Mercodia Insulin ELISA

Instruzioni per l’uso

Nota bene

I valori di concentrazione dei calibratori possono variare da lotto a lotto

10-1113-01 REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI 10-1113-10 REAGENTI PER 10 X 96 RILEVAZIONI

Per l’uso diagnostico in vitro

Prodotto da Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A SE-754 50 Uppsala Svezia

SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE

∑

= 96

Reagenti per 96 rilevazioni Data di scadenza Conservare tra i 2–8° C Lotto n.

Per l’uso diagnostico in vitro

© Mercodia 2008-2014

USO PROPOSTO

Mercodia Insulin ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa dell’insulina umana nel siero o nel plasma.

RELAZIONE E SPIEGAZIONE DEL TEST

L’insulina è il principale ormone responsabile del controllo di glucosio nel metabolismo. E’ sinte tizzata nelle cellule delle isolette di Langerhans come il precursore, proinsulina, che è elaborato per formare la peptide C e l’insulina. Entrambi sono secreti in una somma equimolare nel por tale della circolazione. La molecola matura dell’insulina comprende due catene di polipeptide, la catena A e la catena B (rispettivamente 21 e 30). Le due catene sono legate insieme da due ponti concatenati disulfidici. C’è anche un ponte disulfidico intercatenato nella catena A.

La secrezione dell’insulina è principalmente controllata dalla concentrazione di glucosio nel plasma, e l’ormone ha un significante numero di azioni metaboliche. La sua funzione principale è di controllare il condotto e l’utilizzazione del glucosio nei tessuti periferici tramite il vettore di glucosio. Questa e le altre attività ipoglicemiche, per esempio l’inibizione di glicogenesi e glico genolisi sono mitigate dagli ormoni iperglicemici inclusi il glucagone, l’epinefrina (adrenalina), la crescita degli ormoni e cortisolo.

Le concentrazioni di insulina sono ridotte drasticamente nei pazienti di diabete melito insu lina dipendenti (IDDM) e in altre condizioni come l’ipopituitarismo. I livelli di insulina sono au mentati nei pazienti di diabete melito non insulina dipendenti (NIDDM), di obesità, insulinoma e alcune disfunzioni endocrine come la sindrome di Cushing e l’acromegalia.

PRINCIPIO DI PROCEDURA

Mercodia Insulin ELISA, è una fase concreta dell’immunoanalisi enzima due-sito.E’ basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla molecola insulina.

Durante l’incubazione la insulina presente nel campione reagisce con gli anticorpi antiinsu lina coniugati a perossidasi e gli anticorpi anti-insulina legati al pozetto per microtitolazione.

Un leggero lavaggio rimuovi indirettamente l’anticorpo Enzyme marcato. Il Conjugate diretto è scoperto dalla reazione con 3,3’,5,5’ – tetrametibenzidine (TMB). La reazione è fermata aggiungendo acido per dare una posizione estrema colorimetrica che è letta spettrometrica mente.

PREACAUZIONI E AVVISI

• Per l’uso diagnostico in vitro. • I contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con animali ruminanti o suini.

• • • La Stop Solution in questo kit contiene 0.5 M H 2 SO 4 . Seguire le precauzioni quotidiane di routine per maneggiare sostanze chimiche pericolose.

Tutti i presi come campione potrebbero essere trattati come capaci di trasmettere in fezioni.

Ciascun pozzetto può essere usato una sola volta 3

MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI

• Pipette con volumi adeguati (riutilizza le pipette in dotazione per l’aggiunta della Assay Buffer, soluzione enzima coniugato 1X , Substrate TMB e Stop Solution) • Provette, becher e cilindri per la preparazione di reagenti • Acqua ridistillata • Agitatore magnetico • Miscelatore di vortice • Lettore micro piastra (450 nm filtro) • Piastra dello shaker (700-900 giri/minuto, movimiento orbital) • Micro piastra piano di lavaggio con la funzione traboccare-lavare (consigliato ma non obbligatorio)

REAGENTI 1 X 96

Ogni kit Mercodia Insulin ELISA (10-1113-01) contiene reagenti per 96 prove, sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato. Per diverse serie di analisi, usare reagenti prove nienti da scatole portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita sull’etichetta all’esterno. Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2–8° C.

Coated Plate

Topo monoclonale anti insulina timane.

