
9 Il rapporto segnale/rumore deve essere minimo
9 Devono essere compatibili con il maggior numero possibile di saggi
I substrati comunemente usati per legare le proteine (polistirene,
polivinilidene fluoruro (PVDF), nitrocellulosa…) NON sono compatibili con
analisi microarray.
Vetro o altri materiali con superfici opportunamente derivatizzate
SLIDE:
9 Supporti di vetro, oro, polistirene….funzionalizzati o non funzionalizzati
9 Supporti con superficie modificata (micropozzetti, microcanali, microchiusure….)
Vantaggi delle superici porose 3D:
• Minor evaporazione del solvente e minor denaturazione delle
proteine;
• Aumentata capacità di binding;
• Si previene la cross-contaminazione tra i reagenti depositati
(sono fisicamente separati).
La
“stampatura”
del
chip
viene
sempre
fatta in ambiente “umido” e in presenza di
glicerolo 30-40%.
Nuova tecnologia per nanowells:
DEPOSIZIONE ELETTROSPRAY
Spot Size: ∼30 µm
Spot Size:
∼ 1 5 0 µm
Spot Size:
∼30 µm
GOLD-COATED GLASS SURFACE
Compatibile con:
• RISONANZA PLASMONICA DI SUPERFICIE
• SPETTROMETRIA DI MASSA
E’ possibile monitorare sia i ligandi che la dinamica delle
reazioni.
Grandi potenzialità nella ricerca farmacologica e biomedica
(ricerca di target farmacologici e diagnostici)
L’ORIENTAMENTO è fondamentale per un’analisi corretta
Un orientamento random può alterare la conformazione
nativa delle proteine, ridurne l’attività o renderle
inaccessibili al ligando/analita.
Necessario sviluppare metodi per la
preparazione degli arrays che riducano il rischio
di denaturazione delle proteine e le interazioni
non specifiche tra queste e gli analiti
IMMOBILIZZAZIONE DELLE PROTEINE:
adsorbimento fisico
legame covalente
immobilizzazione orientata
immobilizzazione in situ
SURFACE CHEMISTRY
Il legame fra proteina e substrato può avvenire per:
INTERAZIONE NON-SPECIFICA
(Adsorbimento; Interazioni ioniche; ….)
CROSS-LINK COVALENTE
INTERAZIONE SPECIFICA
(affinità)
Superficie di vetro rivestita da
uno
strato
sottile
di
nitrocellulosa, o poli-lisina…
L’orientamento è casuale. Alto
rumore di fondo
Si usano cross-linker bifunzionali (es. silano)
per formare self-assembled monolayer (SAM)
su vetro o vetro rivestito d’oro. Uno dei gruppi
funzionali reagisce con il vetro o con l’oro e
l’altro con specifici gruppi delle proteine (es. –
NH2; ….). L’orientamento è casuale.
Proteine fuse con un tag di affinità
(es. His-tag vs vetro rivestito di
nichel).
Basso
rumore
di
fondo.
Orientamento unico.
INTERAZIONE NON SPECIFICA:
formazione di film mono- o multi-strato per auto-assemblamento di
poli-elettroliti con cui le proteine instaurano interazioni di tipo
elettrostatico
CH
CH 2
H 3C
N
+
CH3
H 2C
CH
CH 2 NH 2
H2C
+ HCl
CH 2
SO 3 Na
L’interazione può essere influenzata da:
• carica della superficie
• punto isoelettrico della proteina
• pH del buffer
POSSIBILE perdita dell’attività biologica della proteina per
orientamento inappropriato
CROSS-LINK COVALENTE:
Interazione più forte e più specifica; richiede cross-linker bifunzionali
O
N
S
S(CH2)2 C O
O
O
N
HS
O
NH
S
O
O
O
N
O
C (CH2)2S
O
O
NH
HN
S(CH2)2 C O
N
O
O
N
(CH2)3 C O
O
N
O
O
O
O
Reagenti di coupling SILANICI sono spesso usati per funzionalizzare
VETRO, QUARZO E SILICONE perché resistono ai solventi e non
interferiscono con le proprietà ottiche dei supporti
Per le superfici ricoperte di oro si utilizzano
TIOALCANI BIFUNZIONALI
COOH
HO
CH2
O
(CH2CH2O) 4
C(O)NH(CH2)4CH
N
CH2COOH
CH2
O
(CH2CH2O) 4
H
O
CH2COOH
HS
HS
HS
Rischio perdita attività biologica della proteina per
l’orientamento random
INTERAZIONE SPECIFICA:
- superficie streptavidinata + molecole biotinilate;
- superficie funzionalizzata con Ni2+ + proteine his-”tagged”;
- superficie funzionalizzata con proteina-A o proteina-G
(Staphylococcus) che riconoscono la regione FC degli
anticorpi
Miglior metodo per ridurre le interazioni non specifiche e
aumentare la sensibilità dell’array.
