Il genoma contiene tutte le istruzioni che permettono di ottenere oltre 200 differenti tipi cellulari il cui processo di specificazione viene denominato

epigenesi

. È ora noto che tale processo coinvolge la regolazione differenziale di geni e dei loro prodotti in stretta relazione con l’organizzazione fisica del DNA genomico e da come è impacchettato in cromatina. Regolazione aberrante dei meccanismi epigenetici è stata correlata a malattie croniche, cancro, malattie cardiovascolari, disordini mentali anche in risposta a stimoli ambientali.

Perché interessarcene?

• • • • Cancro: modifiche epigenetiche possono spiegare come i fattori ambientali scatenino il cancro Cambiamenti Prenatali: modifiche molecolari al DNA fetali e materno prima della nascita possono rendere il nascituro suscettibile al diabete di tipo 2 Disordini Mentali: cambiamenti epigenetici sono stati correlati a malattie come Alzheimer, schizofrenia, autismo Malattie Croniche: condizioni croniche come il lupus eritematoso sistemico o l’asma hanno una componente ambientale che può causare cambiamenti epigenetici che a loro volta possono interessare la progressione della malattia

Epigenetics and epigenomics

In eukaryotic cells, the DNA is packaged within the nucleus in a structure called chromatin. This structure is a highly dynamic nucleoprotein complex that plays a central role in regulating how and when DNA is copied and transcribed into RNA. Thus chromatin states vary from cell type to cell type and along chromosomes. Typically, a multi-cellular organism will be characterized by one genome, but by as many epigenomes as there are cell types.

Epigenetics encompasses all processes that lead to heritable changes in gene expression (during development or across generations) without changes in the DNA sequence itself.

In eukaryotes, chromatin is at the heart of most epigenetic processes. The

epigenome

refers to these states at the

whole genome

level.

EPIGENETICA: Variazione del profilo trascrizionale indipendente dalla sequenza di DNA ed ereditabile attraverso le generazioni cellulari

Epigenoma

While genomic information is uniform in the different cells of complex organisms

, the epigenome controls the differential expression of genes in specific cells

. The programming of gene expression profiles is therefore dependent on the epigenome.

An epigenetic system should be heritable, self-perpetuating, and reversible The epigenome is composed of two modules: i) a component that is part of the covalent structure of DNA, methylated cytosines located in the ii) dinucleotide sequence CG; ii) a noncovalent module of the epigenome, the chromatin and its associated chromatin modifying and remodeling activities

. The cells in a multicellular organism have nominally identical DNA sequences (and therefore the same genetic instruction sets), yet maintain different terminal phenotypes.

This nongenetic cellular memory, which records developmental and environmental cues (and alternative cell states in unicellular organisms), is the basis of epi-(above) genetics.

MECCANISMI

• •

Modifiche dello stato della cromatina Metilazione delle citosine

RIPIEGAMENTO DEL DNA

DNA umano è circa 1 metro! Diametro nucleo cellula umana è circa 1 milionesimo di metro! Il DNA deve ripiegarsi in qualche modo

CROMATINA: VANTAGGI

• • • •

Impacchettare il DNA Ripartire correttamente il materiale genetico tra le cellule figlie Regolare l’espressione genica in modo tessuto specifico Trasmettere lo stato di attività della cromatina all’interno di una linea differenziata

LIVELLI RIPIEGAMENTO

1. Fibra 10nm (collana di perle): core di proteine istoniche alle quali si legano 147 nucleotidi (nucleosoma) + tratto di DNA linker tra 2 nucleosomi 2. Fibra 30nm: interazione tra le code N-terminali degli istoni del core per ulteriore ripiegamento a solenoide 3. Interazione della fibra 30nm con l’impalcatura presente del nucleo genera anse e permette un’ulteriore compattazione 4. Compattazione finale per dare la tipica struttura dei cromosomi metafasici

I legami nel nucleosoma sono tra le proteine e lo scheletro del DNA, quindi sequenza indipendenti

FIBRA 10nm

• •

Istoni H2A, H2B, H3, H4 formano il core del nucleosoma

– Un tetramero centrale, formato da 2 H3 + 2 H4 e 2 dimeri laterali, formati da H2A + H2B – Estremamente conservati!

Istone H1:

– Tiene vicine le estremità del DNA in entrata e uscita dal nucleosoma – Maggiore variabilità genetica rispetto agli altri istoni

FIBRA 10nm: H1

LIVELLI RIPIEGAMENTO

CROMATINA

• • •

Anse di cromatina maggiormente presenti verso il centro del nucleo sembrano essere silenziate Anse di cromatina maggiormente esposte verso la membrana nucleare sembrano essere più trascrizionalmente attive Sono possibili temporanei svolgimenti del DNA dal

core

istonico (i nucleosomi

respirano

)

Modifiche della cromatina

•

Modifiche covalenti a carico degli istoni

–

Acetilazione

(influenza la condensazione della cromatina), fosforilazione, monoubiquitinazione. Sono modifiche reversibili –

Metilazione

; è parzialmente reversibile e pare ci sia corrispondenza tra metilazione degli istoni e del DNA •

