Transcript Lezione (11) XVIII-2. 18.05 14 Enzimi immobilizzati

Seconda Università degli Studi di Napoli
DiSTABiF
Anno Accademico 2013-14
Corso di Laurea Magistrale in
SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA
Insegnamento di
BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE
degli ALIMENTI
Prof. Augusto Parente
Lezione 18
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Cross-linkage (polimerizzazione) di molecole enzimatiche
La formazione di legami covalenti di enzimi gli uni con gli altri viene chiamata
“cross-linking”.
Si ottengono così degli aggregati di molte molecole che sono insolubili.
Le molecole si possono legare tra di loro o con una proteina di riempimento inattiva
(filler) come l’albumina.
Per il cross-linkage si usano agenti bifunzionali polimerizzanti: quello più
comunemente utilizzato è la glutaraldeide, utilizzata anche nella concia della
pelle, come disinfettante, ecc .
ENZIMI IMMOBILIZZATI
La polimerizzazione degli enzimi comporta la reazione chimica degli amminogruppi
della proteina enzimatica con la glutaraldeide, portando alla formazione di aggregati.
Enz
Enz
Enz
Enz
Enz
Un interessate impiego della glutaraldeide nella biochimica delle
proteine è nella determinazione del numero di subunità presenti in
una proteina oligomerica.
IL PRINCIPIO
In condizioni native la glutaraldeide forma ponti tra le subunità vicine.
A seconda delle condizioni sperimentali possono reagire due, tre,
quattro,……….tutte le subunità che compongono
la proteina
oligomerica.
La SDS-PAGE permette di determinare il PM delle specie formatesi.
*

