Transcript Elisabetta Tabolacci - Presentazione del Congresso
Nuove prospettive terapeutiche per la sindrome X fragile
Elisabetta Tabolacci
Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
La sindrome X fragile
Regolazione epigenetica del gene
FMR1
5-azadC UFM
Trattamenti
in vitro
con 5-azadC
RT-PCR:
FMR1
-mRNA qRT-PCR - + - + - + - + - + C C Immunocitochimica: FMRP untreated treated control Chiurazzi et al., 1998 FXS
MBD MBD MBD MBD
FXS+5-azadC Ac Ac
MBD
Ac Ac
MBD
Non metilato Metilato K4 K9 CpG K4 K9 CpG Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Tabolacci et al., 2005 Analisi dello stato di metilazione delle 52 CpG del promotore Pietrobono et al., 2002
WT NT
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
WT 7gg AZA
Effetto a lungo termine ed
68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50
49 48 47 46 45
effetto selettivo della 5-azadC
UFM NT
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
Analisi dello stato di metilazione del DNA UFM 7gg AZA della regione genomica a monte del promotore di
FMR1
FXS
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69
68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50
49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68
67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50
49 48 47 46 45
qRT-PCR
L’effetto della 5-azadC sembra persistere fino a circa 15 giorni dalla sospensione del trattamento e la sua azione non è aspecifica.
E3 NT
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
E3 7gg AZA MS-MLPA del locus
PWS/AS
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
NT S1 NT T1
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
S1 7gg AZA T4
82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
T8 NT T1 T3 WT FXS Lanni et al., poster P044 SIGU 2012
Trattamenti con farmaci iperacetilanti istonici
Livelli relativi di riattivazione di
FMR1
dopo 4-PBA, TSA e 5-azadC RT-PCR dei trattamenti sinergici con 4 PBA e 5-azadC
Gli inibitori di HDAC (4-PBA e TSA) da soli non riattivano
FMR1
, ma necessitano di una demetilazione del DNA indotta dalla 5-azadC (effetto sinergico).
Chiurazzi et al. 1999
Trattamenti
in vitro
e
in vivo
con ALC
FXS
MBD MBD MBD MBD MBD MBD
FXS+ALC
MBD
Ac
MBD
Ac
MBD
Ac
MBD
Ac Ac
MBD
Ac
MBD
metilazione del DNA iperacetilazione di H3 e H4 metilazione di H3-K9 Tabolacci et al., 2005 Torrioli et al., 2008
In vitro
la ALC è un iperacetilante istonico e non riattiva
FMR1
;
in vivo
può ridurre l’iperattività nei bambini FXS.
FXS
MBD MBD
Trattamenti
in vitro
e
in vivo
con VPA
MBD MBD MBD MBD
FXS+VPA Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac metilazione del DNA aumento acetilazione H3 e H4 aumento metilazione H3-K4 riduzione metilazione H3-K9 Tabolacci et al., 2008 Ac Ac
CONNERS OPPOSITIONAL
NS P = 0.14
80 75 70 65 60 55 50 80 75 70 65 60 55 50 80 75 70 65 60 55 50 CONNERS HYPERACTIVITY
P = 0.03
CONNERS ADHD
P = 0.11
80 75 70 65 60 55 50
Torrioli et al., 2010
In vitro
il iperacetilante VPA è istonico un e riattiva parzialmente
FMR1
, senza demetilare il DNA ;
in vivo
può ridurre l’iperattività nei bambini FXS.
Mutazione completa non metilata (UFM)
Mutazione completa metilata (FXS)
Non metilato K4 K9 CpG Metilato K4 K9 CpG
MBD MBD MBD MBD MBD MBD + 5-azadC
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac demetilazione del DNA aumento acetilazione H3 e H4 aumento metilazione H3-K4 Ac Ac Ac Ac
Mutazione completa non metilata (UFM)
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac DNA non metilato H3 e H4 acetilati H3-K4 e H3-K9 metilati Ac Ac Ac
Normale
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Pietrobono et al. 2005; Tabolacci et al., 2008
La teoria dei mGluR
Strategie terapeutiche per la FXS
Levenga et al., 2010
AFQ056: inibitore selettivo dei mGluR5
Untreated
Fmr1
KO
Levenga et al., 2011 Gantois et al., Behav Brain Res, 2012 Berg et al., Mov Disord, 2011
Sci Transl Med, 2011
SCOPO DELLO STUDIO
: studiare se il blocco dei mGluR5 con l’AFQ056 migliora i sintomi comportamentali in pazienti FXS.
PAZIENTI
: 30 ragazzi FXS di 18-35 anni di età
ENDPOINTS
: ABC-C score, Clinical Global Impression-Improvement (CGI-I), Clinical Global Impression (CGI).
Durata del trattamento: 28 giorni
Risposta dei singoli pazienti al trattamento con AFQ056 e placebo con la scala ABC-C a 19-20 giorni, raggruppati in base allo stato di metilazione del promotore di
FMR1
.
Full methylation at
FMR1
promoter Partial methylation at
FMR1
promoter
Obiettivo del lavoro Valutare il possibile ruolo epigenetico di AFQ056 in linee cellulari linfoblastoidi Materiali e Metodi
Linea cellulare linfoblastoide
E3 S1 MP
Numero di CGG
250 450 100-960
Quattro concentrazioni: - 1, 10, 100 e 1000 μM di AFQ056 - 1 μM di 5-azadC (controllo positivo) Due tempi: 3 e 8 giorni - mock (diluente)
Tabolacci et al., 2012
0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Risultati
Quantificazione di
FMR1
-mRNA mediante qRT-PCR Wild type (WT)
NT Mock AFQ056 1µM 3 gg AFQ056 10µM 3 gg AFQ056 100µM 3 gg AFQ056 1mM 3 gg 5-azadC 1µM 3 gg AFQ056 1µM 8 gg AFQ056 10µM 8 gg AFQ056 100µM 8 gg AFQ056 1mM 8 gg 5-azadC 1µM 8 gg 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
S1 E3 MP
0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
L’AFQ056 non determina riattivazione trascrizionale del gene
FMR1
.
Wild type FXS non trattato Analisi dello stato di metilazione delle 52 citosine metilabili del promotore di
FMR1
mediante sequenziamento diretto previa trasformazione del DNA con bisolfito di sodio FXS trattato L’AFQ056 non ha effetto sulla metilazione del DNA a livello del promotore di
FMR1
.
Conclusioni
L’effetto benefico dell’AFQ056
in vivo
non è correlato alla riattivazione trascrizionale del gene
FMR1
e alla demetilazione del suo promotore. Tale effetto è apprezzabile solo nei pazienti in cui vi è totale assenza di proteina FMRP, come nei portatori di mutazione completa totalmente metilata. Nei portatori di mutazione completa parzialmente metilata questo effetto non è così evidente a causa di un compenso funzionale della quota residua di FMRP.