Rimodellamento degli istoni

– Complessi proteici ATP-dipendenti – Omologie con elicasi, ma non hanno attività elicasica – Deformano temporaneamente il DNA Le modifiche degli istoni corrispondono a segnali per il reclutamento o l’esclusione di proteine della cromatina

Metilazione del DNA

La metilazione dei residui citosina del DNA alla posizione del carbonio 5 è un marcatore epigenetico comune a molti eucarioti e viene spesso osservato nel contesto CpG o CpHpG (H=A, T, C). • • • • • Metilazione di citosine nei promotori è generalmente associata a repressione della trascrizione. Metilazione di CpG incrementa nel corpo dei geni in piante e mammiferi. Trasposoni non espressi di piante mostrano metilazione CpHpG In batteri: 5meC ma anche N-4-metilcitosina e N-6-metiladenina La metilazione avviene ad opera di

metiltransferasi

.

METILAZIONE DEL DNA

CGCGCGCGCG Isola CpG TATAAA TATAbox Gene

Metilazione isola CpG Silenziamento del gene

Metodologie di analisi dell’epigenoma

1.

2.

3.

4.

Accessibilità della cromatina:

sequenziamento di siti di taglio della DNAsi I nella cromatina nucleare

Modificazioni istoniche:

dati ottenuti tramite sequenziamento di DNA arricchito tramite immunoprecipitazione della cromatina con anticorpi specifici per le modificazioni istoniche

Espressione dell’RNA:

sequenziamento degli sRNA o di lncRNA

Metilazione del DNA:

dati ottenuti tramite sequenziamento di DNA trattato con bisolfito

1. Accessibilità cromatina (DNAse-seq)

Studi di sensibilità all’azione di DNAsi -> si riconoscono le variazioni di condensazione della cromatina

DNAse-seq

– DNase-seq is primarily used to identify nucleosome-depleted DNase to active regulatory elements. I hypersensitive (DHS) sites that correspond – The DNase I enzyme will cut live chromatin preparations at sites where nearby there are specific (non-histone) proteins. The resulting cutpoints are then sequenced to determine those sites corresponding to – open chromatin.

molti tagli pochi tagli nessun taglio DHS, DNaseI Hypersitivity Sites

1. Accessibilità cromatina (FAIRE-seq)

Formaldehyde assisted isolation of regulatory elements

(FAIRE)

isolates nucleosome-depleted genomic regions

by exploiting the

difference in crosslinking efficiency

between nucleosomes (high) and sequence-specific regulatory factors (low). The protocol is based on the fact that the formaldehyde cross linking is more efficient in nucleosome-bound DNA than it is in nucleosome-depleted regions of the genome. This method then segregates the non cross-linked DNA that is usually found in open chromatin, which is then sequenced. The protocol consists of cross linking, phenol extraction and sequencing the DNA in aqueous phase..

NOTE:

Maps of open chromatin can be constructed using both

DNase-seq

and

FAIRE-seq

Differences in DNase-seq and FAIRE-seq may be due to the specific regulatory complexes bound at each site, which could affect the ability of DNaseI to cut or formaldehyde to crosslink but generally:

→ DNase-only sites

tended to occur at transcription start sites

→ FAIRE-only sites

were more often found in distal regions

2. Modificazioni istoniche

•

Immunoprecipitazione (ChIP-Seq): distinguere lo stato di acetilazione:

– Reagente che instaura legami crociati proteine-DNA (formaldeide) – Estrazione (delicata!) cromatina – – Rottura meccanica del DNA Uso di anticorpi contro istoni acetilati – – Rottura legami istoni-DNA Sequenziamento DNA: la sequenza rivela quali regioni del genoma erano associate a istoni acetilati

MODIFICAZIONI ISTONICHE

DNA e istoni cross-linkati con formaldeide Uso di anticorpi contro istoni acetilati ACTGCTGCGTCTGGTCAATGTCGTCA DNA associato a Istoni acetilati

3. Espressione di sRNA e lncRNA

The transcription process affects chromatin structure, but it is often difficult to ascribe this effect to the physical passage of RNA polymerase II (RNAPII) or to the synthesis of noncoding RNAs (ncRNAs) Early investigations focused on posttranscriptional gene silencing by microRNAs and other sRNAs Small ncRNAs are well suited for a role in bridging chromatin modifiers with the genome, but to fulfill this function they must interact in sequence-specific fashion with chromatin. There are three modes of sequence recognition: (i) RNA:RNA interactions with nascent transcripts (Fig. 2A) (ii) RNA:single-stranded DNA (ssDNA) heteroduplex (Fig. 2B) (iii) RNA:double-stranded DNA (dsDNA) triplex (Fig. 2C)

4. Metilazione del DNA

• • •

Il DNA viene metilato soprattutto a livello di citosine nelle ripetizioni dei dimeri CG (isole CpG) Le isole CpG si trovano soprattutto in prossimità del promotori o al 5’ di un gene Se metilate, silenziano il gene a cui sono associate

Rilevazione delle citosine metilate

La metilazione delle citosine viene rilevata utilizzando delle tecniche basate su un qualche pretrattamento del DNA:

a) Digestione con endonucleasi sensibili a metilazione b) Arricchimento per affinità c) Trattamento con bisolfito

NOTA: Tecniche di biologia molecolare standard come PCR e clonaggio cancellano l’informazione sulla posizione delle citosine metilate nel DNA.