1 piastra 96 pozzetti 8 strips per pozzetti Pronti per l’uso I pozzetti delle micro piastre inutilizzati, devono essere risigillati e adoperati entro 8 set 1000 µL Pronto all´uso

Calibrators 1, 2, 3, 4, 5

5 fiale Ricombinante dell’insulina umana Giallo colore codificato Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala

Calibrator 0

Giallo colore codificato 1 fiala 5 mL Pronto all´uso

Enzyme Conjugate 11X Wash Buffer 21X

Conservare dopo la diluizione: 2–8° C per 8 settimane. 1 fiala

Enzyme Conjugate Buffer

Blu colore codificato 1 fiala 1 bottiglia 1.2 mL Peroxidase Conjugate topo monoclonale anti insulina 12 mL 50 mL Per la preparazione vedi sotto Pronto all´uso Diluire con 1000 mL d’acqua ridistillata per fare di soluzione wash buffer 1X.

Substrate TMB

Soluzione incolore Nota! Sensibile alla luce!

Stop Solution

0.5 M H 2 SO 4 1 bottiglia 1 fiala 22 mL 7 mL Pronto all´uso Pronto all´uso 4

Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X

Preparare la quantità necessaria della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione dell’En zyme Conjugate 11X (1+10) nell’Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante. Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra, versare tutto il tam pone Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 11X. Mescolare lievemente. Usare entro un giorno.

Numero di strisce Enzyme Conjugate 11X Enzyme Conjugate Buffer 12 strisce 8 strisce 4 strisce 1 fiala 700 µL 350 µL 1 fiala 7.0 mL 3.5 mL

REAGENTI 10 X 96

Ogni kit Mercodia Insulin ELISA (10-1113-10) contiene reagenti per 10 x 96 prove, sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato. Per diverse serie di analisi, usare reagent iprovenienti da scatole portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita sull’etichetta all’esterno. Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2–8° C.

Coated Plate

Topo monoclonale anti insulina timane.

10 piastra 96 pozzetti 8 strips per pozzetti Pronti per l’uso I pozzetti delle micro piastre inutilizzati, devono essere risigillati e adoperati entro 8 set-

Calibrators 1, 2, 3, 4, 5

5 fiale Ricombinante dell’insulina umana Giallo colore codificato Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala

Calibrator 0

Giallo colore codificato 1 fiala 1000 µL 5 mL Pronto all´uso Pronto all´uso

Enzyme Conjugate 11X

Peroxidase Conjugate topo monoclonale anti insulina

Enzyme Conjugate Buffer

Blu colore codificato

Wash Buffer 21X

1 fiala 1 bottiglia 2 bottiglie 12 mL 120 mL 200 mL Per la preparazione vedi sotto Pronto all´uso Per la preparazione vedi sotto

Substrate TMB

Soluzione incolore Nota! Sensibile alla luce!

Stop Solution

0.5 M H 2 SO 4 1 bottiglia 1 bottiglia 220 mL 70 mL Pronto all´uso Pronto all´uso 5

Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X

Preparare la quantitá necessaria della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione dell’Enzyme Conjugate 11X (1+10) nel Enzyme Conugate Buffer in base alla tabella sottostante. Mescolare lievemente. Usare entro un giorno.

Numero di piastra 10 piastra 5 piastra 3 piastra 2 piastra 1 piastra Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 5.0 mL 3.0 mL 2.0 mL 1.0 mL Enzyme Conjugate Buffer 1 bottiglia 50 mL 30 mL 20 mL 10 mL

Preparazione di soluzione wash buffer 1X

Preparare la quantitá necessaria il tampone di lavaggio con la diluizione del Wash Buffer 21X in acqua ridistillata (1+20) in base alla tabella sottostante. Mescolare icompletamente.

Numero di piastra Wash Buffer 21X Acqua ridistillata 10 piastra 5 piastra 3 piastra 2 piastra 1 piastra 2 bottiglie 180 mL 110 mL 70 mL 35 mL 8000 mL 3600 mL 2200 mL 1400 mL 700 mL Conservazione dopo la diluizione: temperatura tra 2-8 ° C per 8 settimane.

LA RACCOLTA E IL TRATTAMENTO DEL MODELLO Il siero

Il prelievo in vena di sangue, permette di coagulare, e separare il siero con la centrifugazione. I campioni possono essere conservati a 2–8°C fino a 24 ore. Per periodo più lunghi, conservare i campioni a –20°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento.

Plasma

Prelevare il sangue direttamente in vena in provette contenenti eparina o EDTA come anticoa gulante, e separare la frazione del plasma. I campioni possono essere conservati a 2–8°C fino a 24 ore. Per periodi più lunghi conservare i campioni a –20°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento.