*
 
GltTBc, trasportatore di Glu
da Bacillus caldotenax
LL, linker lungo
His6 tag all’N-terminale
Cross-linking con differenti concentrazioni di glutaraldeide di trasportatori batterici del
glutammato: His-GltTBc and LLGltTBc.
[GA]: 0.25 mM, pozzetti 4 and 9; 0.5 mM, pozzetti 5 and 10; 2.5 mM, pozzetti 6 and 11; e 5
mM, pozzetti 7 and 12.
Campioni di riferimento nei pozzetti 3 and 8. I marcatori di peso molecolare sono nel
pozzetto 1 and His-GltTBc è nel pozzetto 2. Le bande I, II, III, and IV
Corrispondono al monomero, dimero, trimero ed al dimero del trimero,
rispettivamente. Dinesh Yernool et al. Biochemistry 2003, 42, 12981-12988
ENZIMI IMMOBILIZZATI
PROBLEMI
Se la reazione di cross-linkage avviene correttamente, le molecole enzimatiche
possono essere legate in maniera forte ed in modo tale da mantenere la maggior
parte dell’attività enzimatica.
I problemi possono essere:
1- cambiamenti significativi nel sito attivo dell’enzima e perdita dell’attività
enzimatica durante la fase di preparazione.
2- gli aggregati possono essere gelatinosi e diventa quindi più difficile l’accesso del
substrato.
Recentemente sono stati studiati nuovi metodi di cross-linking che portano alla
formazione di cristalli.
Gli enzimi in questa forma (cross-linked enzyme crystals o CLECs) sono molto
stabili.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Per generare CLECs si devono controllare accuratamente i parametri di
cristallizzazione in modo da avere la formazione di microcristalli.
A seguito del cross-linking le proteine non sono più solubili in acqua, sono
meccanicamente stabili e facili da maneggiare.
A differenza degli enzimi immobilizzati con tecniche classiche, i CLECs mostrano
elevata attività catalitica anche ad alte temperature ed in solventi organici.
Questo perché il fissaggio delle proteine nel cristallo ed il cross-linking prevengono
la denaturazione.
Inoltre i CLECs sono stabili alla degradazione dovuta a proteasi, in quanto non sono
possibili le interazioni proteina-proteina.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Molti enzimi sono stati utilizzati con questa tecnologia.
Termolisina-CLEC che catalizza la
formazione del legame ammidico nel
precursore dell’aspartame.
Sintesi di un N-alchil-amminoacido
con subtilisina –CLEC.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Aldolasi-CLEC nella formazione
stereoselettiva di legami C-C.
Idrolisi enantioselettiva con una
lipasi-CLEC da Candida rugosa.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Incorporazione in polimeri
In questo caso l’enzima è miscelato con monomeri sintetici: durante la
polimerizzazione si forma un co-polimero nella trama tridimensionale
nel quale si alternano monomeri e molecole di enzima.
E’ una sorta di cross-linking, ma in questo caso eterogeneo.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Intrappolamento
La tecnica comporta l’inglobamento delle molecole enzimatiche entro la trama
tridimensionale di un polimero, che funge da barriera fisica alla fuoriuscita dei
biocatalizatori, che pur essendo imprigionati, conservano la propria attività e
reagiscono con i substrati che permeano attraverso i pori del polimero
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Nell’intrappolamento in gel la forma finale del polimero è spesso quella di uno strato
relativamente sottile, simile a un foglio di un cilindro).
Questo metodo di intrappolamento è molto blando ed applicabile anche alle cellule.
Per l’agar, ad esempio, si fa sgocciolare una miscela di cellule sospese in una soluzione
calda di agar (40°C), dentro una soluzione tampone a 0°C.
Il maggior difetto di queste matrici è la loro instabilità a cambi di temperatura e di
intorno ionico e la loro instabilità meccanica.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Per l’intrappolamento in fibre, l’intrappolamento fisico dell’enzima viene ottenuto
sciogliendo il polimero che formerà la fibra (ad es., triacetato di cellulosa) in un
solvente organico non miscibile in acqua (cloroformio, metilencloruro) ed
emulsionando questa soluzione con una soluzione acquosa dell’enzima.
Per estrazione, si ottiene poi il polimero precipitato in forma filamentosa, con gocce di
soluzione enzimatica intrappolate nella fibra.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Nella microincapsulazione l’inglobamento avviene all’interno di micelle che si
formano, sotto agitazione, aggiungendo un polimero disciolto in solvente organico ad
una sospensione enzimatica contenente un detergente, in grado di diminuire la
tensione superficiale e agevolare la formazione delle microcapsule
Se l’acqua è presente in piccole
gocce che sono circondate dal
sapone, la struttura totale è
circondata dal solvente organico e
rappresenta una micella inversa.
Quando l’acqua costituisce la fase
principale, le micelle possono
essere formate da un doppio strato
di detergente.
Questa struttura è detta vescicola.
Gli enzimi si accomodano in questa “piscina d’acqua” e mantengono la loro attività.
Lo scambio tra una micella e l’altra avviene per contatto ed è un processo molto
veloce.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
VANTAGGI e SVANTAGGI della INCORPORAZIONE IN POLIMERI
VANTAGGI
• Semplicità operativa
• Basso costo
• Ridotte perdite di enzima
• Aumento della stabilità conformazionale
SVANTAGGI:
• La trama tridimensionale dei polimeri non è perfettamente ripetibile nei
suoi vari punti: i pori hanno dimensioni differenti e questo può determinare
un lento rilascio proteico nel tempo;
• Fibre, gel e microcapsule sono sensibili alle condizioni operative, quali
agitazione, pH;
• Denaturazione degli enzimi per esposizione a solventi organici;
• Introduzione di resistenze al trasporto del substrato
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Immobilizzazione dei cofattori
Tutte le tecniche fin qui discusse possono essere utilizzate per enzimi che non
necessitano di cofattori e per quelli in cui i cofattori sono saldamente legati.
Alcuni enzimi dipendono dai cofattori che facilmente si dissociano nel mezzo e in
questo caso il cofattore deve essere immobilizzato per poter far funzionare il
sistema di riciclo.
Il problema si può risolvere in due
modi:
1.
Il cofattore può essere legato alla
superficie dell’enzima crosslinked ;
2.
Il cofattore può essere attaccato
al carrier macroscopico.
In ciascun caso è necessario che il braccio spaziatore sia sufficientemente lungo
per poter raggiungere l’enzima 1 che dà la reazione e l’enzima 2 che permette il
riciclo.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Cross-linking
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Intrappolamento
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Effetti dell’immobilizzazione sulle proprietà dell’enzima
L’immobilizzazione può modificare la cinetica ed altre proprietà degli enzimi,
rispetto al loro comportamento in soluzione, che possono essere causati da:
1. Effetti conformazionali  si possono verificare cambiamenti nella struttura 3D
in seguito a modificazioni di residui amminoacidici che alterano la carica e/o la
geometria del sito attivo;
2. Effetti sterici  l’immobilizzazione limita gli eventuali cambiamenti
conformazionali indotti dall’interazione enzima-substrato e l’interazione con il
substrato può essere inibita da ingombro sterico;
3.
Effetti di ripartizione  si possono instaurare interazioni elettrostatiche o
idrofobiche tra la matrice e le specie a basso peso molecolare in soluzione,
che portano a modificazioni del microambiente in cui avviene la catalisi
4.
Effetti di trasferimento di massa e diffusionali  sono dovuti alle difficoltà
del substrato di diffondere dalla soluzione al sito attivo dell’enzima e da
problemi di diffusione del prodotto una volta avvenuta la catalisi;
5. Modificazione della KM  l’affinità dell’enzima per il substrato può aumentare
o diminuire
ENZIMI IMMOBILIZZATI
A causa degli effetti descritti, spesso i parametri cinetici degli enzimi immobilizzati
risultano diversi da quelli degli enzimi in forma libera.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Esempi di applicazioni
Uno dei processi per via enzimatica condotti su scala industriale che hanno conosciuto
maggiore successo è quello per la produzione di uno sciroppo ad elevato contenuto in
fruttosio, mediante isomerizzazione del glucosio. Il prodotto che si ottiene ha un
potere dolcificante analogo (>) a quello dello sciroppo di glucosio e ha trovato largo
impiego nel settore delle bevande, degli alimenti e dei dolci.
La glucosio isomerasi è l’enzima che
catalizza la conversione di glucosio in
fruttosio. E’ un enzima intracellulare
abbastanza stabile; la necessità di estrarlo
da cellule lo rende più costoso di altri
enzimi extra-cellulari.
Può
essere
ricavato
Saccharomyces cerevisiae.
dal
fungo
Saccaromices cereviciae.
Una delle più interessanti applicazioni industriali degli enzimi immobilizzati per la
catalisi enzimatica riguarda la separazione di miscele racemiche, processo messo a
punto negli anni ’70.
La reazione sulla quale il processo si basa è catalizzata dall’enzima amminoacilasi e
segue il seguente schema:
L’enzima è in grado di idrolizzare selettivamente solo l’isomero L. La miscela di
amminoacidi liberi e acilati può essere ora facilmente separata sulla base della
diversa solubilità dei due composti.
L’acil-amminoacido D viene quindi nuovamente racemizzato per riscaldamento e
riciclato all’inizio del processo.
L’enzima viene solitamente immobilizzato su una matrice DEAE-Sephadex, che
manifesta proprietà di elevata attività, di facile preparazione e rigenerazione e di
grande stabilità.