4a) Analisi del DNA metilato mediante digestione con endunucleasi

HpaII MspI • • • • Ad ogni enzima di restrizione sequenza specifico corrisponde una DNA metiltransferasi che protegge il DNA endogeno metilando delle basi sul sito di riconoscimento. Quindi il profilo di taglio di questi enzimi è indice dello stato di metilazione: dove non taglia, il DNA è metilato Nella tecnica restriction landmark genome scanning (RLGS) differenze in metilazione vengono rilevate come differenze nei profili di restrizione generati tramite digestione con un enzima di restrizione metilazione sensibile separata tramite elettroforesi bidimensionale. Le tecniche basate su elettroforesi sono molto laboriose e tendono ad essere abbandonate in favore di altre tecnologie Altre tecniche sono basate sui profili differenziali ottenuti da digestione con enzimi di restrizione metilazione-sensibili e successiva ibridazione ad un array specifico per isole CpG oppure sequenziamento NGS

Digestione: approcci basati su Array

Differential Methylation Hybridization (DMH) MseI (TTAA) taglia frequentemente nel genoma ma raramente all’interno delle isole CpG. Isole CpG non metilate vengono digerite e non possono essere amplificate Basato su restrizione con un enzima metilazione sensibile e successiva ibridazione ad un array specifico per isole CpG: la relativa fluorescenza contiene l’informazioni relativa alla metilazione Yan, P. S., Wei, S. H., & Huang, T. H.-M. (2002). Differential methylation hybridization using CpG island arrays.

Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)

,

200

(10), 87-100. doi: 10.1385/1-59259-182-5:087.

Digestione: approcci basati su sequenziamento

• • • L’analisi basata su sequenziamento è molto più flessibile e potente perché permette una analisi della metilazione allele-specifica, non richiede un microarray disegnato appositamente, evita artefatti da ibridazione.

Methyl-seq:

librerie costruite con digeriti

HpaII

genoma. e

MspI

frazionati sulla base della dimensione vengono comparati con una libreria ottenuta tramite frammentazione random del

Methylation-sensitive cut counting (MSCC)

con : vengono sequenziati frammenti ottenuti dalla digestione

HpaII

seguita da un taglio sulla regione fiancheggiante con un enzima di restrizione di tipo IIS (MmeI) e da ligazione degli adattatori.

Methyl-Seq

MSCC

4b) Analisi del DNA metilato mediante arricchimento per affinità

• • • Methylation Analysis Immunoprecipitation (

MeDIP

): by DNA Arricchimento delle regioni metilate tramite

immunoprecipitazione del DNA

genomico denaturato con un anticorpo specifico per la citosina metilata,

combinato a microarray o sequenziamento

per il rilevamento delle regioni metilate. Permettono una valutazione rapida ed efficiente della metilazione del DNA a livello genomico. Non forniscono dinucleotidi CpG. informazioni sui singoli Richiedono tecniche bioinformatiche complesse per valutare ed aggiustare il livello di metilazione predetto al variare della densità di CpG fra diverse regioni del genoma.

• •

Metodi basati su array:

–

Uso 2 pool, uno arricchito e uno non arricchito, marcati con differente fluorofori

–

Ibrido

–

La fluorescenza indica quali regioni del genoma sono metilate Metodi basati su sequenziamento

–

Uso un pool arricchito

–

Sequenzio

4c) Analisi del DNA metilato mediante trattamento con bisolfito

• •

Il sodio bisolfito deammina chimicamente molto più rapidamente i residui di citosine non metilate

rispetto alle citosine metilate

causando una conversione da C a U

Produce informazione sulla metilazione del DNA con la risoluzione di una singola base.

“Una differenza epigenetica viene trasformata in una differenza genetica”

Trattamento con Bisulfito

Bisolfito e microarray

•

La tecnica del sodio bisolfito non è facilmente adattabile all’analisi array:

– La conversione delle C ad U riduce il numero di basi a 3, diminuendo notevolmente la complessità delle sequenze e quindi risultando in una

diminuita specificità di ibridazione

. –

Richiede array dedicati

basati sulla versione convertita dal bisolfito del genoma. – In genomi complessi richiede l’amplificazione di regioni individuali del genoma prima dell’ibridazione ad un array ad oligo dedicato.

Bisolfito e GoldenGate BeadArray

Basato su primer extension metilazione specifica in multiplex di DNA convertito con bisolfito fino a 1536 differenti loci CpG. Per ogni sito si utilizzano dei primer specifici per le sequenze metilate e non-metilate. I primer per i due differenti stati di metilazione sono marcati con due differenti fluorofori e i prodotti vengono ibridati al bead array.