Preparazione dei campioni

La diluzione non è normalmente richiesta, comonque, i campione contenti >200 mU/L doreb bero essere diluiti 1+9 v/v con Calibrator 0.

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PROCEDURA DEL TEST

Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. Preparare una calibratura curva per ciascuna serie di analisi.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Preparare la soluzione enzyme conjugate 1X e di soluzione wash buffer 1X.

Preparare sufficiente pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators, controlli e cam pione in duplice copia.

Pipette 25 µL per ogni Calibrators, controlli e campioni in appropriati pozzetti.

Aggiungere 100 µL della soluzione enzyme conjugate 1X per ogni pozzetto.

Mettere in incubatrice in una piastra shaker (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente (18-25°C). Lavare 6 volte con 700 µL di soluzione wash buffer 1X per pozzetto usando un lavatore automatico per piastre con la funzione traboccare-lavare. Dopo il lavaggio finale, capovol gere la piastra e picchiettarla con decisione contro della carta assorbente. Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione.

O manualmente, Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo. Aggiungere 350 µL di soluzione wash buffer 1X ad ogni pozzetto. Eliminare la soluzione wash buffer 1X, sbattere con forza diverse volte contro carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. Ripetere 5 volte. Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura di lavaggio. Aggiungere 200 µL Substrate TMB.

Mettere in incubatrice per 15 minuti a temperatura ambiente (18-25° C).

Aggiungere 50 µL Stop Solution ad ogni pozzetto. Mettere la piastra in uno shaker per approssimativamente per 5 secondi per garantire la miscelazione.

Leggere l’assorbività a 450 nm e calcolare i risultati. Leggere entro 30 minuti.

Nota! Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate pi pette distinte.

CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO

I controlli comerciali tale com Mercodia Diabetes Antigen Control (10-1134-01/10-1164-01) e/o il siero interno da diversi donatori con basse, intermide e alte concentazioni di insulina dovreb bero essere analizzate periodicamente come se fossero esterne, e i risultati tracciati di giorno in giorno. E’ buona norma di un laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi: un certo numero di kit, date di diluizione e/o ricostituzione dei componenti del kit, i valori di OD per il modulo, Calibrators e controlli.

I laboratori dovrebbero seguire le norme governative o i requisiti di accreditamento per la frequenza dei controlli di qualità.

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IL CALCOLO DEI RISULTATI Calcolo computerizzato

La riduzione dei dati computerizzati dell´assorbenza per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0, verso la concentrazione usando un regressione cubica flessibile potrebbe essere errettuata per ottenere la concentrazione di insulina.

Calcolo manuale

1.

CALCULATION OF RESULTS Computerized calculation

Tracciare i valori di assorbanza ottenuti per i Calibrators 1-5, etto il Calibratore 0, contro la concentrazione di adiponectina su carta log-log e costruire una curva di calibrazione.

2. Leggere la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla calibratura curva.

Manual calculation

Risultati ottenuti

Pozzeti Identità A 450 Conc. princ. mU/L 1 A-B 2 C-D 3 E-F 4 G-H 2 A-B 2 C-D 2 E-F 2 G-H 3 A-B 2 C–D 2 E–F Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Calibrator 5* Incognita 1 Incognita 2 Incognita 3 Unknown 1 0.070/0.071

0.105/0.106

0.202/0.204

0.434/0.470

1.348/1.351

2.451/2.476

0.222/0.214

0.546/0.538

1.941/1.978

0.222/0.214

Mean conc. mU/l 11.1

35.6

153 11.1

2 G–H 3 A–B Unknown 2 Unknown 3 Una calibratura rappresentativa è mostrata qui. Non usare questa curva per determinare i risul-

Example of calibrator curve

0.546/0.538

1.941/1.978

35.6

153 A typical calibrator curve is shown here. Do not use this curve to determine actual assay results.

1,00 0,10 8 10 0,01 1 10 Insulina (mU/L) Insulin (mU/l) 100 1000

IL FATTORE DI CONVERSIONE

1 µg/L = 23 mU/L; 1 mU/L = 6.0 pmol/L

LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA

Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere basata sui risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere fatto medico dopo averne valutate le conclusioni cliniche.

L’applicazione di questo test su individui già sottoposti a terapie di insulina è ostacolato dalla formazione di anticorpi anti-insulina, in grado di interferire nell’analisi.