È UN’ IMMOBILIZZAZIONE ORIENTATA
IMMOBILIZZAZIONE IN SITU:
- oligonucleotidi stampati sull’array + lisato cellulare
di mammifero → traduzione di proteine di fusione
con un epitopo per l’immobilizzazione ………
Discern Array
Creazione di microarray proteici direttamente dal DNA
(He M. et al, 2003).
•Il gene da “saggiare” viene amplificato mediante PCR o RT-PCR; si
inseriscono tag per la valutazione dell’espressione proteica e per l’ancoraggio
della proteina/peptide* al supporto;
•Attraverso un sistema cell-free (trascrizione e traduzione) vengono
prodotte le proteine/peptidi-tag, che si legano alla superficie tag-binding;
•Il microarray viene usato per l’analisi di interazione proteina-proteina o per
saggiare attività enzimatiche, o altro….
*Proteina/Peptide:
frammenti anticorpali; ligand-binding proteins; domini funzionali; enzimi;…..
PISA: Protein In Situ Array
(He M. et al, Curr. Opin. Biotech. 2008)
La sintesi proteica (da costrutti DNA)
avviene
direttamente
su
un
chip
“funzionalizzato”.
Le
proteine
neosintetizzate vengono legate direttamente.
Metodo cell-free:
Per la sintesi si usano lisati cellulari,
contenenti gli elementi essenziali per la
trascrizione e la traduzione (enzimi, tRNA, amminoacidi)
NAPPA: Nucleic Acid Programmable Protein Array
(Ramachandran N. et al, Science 2004)
Il DNA (plasmidi biotinilati codificanti proteine di
fusione con GST) da trascrivere/tradurre è
IMMOBILIZZATO sul chip, tramite avidina, insieme
ad ANTICORPI anti-GST.
L’aggiunta di un lisato cellulare opportuno (rabbit
reticulocyte), determina la sintesi delle proteine che
COLOCALIZZANO con il DNA sull’array.
La copresenza DNA e PROTEINE sul chip, può essere
un problema……
LIVING CELL MICROARRAY
STUDI SULLA FUNZIONE PROTEICA IN CONTESTI CELLULARI
Cellule di mammifero sono state coltivate direttamente sulla superficie
di un DNA-microarray contenente i cDNA di interesse, clonati in
vettori di espressione eucariotici.
Le cellule si sono dimostrate capaci di incorporare i DNA e di
esprimere le corrispondenti proteine.
L’esito della trasfezione è stato valutato dall’espressione della greenfluorescent protein (GFP) .
(Sabatini et al., (2001) Nature)
PROTEIN ARRAYS
ANALITICI
FUNZIONALI
analisi del livello di espressione delle
proteine (protein profiling). Si applicano
sull’array estratti proteici totali.
ESEMPI
¾ antibody arrays: anticorpi ancorati ad alta densità su una
superficie di vetro + lisati marcati → interazione antigene-anticorpo
¾ arrays per profilo anticorpi nel siero: per identificare malattie
autoimmuni e allergeni
¾ Phage Antibody-display; Ribosome display; mRNA display ………….
Antibody Microarrays
Anticorpi (o reagenti simili) che legano specifici antigeni-proteine
vengono “legati” ad alta densità su opportune superfici di vetro.