Bisolfito e Infinium methylation assay

Dopo conversione con il bisolfito il DNA genomico viene amplificato, frammentato e ibridato a oligomeri legati ad una particolare bead. Il saggio utilizza due tipi differenti di bead per lo stato metilato e quello non metilato. Solo nel caso l’ultima base sia complementare a quella sul DNA è possibile estendere l’oligomero ed è possibile rilevare un segnale. L’attuale HumanMethylation27 DNA Analysis BeadChip permette di interrogare 27,578 siti CpG di 14,495 promotori di geni codificanti e di 100 microRNA.

Bisolfito e Whole-genome shotgun bisulfite sequencing (WGSBS)

• • DNA convertito con bisolfito è particolarmente adatto ad approcci basati su sequenziamento. Consente l’analisi dello stato di metilazione del genoma con una risoluzione di una singola base. • • Il problema principale è rappresentato dalla

bassa complessità del DNA convertito

con il bisolfito che può impedire l’assegnamento delle read a posizioni univoche sul genoma. L’utilizzo di read di lunghezza maggiore e strategie basate su sequenziamento paired-end facilita l’allineamento univoco delle sequenze: – Read più lunghe: sequenze lunghe sono generalmente più complesse di sequenze corte – Paired-end read: oltre all’informazione della sequenza, ho un vincolo in più per allineare, cioè la distanza tra read accoppiate

Analisi di DNA arricchito per regioni specifiche del genoma

• • • E’ possibile eseguire l’analisi su campioni arricchiti su specifiche regioni (complessità) del genoma utilizzando la cattura tramite array, la cattura tramite padlock o tramite selezione ibrida in soluzione. Cattura prima della conversione con bisolfito: – usa un array genomico standard – lo stato di metilazione non influenza l’efficienza di cattura – Poco efficiente verso le regioni ricche in CG. Richiede quantità notevoli di DNA genomico (non è possibile amplificare prima della cattura perché verrebbe persa la metilazione) Cattura dopo la conversione a bisolfito: – Dopo la conversione e prima della cattura è possibile amplificare il DNA tramite una PCR mediata da adattatori (BC-seq). – Richiede permutazioni multiple degli oligonucleotidi di cattura

Bisulphite padlock probes (BSPP)

• • • •

Padlock probes sono sequenze di circa 100 basi che comprendono 2 estremità specifiche per un sito di interesse e un “backbone” di collegamento

. E’ possibile disegnare un set di sonde specifiche fino a 10.000 sequenze bersaglio. Dopo l’ibridazione il gap viene chiuso da una polimerasi e da una ligasi. L’amplificazione di tutte le sequenze circolari per i diversi target avviene tramite una coppia di primer universali. La cattura di sequenze con padlock probes permette di ottenere una elevata efficienza di arricchimento combinando l’elevata specificità di appaiamento di due sonde legate tra di loro da un “backbone” con una amplificazione con primer universali. Si ottiene una specificità del 90-99% dopo l’arricchimento. Lo stato di metilazione influenza l’efficienza di cattura e quindi può introdurre dei “bias” nella misura. Ball, M. P., Li, J. B., Gao, Y., Lee, J.-H., LeProust, E. M., Park, I.-H., et al. (2009). Targeted and genome-scale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells.

Nature biotechnology

,

27

(4), 361-8.

Altri approcci

•

Spettrometria di massa matrix-assisted laser desorption ionization time-of flight (MALDI-TOF):

– Richiede amplificazione gene-specifica – Può essere facilmente automatizzata (piattaforma EpiTYPER di sequenom) www.sequenom.com EpiTYPER

Scelta della metodica

Dipende da diversi fattori, come numero di campioni, quantità e qualità dei campioni, risoluzione e copertura desiderate.

Human DNA methylome in stem cells and fibroblasts

The prevailing assumption is that mammalian DNA methylation is located almost exclusively in the CG context. However, in particular in embryonic stem cells, a handful of studies have detected non-CG methylation (mCHG and mCHH, where H= A, C or T) that comprises almost 25% of all cytosines at which DNA methylation is identified

There are widespread differences in the composition and patterning of cytosine methylation between

human embryonic

stem cells and

fetal

fibroblasts

(fibroblasts are the most common cells of connective tissue in animals).

Nearly one-quarter of all methylation identified in

embryonic

stem cells are in a non-CG context

,

suggesting that

embryonic

stem cells may use different methylation mechanisms to affect gene regulation.

Methylation in non CG contexts show enrichment in gene bodies and depletion in protein binding sites and enhancers. Non-CG methylation disappear upon induced differentiation of the

embryonic

stem cells

, and is restored in induced pluripotent stem cells.

There are hundreds of differentially methylated regions proximal to genes involved in pluripotency and differentiation, and widespread reduced methylation levels in fibroblasts is associated with lower transcriptional activity.

