Nuove prospettive terapeutiche per la sindrome X fragile

Elisabetta Tabolacci

Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma

La sindrome X fragile

Regolazione epigenetica del gene

FMR1

5-azadC UFM

Trattamenti

in vitro

con 5-azadC

RT-PCR:

FMR1

-mRNA qRT-PCR - + - + - + - + - + C C Immunocitochimica: FMRP untreated treated control Chiurazzi et al., 1998 FXS

MBD MBD MBD MBD

FXS+5-azadC Ac Ac

MBD

Ac Ac

MBD

Non metilato Metilato K4 K9 CpG K4 K9 CpG Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Tabolacci et al., 2005 Analisi dello stato di metilazione delle 52 CpG del promotore Pietrobono et al., 2002

WT NT

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45

WT 7gg AZA

Effetto a lungo termine ed

68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50

49 48 47 46 45

effetto selettivo della 5-azadC

UFM NT

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45

Analisi dello stato di metilazione del DNA UFM 7gg AZA della regione genomica a monte del promotore di

FMR1

FXS

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69

68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50

49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68

67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50

49 48 47 46 45

qRT-PCR

L’effetto della 5-azadC sembra persistere fino a circa 15 giorni dalla sospensione del trattamento e la sua azione non è aspecifica.

E3 NT

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45

E3 7gg AZA MS-MLPA del locus

PWS/AS

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45

NT S1 NT T1

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45

S1 7gg AZA T4

82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45

T8 NT T1 T3 WT FXS Lanni et al., poster P044 SIGU 2012

Trattamenti con farmaci iperacetilanti istonici

Livelli relativi di riattivazione di

FMR1

dopo 4-PBA, TSA e 5-azadC RT-PCR dei trattamenti sinergici con 4 PBA e 5-azadC

Gli inibitori di HDAC (4-PBA e TSA) da soli non riattivano

FMR1

, ma necessitano di una demetilazione del DNA indotta dalla 5-azadC (effetto sinergico).

Chiurazzi et al. 1999

Trattamenti

in vitro

e

in vivo

con ALC

FXS

MBD MBD MBD MBD MBD MBD

FXS+ALC

MBD

Ac

MBD

Ac

MBD

Ac

MBD

Ac Ac

MBD

Ac

MBD

 metilazione del DNA  iperacetilazione di H3 e H4  metilazione di H3-K9 Tabolacci et al., 2005 Torrioli et al., 2008

In vitro

la ALC è un iperacetilante istonico e non riattiva

FMR1

;

in vivo

può ridurre l’iperattività nei bambini FXS.

FXS

MBD MBD

Trattamenti

in vitro

e

in vivo

con VPA

MBD MBD MBD MBD

FXS+VPA Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac  metilazione del DNA  aumento acetilazione H3 e H4  aumento metilazione H3-K4  riduzione metilazione H3-K9 Tabolacci et al., 2008 Ac Ac

CONNERS OPPOSITIONAL

NS P = 0.14

80 75 70 65 60 55 50 80 75 70 65 60 55 50 80 75 70 65 60 55 50 CONNERS HYPERACTIVITY

P = 0.03

CONNERS ADHD

P = 0.11

80 75 70 65 60 55 50

Torrioli et al., 2010

In vitro

il iperacetilante VPA è istonico un e riattiva parzialmente

FMR1

, senza demetilare il DNA ;

in vivo

può ridurre l’iperattività nei bambini FXS.

Mutazione completa non metilata (UFM)

Mutazione completa metilata (FXS)

Non metilato K4 K9 CpG Metilato K4 K9 CpG

MBD MBD MBD MBD MBD MBD + 5-azadC

Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac  demetilazione del DNA  aumento acetilazione H3 e H4  aumento metilazione H3-K4 Ac Ac Ac Ac

Mutazione completa non metilata (UFM)

Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac  DNA non metilato  H3 e H4 acetilati  H3-K4 e H3-K9 metilati Ac Ac Ac

Normale

Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Pietrobono et al. 2005; Tabolacci et al., 2008

La teoria dei mGluR

Strategie terapeutiche per la FXS

Levenga et al., 2010

AFQ056: inibitore selettivo dei mGluR5

Untreated

Fmr1

KO

Levenga et al., 2011 Gantois et al., Behav Brain Res, 2012 Berg et al., Mov Disord, 2011

Sci Transl Med, 2011

SCOPO DELLO STUDIO

: studiare se il blocco dei mGluR5 con l’AFQ056 migliora i sintomi comportamentali in pazienti FXS.

PAZIENTI

: 30 ragazzi FXS di 18-35 anni di età

ENDPOINTS

: ABC-C score, Clinical Global Impression-Improvement (CGI-I), Clinical Global Impression (CGI).

Durata del trattamento: 28 giorni

Risposta dei singoli pazienti al trattamento con AFQ056 e placebo con la scala ABC-C a 19-20 giorni, raggruppati in base allo stato di metilazione del promotore di

FMR1

.

Full methylation at

FMR1

promoter Partial methylation at

FMR1

promoter

Obiettivo del lavoro Valutare il possibile ruolo epigenetico di AFQ056 in linee cellulari linfoblastoidi Materiali e Metodi

Linea cellulare linfoblastoide

E3 S1 MP

Numero di CGG

250 450 100-960

Quattro concentrazioni: - 1, 10, 100 e 1000 μM di AFQ056 - 1 μM di 5-azadC (controllo positivo) Due tempi: 3 e 8 giorni - mock (diluente)

Tabolacci et al., 2012

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Risultati

Quantificazione di

FMR1

-mRNA mediante qRT-PCR Wild type (WT)

NT Mock AFQ056 1µM 3 gg AFQ056 10µM 3 gg AFQ056 100µM 3 gg AFQ056 1mM 3 gg 5-azadC 1µM 3 gg AFQ056 1µM 8 gg AFQ056 10µM 8 gg AFQ056 100µM 8 gg AFQ056 1mM 8 gg 5-azadC 1µM 8 gg 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

S1 E3 MP

0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

L’AFQ056 non determina riattivazione trascrizionale del gene

FMR1

.

Wild type FXS non trattato Analisi dello stato di metilazione delle 52 citosine metilabili del promotore di

FMR1

mediante sequenziamento diretto previa trasformazione del DNA con bisolfito di sodio FXS trattato L’AFQ056 non ha effetto sulla metilazione del DNA a livello del promotore di

FMR1

.

Conclusioni

L’effetto benefico dell’AFQ056

in vivo

non è correlato alla riattivazione trascrizionale del gene

FMR1

e alla demetilazione del suo promotore. Tale effetto è apprezzabile solo nei pazienti in cui vi è totale assenza di proteina FMRP, come nei portatori di mutazione completa totalmente metilata. Nei portatori di mutazione completa parzialmente metilata questo effetto non è così evidente a causa di un compenso funzionale della quota residua di FMRP.