Il chip viene esposto ad un “lisato” contenente l’antigene in analisi e
quindi lavato per eliminare tutto ciò che non si lega in modo specifico.
Si procede con l’analisi:
9 Spettrometria di massa (SELDI)
9 Legame con anticorpo secondario
La produzione di anticorpi specifici è costosa!
Metodi alternativi:
fluorescenza
Phage Antibody-display; Ribosome display; mRNA display; ….
APTAMERI:
piccole
molecole
polimeriche
(in
genere
oligonucleotidi) con la capacità di riconoscere con alta affinità e
specificità determinate sequenze polipeptidiche. Possono mimare
le “proprietà di riconoscimento molecolare” degli anticorpi.
CAPTURE ARRAY and
TWO-COLOR LABELING
Tecnica messa a punto per
l’ANALISI DIFFERENZIALE:
Vengono solitamente usate sonde
fluorescenti quali Cy3 e Cy5.
Studi effettuati:
9Analisi proteomica della risposta al
trattamento ionizzante di cellule cancerose
(Streekumar et al., 2002)
9Analisi delle alterazioni cancro-specifiche
in cellule epiteliali (Knecevic et al., 2001)
9…..
ANTIBODY MICROARRAYS sono ormai diventati prodotti commerciali
DIFETTI:
Costi
Cross-reattività
Formazione di complessi multiproteici
Talvolta può essere conveniente incubare l’array con campioni
proteici pre-digeriti con specifiche proteasi
Risultati ottenuti con ANTIBODY MICROARRAYS devono sempre
essere convalidati con altri metodi alternativi
PROTEIN ARRAYS
ANALITICI
FUNZIONALI
analisi di attività-funzione di
proteine purificate e ancorate
sul supporto solido
saggi per determinare targets enzimatici
studi biochimici
Ottimizzazione della tecnica:
combinare produzione ed immobilizzazione delle proteine in un unico step
SAGGI DI ATTIVITÀ ENZIMATICA
STRATEGIA USATA PER L’IDENTIFICAZIONE DEI SUBSTRATI
DI CINASI DI LIEVITO:
9 17 potenziali substrati per
covalentemente a chip (nanowells)
cinasi
sono
stati
legati
9 Le varie cinasi (119) sono state incubate in presenza di γ-ATP
con tali substrati
9 I nanowell-chips sono stati lavati per eliminare le cinasi non
legate e il γ-ATP in eccesso
9 I substrati che sono stati fosforilati sono stati rivelati
mediante phosphoimager
Zhu et al., Nat. Genet. (2000)
AMBITI DI APPLICAZIONE DELLA TECNOLOGIA
MICROARRAY
9
9
9
9
9
Proteomica
Diagnosi di malattie e/o determinazione fattori predittivi
Scoperta nuovi farmaci
Sviluppo nuove terapie
…..
ESEMPI
• Finger Print diagnostico per la leucemia linfatica cronica.
Mediante un antibody array costituito da 60 anticorpi diretti control gli antigeni
di superficie CD (Cluster Designation), sono stati analizzati leucociti di individui
con leucemia e di individui sani. (Belov L. et al, Cancer Res 2001)
• Studi sulle proprietà antigeniche di superficie di cellule eucariotiche
Differenti linee cellulari, immobilizzate su microarray, sono state analizzate per il
legame con specifici anticorpi. (Schwenk et al. 2002)
• Analisi proteomica di cellule di carcinoma del colon prima e dopo
trattamento con radiazioni ionizzanti
Mediante antibody array (con 146 anticorpi), sono state analizzate le variazioni
di espressione di proteine tipicamente coinvolte in situazioni di stress, ciclo
cellulare e apoptosi. (Sreekumar A. et al, Cancer Res 2001)
• Screening per l’identificazione di marker tumorali
9 L’intero pull proteico (estratto da cellule a vari stadi di progressione
tumorale; anche in condizioni denaturanti) viene “stampato” sull’array, a
varie diluizioni.
9 Il microarray viene quindi testato per il legame con anticorpi specifici
diretti verso marker proteici noti.
• Screening per definire profilo anticorpi nel siero
Identificazione di malattie autoimmuni e allergeni