Mappa della metilazione a risoluzione di singola base in 2 linee cellulari

Analisi MethylC-Seq su 2 linee cellulari (2 repliche biologiche ciascuna): Miliardi di read

Cellule staminali embrionali umane H1

1.16

Fibroblasti del polmone fetale IMR90

1.18 Resa totale in sequenza (Gbp) Profondità media (per strand) 87.5 14.2 X 91.0 14.8 X In ciascuna linea cellulare più dell’86% del genoma è coperto da almeno una read per un totale del 94% delle citosine del genoma. Frammentazione random Immagine modificata da: Lister, R., & Ecker, J. R. (2009). Finding the fifth base: genome-wide sequencing of cytosine methylation.

Genome research

,

19

(6), 959-66. doi: 10.1101/gr.083451.108.

Validazione della metilazione tramite bisulphite-PCR di siti specifici

• • •

H9

, una seconda

linea cellulare embrionale

umana ha mostrato metilazione non-CG in posizioni conservate

IMR90 induced pluripotent stem cells (iPS)

mostrano un ripristino della metilazione non CG Cellule

H1 indotte a differenziare con BMP4

(bone morphogenetic protein 4) perdono la metilazione non-CG come le IMR90

La metilazione non-CG è caratteristica di uno stato di cellula staminale embrionale. Essa non è dovuta a semplici differenze genetiche tra le due linee cellulari

DNA methylation sequence context is displayed according to the key and

the percentage methylation at each position is represented by the fill of each circle

. Non-CG methylated positions indicated by an asterisk are unique to that cell type and ‘14’ indicates a mCHH that is shifted 4 bases downstream in H9 cells. iPS, induced pluripotent stem cell.

In the H1 stem cells we detected abundant DNA methylation in non-CG contexts (mCHG and mCHH, where H=A, C or T)

Variazione della densità di metilazione lungo i cromosomi

• • • I profili di densità globali di mCG sono simili in H1 e IMR90. mCHG e mCHH in H1 mostrano profili moderatamente correlati lungo il cromosoma. Metilazione non-CG varia rispetto a mCG in numerose regioni.

La densità media di metilazione correla con le

features

del genoma

Non-CG DNAmethylation in H1 embryonic stem cells TSS • • • Densità media di mCG correla con la distanza dal

transcription start site

(TSS) Densità di mCHG e mCHH diminuisce significativamente verso il TSS. Inoltre la densità in Esoni, Introni e 3’ UTR è circa il doppio Densità di mCHH è circa il 15-20% più elevata negli esoni e nel 3’ UTR rispetto agli introni.

Correlazione tra metilazione nel corpo dei geni ed espressione in H1

Espressione + elevata Espression e ridotta

• •

mCHG e mCHH correlano positivamente con il livello di espressione genica

rilevato tramite analisi RNASeq strand-specific.

Geni più espressi hanno una densità di metilazione non-CG più elevata di geni non espressi

.

Metilazione dei promotori ed espressione

Livelli di metilazione dei promotori sono in anti-correlazione con il

•

livello di espressione dei geni:

Geni più espressi hanno un livello di metilazione (mCG, mCHG o mCHH) più basso rispetto a geni poco espressi. Geni più espressi Geni meno espressi

Regioni ipometilate nelle cellule staminali H1

HERV (endogenous retroviruses), meno densamente metilati in H1 e associati con una elevata attività trascrizionale a valle. Livello di metilazione minore 40Kb

Epigenetic Changes over several generations

Using Arabidopsis thaliana, the workhorse of modern plant genetics, it has been determined how often and where in the genome epigenetic modifications occur -- and how often they disappear again.

To determine the rate and distribution of methylation changes in the genome, ten Arabidopsis lines coming from the same stock, but that had been propagated independently for 30 generations by self-fertilization, have been searched for differences in the methylation pattern in comparison to the common ancestor.

For each line, about 14 million cytosines were investigated. On average,

every plant had almost 3 million methylated cytosines. The vast majority of these were the same in all lines, but about 6 percent had changed since the lines had become separated

. At these positions, at least one of the individuals was different, with either methylation gained or lost relative to the ancestor.

Each of the lines had about 30,000 such epimutations, which was 1,000 times more than DNA mutations.

The epigenetic changes are many orders of magnitude more frequent than conventional DNA mutations, but also often short lived. They are therefore probably much less important for long-term evolution than previously thought.

With 30,000 epimutations after 30 generations, the geneticists had expected that 1,000 epimutations occurred in each generation. But when parents were compared with their immediate offspring, it was found that the epimutation rate was three to four times as high. Therefore, many epimutations are apparently not stable and return to their original state after a few generations

. New epimutations are often not maintained over the long term.

A new epimutation thus must have a strong evolutionary advantage so that it can become established before being lost again.

inheritance of traits between parents and their children or grandparents and their grandchildren. Because reverse mutations do not necessarily happen in the next generation, it is still possible that epigenetic differences contribute to

Another difference to ordinary mutations is that epimutations do not occur randomly, but often at the same places in the genome. While genes were disproportionately often affected, methylation of mobile DNA elements, transposons, was very stable

. This appears to make sense, since it was already known that artificially induced loss of methylation has a much greater effect on the activity of transposons than of regular genes.