Grossolanamente campioni lipemic, itterico o hemolysed non interferiscono nell’analisi.Tut tavia, l’emolisi nel siero o nel plasma potrebbe dare luogo ad una degradazione dell’insulina con conseguenti valori falsamente bassi e un’alta variabilità interserie. La degradazione può dipendere dal tempo, dalla temperatura e dalla concentrazione dell’emoglobina. Per evitare la degradazione dell’insulina, conservare i campioni emolizzati a basse temperature o in ghiaccio.

Distinte pipette dovrebbero essere utilizzate quando si dispensano il coniugato ed il substrato

VALORI PREVISTI

E’ buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di presunti valori. I seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il laboratorio abbia raccolto dati suf ficienti del tutto suoi. I livelli di digiuno per 137 esaminati, individui apparentemente sani, hanno reso un media di 9.2 mU/L, una mediana di 6.9 mU/L e una serie corrispondente al centrale 95% delle osservazioni dei 2–25 mU/L.

CARATTERISTICHE E ESECUZIONE Il limite della scoperta

Il limite di rivelabilità è definito come la Capacità di Rivelazione in base alla ISO11843-Parte 1.

La Capacità di Rivelazione deve essere considerata parte di un metodo di verifica, piuttosto che la concentrazione minima misurabile. Il limite di rilevabilità è 1 mU/L come determinato dalla metodologia descritta nella ISO11843- Parte 4.

La concentrazione dei campioni con assorbanza inferiore al Calibrator 1 non devono essere calcolati, maespresse come minori o uguali ( ≤ ) rispetto alla concentrazione indicata sulla fiala per il Ca librator 1.

Recupero

Il recupero sull’aggiunta è 94–113% (media 104%).

Il recupero alla diluizione è 101 – 110% (media 106%).

Hook effect

I campioni con una concentrazione sopra i 30 000 mU/L può essere analizzata senza dare falsamente bassi risultati .

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Precisione

Ogni campione è stato analizzato su 6 riprodotti in 6 diversi momenti.

Campioni Valore principale mU/L Nell’ analisi % Coefficiente di variazione Fra analisi % Totale analisi % 1 2 3 4 11 36 80 154 3.4

4.0

2.8

3.2

3.6

2.6

2.8

2.9

5.0

4.7

4.0

4.4

Specificità

Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali: C-peptide <0.01% Proinsulina Proinsulina des (31-32) Proinsulina split (32-33) Proinsulina des (64-65) Proinsulina split (65-66) Insulin aspart Insulin detemir Insulin glargine Insulin glulisine Insulin lispro IGF-I IGF-II Insulina di ratta Insulina di topo Insulina di porcino Insulina di ovino Insulina di bovino <0.01% <0.5% <0.5% 98% 56% 3.2 % <0.0000007% 19% <0.000003% <0.000003% <0.02% <0.02% 0.7% 0.3% 374% 48% 31%

CALIBRATURA

Il kit specifico Mercodia Insulin ELISA è calibrato contro i Riferimenti 1 st International Reference Preparation 66/304.

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GARANZIA

I dati dei rendimenti presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere ef fetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse, implicite o fissate, inclusa la garanzia implicita per l’uso commerciale e appropriato.

Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non sarà soggetto a danni indiretti o consequenziali

RIFERIMENTI

Gaines-Das RE and Bristow AF (1988) WHO International reference reagents for human proin sulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186. Lindstrom T, Hedman CA and Arnqvist HJ (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054. Riserus U, Vessby B, Arner P and Zethelius B (2004) Supplementation with trans10cis12-conju gated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019. Rudovich NN, Rochlitz HJ and Pfeiffer AF (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359 2365. Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L and Lonnroth P (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748.

Ulteriori riferimenti sono disponibili sulla nostra pagina web: www.mercodia.com

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PROTOCOLLO DI SINTESI Mercodia Insulin ELISA

Aggiungere Calibrators, controlli* e campioni Aggiungere la soluzione enzyme conjugate 1X Incubazione Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X Aggiungere Substrate TMB Incubazione Aggiungere Stop Solution Misura A 450 25 µL 100 µL 1 ora a 18–25°C in una piastra shaker, 700-900 rpm 700 µL, 6 volte 200 µL 15 minuti (18-25°C) 50 µL Scuotere per 5 secondi per assi curarsi che sia tutto mescolato Valutare i risultati *Non forniti Per tutti i dettagli vedere a pagina 7 31-3107 Version 10.0