More important than the state of individual cytosines is probably the methylation of larger segments of the genome

. "In each plant we found only about 30 such regions in which they differed from the other lines," explains Becker. Hagmann adds: "Such whole-sale epigenetic changes appear to be as rare as true DNA sequence mutations." These differences can nevertheless appear very rapidly. The biologists discovered one region that first lost its methyl groups, only to become completely remethylated in the next generation.

What makes epigenetics interesting for human health is the fact that some epigenetic changes can be triggered by external factors

. There is evidence that nutrition or the bond between children and their parents can leave traces in the genome that can be passed on to the next generation. The limited stability of DNA methylation implies, however, that such differences do not necessarily last forever, which is probably not a bad idea because a famine might not last forever. It also means that altered DNA methylation often cannot become subject to natural selection.

The results of the Max Planck scientists demonstrate that epigenetic differences can also arise spontaneously, without drastic changes in the environment

. After all, the growth conditions in the green house, where each of the 10 lines was propagated, were constant. This opens the door to further speculation. "We suspect that the epimutation increase is higher and more variable when plants grow in nature, where they are stressed all the time," says Becker. If this were paralleled by an even higher reversion rate, then the importance of epigenetics for long-term evolution would be even lower.

Comparison of genome-wide DNA methylation among 10

Arabidopsis thaliana

lines derived from a common ancestor. These lines had been separately propagated in a common environment by single-seed descent for 30 generations

Strains were derived from a single parent. The seeds were propagated by single-seed descent, with separate lineages for the 3rd and 31st generation individuals. Strains 39 and 49 were propagated for one more generation from siblings of the plants analyzed by sequencing (grey outlines). Black outlines indicate individuals analyzed by bisulphite sequencing. Red outlines indicate individuals analyzed by RNA-seq.

Two siblings each of the 31st generation were interrogated generation

.

generations

with an average strand-specific coverage depth of 20× per individual;

changes shared within a line should predominantly reflect differences that had accumulated by the 30th Because seeds from the founders were no longer available, we compared the 31st generation individuals to two independent lines that had been propagated for only three

On average 2.8 million cytosine were found to be methylated in each line. About 186,000 (6.2%)

differentially methylated positions (DMPs)

had a significant change in methylation between at least one 31st generation and both 3rd generation lines.

CG sites are highly over-represented among DMPs a

, Contribution of CG, CHH and CHG sites to total and differential cytosine methylation. 32.8% of all CG, 15.7% of CHG and 4.6% of CHH sites, adding up to 10.8% of all cytosines, show evidence of methylation

Among CG sites in genic regions, including those producing non-codingRNAs, relative abundance of DMPs is two- to fourfold higher compared with nondifferentially methylated positions (N-DMPs)

but less pronounced, bias for CHG and CHH sites

b

. The opposite was the case for CG positions in transposable elements and intergenic regions, with a similar, , Distribution of DMPs and N-DMPs according to local annotation. CDS, coding sequence; ncRNA, non-coding RNA; TE, transposable element.

Gene body methylation gradually increases towards the 3’ end, before sharply decreasing at the end of the last exon,

although genes 1 kb or less in length were generally only weakly methylated

d

CHG sites along genes The profiles of DMPs and N-DMPs were similar across individual genes, exons, introns and transposable elements, but DMPs were less frequent in promoter and downstream regions. , Averaged distribution of all methylated sites (5mC) and methylated CG and A first major insight from these analyses is that transgenerational maintenance of CG methylation in transposable elements is apparently much more stable than CG methylation of protein-coding genes, consistent with DNA methylation being more important for controlling the activity of transposable element compared to the latter

DMP correlation is highest between the two 3rd generation strains, and each individual of the 31st generation is more similar to these two lines

(from which they were separated by 34 generations)

than to the other lines from the 31st generation

, from which they had diverged for 62 generations.

Therefore, whole genome methylation patterns are largely stable and therefore heritable in A. thaliana, but that differences in methylation status accumulate gradually, similar to genetic mutations.

Pairwise distance between strains based on DMPs.

b

, Heat map representing pairwise Pearson’s correlation coefficient (PCC) between individuals, considering all 250,000 DMPs identified between all strains.

PCCs between 3rd generation strains, 0.92

; between 3rd and 31st generation, 0.63– 0.77; between 31st generation lines, 0.52–0.66.

Compared to genetic mutations, the frequency of epimutations at single cytosine residues was many orders of magnitude higher, with an average of close to 30,000 DMPs in the analysed sequence space, compared with less than 30 DNA sequence mutations per strain. Thirty-two per cent of DMPs between generations 3 and 31 occurred more than once, and 13% more than twice.

If DMPs arose randomly, the expected rate of recurrent events would be less than 1%.

This indicates that certain positions are particularly prone to increases or decreases in methylation rate.

The analysis of 32nd generation of lines 39 and 49 revealed

how many DMPs emerge from one generation to the next

. These individuals were progeny of siblings of the individuals interrogated in the 31 st generation, and shared changes in the 32nd generation should reflect differences that arose between the 30th and 31st generation. We found on average over 3,300 between-generation DMPs. This is in the same range as DMPs between siblings (on average, about 5,000), but more than we would have expected from the 30,000 that had accumulated between the 3rd and each of the 31st generation lines. One explanation is that

frequent transgenerational changes in methylation status occur at a limited number of sites, and

that

only a fraction of new DMPs is maintained over the longer term.

This is corroborated by the observation that more than two thirds of DMPs distinguishing the 32 nd from the 31st generation in lines 39 and 49 had already been found in other 31st generation individuals.

Perhaps the most important finding is that the number of epimutations does not increase linearly with time, indicating that many are not stably inherited over the long term

. However, a DMR that had become demethylated after 31 generations, was found re-methylated in the following generation. This suggests that

DNA methylation in specific regions of the genome can fluctuate over relatively short timescales. Such sites can be considered as going through recurrent cycles of forward and reverse epimutation, which is very different from what is found at the level of the genome sequence, where reverse mutations are exceedingly rare

.

RNA interference (RNAi)

RNA interference (RNAi) is an evolutionarily conserved mechanism that uses short antisense RNAs that are generated by ‘dicing’ (chopping) dsRNA precursors to target corresponding mRNAs for cleavage.

Recent developments have revealed that there is also extensive involvement of RNAi-related processes in regulation at the genome level. Indeed,

dsRNA and proteins of the RNAi machinery can direct epigenetic alterations to homologous DNA sequences to induce transcriptional gene silencing or, in extreme cases, DNA elimination

. Furthermore, in some organisms RNAi silences unpaired DNA regions during meiosis.

These mechanisms facilitate the directed silencing of specific genomic regions.

microRNA

 I microRNA sono corte molecole di RNA non codificante di ~22 nucleotidi  sono regolatori chiave dell’espressione genica a livello post-trascrizionale  taglio dei trascritti bersaglio   repressione della traduzione Deadenilazione dell’mRNA e sua degradazione  sono in genere altamente conservati  hanno ruoli fondamentali in molti processi biologici, tra cui:  Sviluppo  Differenziazione cellulare  Proliferazione cellulare  Apoptosi   Risposta agli stress Oncogenesi

Scoperta dei microRNA

 . Il primo miRNA,

lin-4

, è stato identificato in

Caenorhabditis elegans

nel 1993 

lin-4

è coinvolto nello sviluppo larvale in

C. elegans



lin-4

codifica un RNA non codificante di 22 nucleotidi parzialmente complementare a 7 siti nel 3’ UTR di

lin-14

 l’appaiamento tra

lin-4

e il 3’UTR di

lin-14

reprime l’espressione della proteina lin-14 He and Hannon (2004) Nature Rev. Genet., 5, 522–531

Biogenesi dei microRNA negli animali

 I geni codificanti per i microRNA (miRNA) vengono trascritti come lunghi transcritti primari (pri-miRNA)  Il pri-miRNA viene tagliato dal complesso formato da Drosha e DGCR8/Pasha formando il precursore dei miRNA (~70 nucleotidi)  Il trasporto dei precursori dei micorRNA (pre miRNA) nel citoplasma è mediato da exportin-5  nel citoplasma il complesso formato da Dicer e TRBP taglia il pre-miRNA formando il duplex miRNA:miRNA*  il microRNA viene incorporato insieme ad una proteina Argonaute (Ago) nell’RNA-induced silencing complex (RISC) Winter et al.,2009 – Nature Cell Biology 11, 228 - 234

Biogenesi dei microRNA nelle piante

• non sono stati individuati omologhi di Drosha e dei suoi cofattori nelle piante  il processamento da pri-miRNA a pre-miRNA è mediato dalla proteina nucleare Dicer-like 1 (DCL1) in associazione con HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) e SERRATE (SE).  DCL1 e HYL1 sono anche responsabili della formazione del duplex miRNA:miRNA*  Hua Enhancer (HEN1) media la metilazione dei miRNA di pianta  Hasty media il trasporto del miRNA nel citoplasma  i miRNA:miRNA* duplex si associano alla proteina Ago  il miRNA* viene degradato mentre l’altro filamento rimane nel complesso RISC Wahid et al., 2010 – Biochimica et Biophysica Acta 1803 (11), 1231-1243

Meccanismi di regolazione

Regolazione post-trascrizionale Taglio dell’mRNA Repressione della traduzione o deadenilazione

• alta omologia di sequenza tra miRNA e mRNA bersaglio • meccanismo principale di regolazione dei microRNA di pianta • complementarietà imperfetta tra miRNA e mRNA bersaglio • meccanismo principale di regolazione dei microRNA degli animali Filipowicz et al. 2008, Nature Reviews genetics, 9(2):102-114

Meccanismi di regolazione

Possibili meccanismi di repressione della traduzione

Fabian et al. 2010 , Annu. Rev. Biochem.

79:351 –379.

Meccanismi di regolazione

Regolazione trascrizionale

Metilazione del DNA mediata da miRNA • miRNA di 23-27 nucleotidi sono stati identificati in

Arabidopsis

, riso e

Physcomitrella patens

• sono generati da DCL3 e si associano a AGO4 • guidano la metilazione del DNA anche in loci diversi da quelli che li hanno generati Jia et al. (2011), Frontiers in Biology, 6(2): 133 –139

Localizzazione genomica dei geni codificanti miRNA

• geni miRNa intergenici sono situati in regioni distinte da unità trascrizionali note • monocistroni • policistronici • geni miRNa intronici sono situati negli introni di geni annotati • miRNA singolo • mirtron (l’introne è l’esatta sequenza del pre-miRNA) • cluster di vari miRNA • geni miRNa esonici sono situati a livello di un esone e di un introne in geni non codificanti Olena and Patton 2009, Journal of cellular Physiology, 222: 540–545

Analisi del profilo di espressione dei miRNA: problematiche

 I miRNA maturi sono molecole corte;  miRNAs presentano un contento in GC etereogeneo ampio range di Tm;  I microRNA maturi non hanno il poly(A);  la sequenza target è presente anche nel trascritto primario(primiRNA) e nel precursore (pre-miRNA);  miRNAs appartenenti alla stessa famiglia possono differire anche di un singolo nucleotide(e.g., la famiglia Let-7).

Tecniche di analisi del profilo di espressione dei miRNA

Real Time PCR microarray Sequenziamento massivo

Real time PCR



retrotrascrizione (RT)

:   Primer lineari Primer stem-loop 

rilevamento del prodotto amplificato attraverso molecole fluorescenti

:  SYBR Green I  Sonde Taqman

Vantaggi

:  alta sensibilità e specificità  richiede basse quantità di materiale

Svantaggi

:  la dimensione limitata e l’etereogeneo contenuto in GC dei microRNA ostacola il disegno dei primer

Universal primer-binding site Universal primer binding site

Real Time PCR

Retrotrascrizione PRIMER LINEARI STEM-LOOP PRIMER VANTAGGI

: disegno dei primer semplice

SVANTAGGI

: non permettono di discriminare tra microRNA e i loro precursori

VANTAGGI

: permettono di discriminare tra microRNA e i loro precursori

SVANTAGGI

: disegno dei primer più complesso Benes V. and Castoldi M. 2010, Methods, 50: 244 –249

Real Time PCR

Rilevazione del segnale

SYBR Green I Sonde TaqMan

Real Time PCR

Rilevazione del segnale

SYBR Green I Sonde TaqMan non permette di discriminare tra differenti prodotti di PCR in quanto si lega a tutti i dsDNA presenti nella reazione, inclusi prodotti non specifici come dimeri di primer. Maggiore specificità: anche se nella reazione sono presenti dimeri di primer o altri prodotti di amplificazione non specifici, questi non genereranno fluorescenza.

Microarray

Generalmente le sonde del microarray sono complementari all’intera sequenza del microRNA maturo

Vantaggi

:  alta processività  bassi costi

Svantaggi

:  la dimensione limitata dei microRNA ostacola la normalizzazione delle Tm delle sonde  possibili cross-ibridazioni tra miRNA appartenenti alla stessa famiglia  possibili cross-ibridazioni con precursoni dei microRNA

Microarray

Sonde LNA

Locked Nucleic Acid (LNA) sono degli analoghi sintetici degli acidi nucleici in cui la conformazione della molecola viene bloccata attraverso un ponte metilenico tra il 2’-O e il 4’-C

Vantaggi delle sonde contenenti nucleotidi LNA

:  aumento della stabilità del duplex  incremento della Tm di 2-8 °C per monomero incorporato facilitano il disegno di sonde con Tm simili  discriminazione di sequenze che differiscono anche di un singolo nucleotide

Microarray

Sonde stem-loop

 una struttura a forcina incorporata al 5 ’ della sonda destabilizza l’ibridazione di RNA più lunghi  discriminazione tra miRNA e loro precursori

Microarray

Sonde RAKE (RNA-primed Array-based Klenow Extension)

 Ogni sonda contiene una sequenza complementare al microRNA bersaglio e tre timidine al 5’

Metodologia RAKE

:  ibridazione dei microRNA non marcati  reazione di estensione mediante la Polimerasi Klenow in presenza di dATP biotinilate  I miRNA funzionano da primer per l’estensione  assenza di estensione in caso di ibridazione di sequenze più lunghe o più corte del miRNA bersaglio  l’ibridazione viene rilevata mediante un fluoroforo coniugato alla streptavidina che si andrà a legare alle biotine incorporate

Vantaggi

:  discriminazione tra miRNA e loro precursori Berezikov et al.,2006, Genome Reasearch, 16:1289 –1298

Sequenziamento massivo

Vantaggi

:  alta processività  identificazione di nuovi miRNA  discriminazione tra miRNA simili

Svantaggi

:  l’analisi dei dati è più complessa ed presenta esigenze computazionali maggiori rispetto ai microarray. Hafner et al. 2008, Methods, 44: 3 –12

Sequenziamento massivo

Analisi di espressione e identificazione di nuovi miRNA

sequenze Allineamento con i precursori presenti in miRBase (banca dati pubblica di microRNA) Le sequenze che non allineano con miRNA noti e che mappano su regioni del genoma che possono formare strutture a forcina rappresentare nuovi miRNA possono