Transcript Lezione 15

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
2010-11
LEZIONE 15
FARMACI BIOTECNOLOGICI
PROTEINE TERAPEUTICHE
DI PRIMA E SECONDA GENERAZIONE
ACIDI NUCLEICI per la regolazione della espressione di
specifici geni
VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI
ANTI-ACIDI NUCLEICI
BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO
Numero di proteine intracellulari: 1000-100000
Numero di RNA: 100-10000
Numero di geni: 1-2
AZIONE MOLTO SPECIFICA
Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma
Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i
vantaggi della complementarità tra due catene secondo il
modello di Watson e Crick
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’ TRASCRIZIONE
RNA, trascritto primario
Capping e poliadenilazione
MODIFICAZ.
TP
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
TRADUZIONE
Modificazioni post-traduzionali
La rilevanza dei processi di regolazione
della espressione genica
nel disegno di nuovi farmaci
L’omeostasi cellulare è mantenuta da un efficiente
controllo della trascrizione genica che viene
assicurato da un complesso circuito molecolare che
utilizza fattori di trascrizione individali, l’apparato
basale di trascrizione e i complessi multiproteici
coregolatori della trascrizione.
La cromatina ha un ruolo
fondamentale nella reglazione
della espressione genica e la
capacità degli istoni di legare il
DNA è regolata da enzimi
intranucleari che possono
apportare modificazioni posttraduzionali soprattutto ai
residui di lisina e arginina posti
nel dominio N-terminale delle
proteine istoniche
Modificazioni degli istoni: acetilazione, fosforilazione, metilazione,
ubiquitinazione
MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI
Zhang Y , Reinberg D Genes Dev. 2001;15:2343-2360
Metilazione degli istoni
La metilazione degli istoni aumenta lo stato di
idrofobicità e la basicità delle porzioni N terminali degli
istoni: questo ne aumenta l’affinità per proteine
specifiche e fattori di trascrizione.
Le metilasi necessitano di cofattori: es. la sadenosilmetionina
Generalmente la metilazione degli istoni si associa a repressione
della espressione genica, tuttavia ci sono esempi in cui la
metilazione si associa a attivazione della espressione genica
(metilazione lella lisina 4 dell’istone 3, il coattivatore CARM1 è una
metiltransferasi)
PROCESSI DI ACETILAZIONE E
DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI
NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’
DELLA CROMATINA
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON ACETILAZIONE
L’acetilazione dei residui di lisina al terminale NH degli istoni rimuove le cariche positive
riducendo quindi l’affinità degli istoni per il DNA: per questo l’acetilazione degli istoni
facilita i processi trascrizionali , al contrario, la deacetilazione reprime la
trascrizione
.
Acetilazione e deacetilazione del residuo lisinico
ACETIL TRANSFERASI ISTONICHE :histone acetyltransferases (HATs)
DEACETILASI ISTONICHE: histone deacetylases (denoted by HDs or HDACs);
numerose deacetilasi sono associate a repressori della trascrizione;
Fosforilazione degli istoni
la funzione della fosforilazione degli istoni rimane da essere
pienamente compresa: è stato riportato che la
fosforilazione degli istoni puo’ facilitare l’attacco di HATs
Enzimi quali le ERK possono fosforilare gli istoni legando
signaling di recettori di membrana allo stato di
fosforilazione degli istoni
Fattori di rimodellamento della cromatina
Due famiglie di fattori sono coinvolte nel rimodellamento della
cromatna: SWI/SFI e ISWI: in genere queste proteine destabilizzano il
legame tra istoni e DNA aiutando lo “scivolamento” dei nucleosomi e
la trascrizione del DNA : queste proteine fungono quindi da enhancers
della trascrizione.
Esistono inoltre proteine non istoniche che facilitano il legame delle
HAT
Altri fattori di rimodellamento della cromatina agiscono utilizzando
ATP e possono riposizionare i nucleosomi sulla cromatina (ACF e NAP1)
Meccanismi di metilazione
del DNA e eredità epigenetica
Meccanismi di metilazione del DNA
ed eredità epigenetica
Circa il 2-7% delle citosine nel DNA animale
subisce metilazione ad opera di specifici
enzimi
che agiscono su sequenze palindromi:
5’ mCpG 3’
3’ GpCm 5’
CpG islands are genomic regions that contain a high frequency of CG
nucleotides. In mammalian genomes, CpG islands are typically 300-3,000
base pairs in length. They are in and near approximately 40% of
promoters of mammalian genes (about 70% in human promoters).
The "p" in CpG notation refers to the phosphodiester bond between the
cytosine and the guanine.
The usual formal definition of a CpG island is a region with at least 200
bp and with a GC percentage that is greater than 50% and with an
observed/expected CpG ratio that is greater than 60%.
Another recent study revised the rules of CpG island prediction in order
to exclude other GC-rich genomic sequences such as Alu repeats. Based
on an extensive search on the complete sequences of human
chromosomes 21 and 22, DNA regions >500 bp with a GC content >55%
and observed CpG/expected CpG of 0.65 were more likely to be the true
CpG islands associated with the 5' regions of genes.
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON DEMETILAZIONE
I GENI “HOUSEKEEPING” SONO ESPRESSI IN
MODO COSTITUTIVO E CONTENGONO
NEL LORO PROMOTORE MOLTE “ISOLE” CpG
NON METILATE
A Unifying Model for the Selective Regulation of
Inducible Transcription by CpG Islands and
Nucleosome Remodeling
Vladimir R. Ramirez-Carrozzi,1,2,5 Daniel Braas,1,2,5 Dev M. Bhatt,1,2,5 Christine S. Cheng,4
Christine Hong,1,2
Kevin R. Doty,1,2 Joshua C. Black,2,3 Alexander Hoffmann,4 Michael Carey,2,3 and Stephen T.
Smale1,2,*
Cell 138: 114, 2009
CpG island promoter: 70% dei promotori hanno
numerose sequenze ricche in CpG : basso livello di
metilazione delle CpG island che li rende indipendenti da
SWI/SNF remodeling complexes
Non CpG island promoter: 30% dei promotori che sono
altamente regolati trascriionalmente
MECP2
methyl CpG binding protein 2
(Rett syndrome)
Sindrome di Rett
MeCP2 gene
methyl DNA binding protein 2 (MeCP2) (a)
The mechanism(s) by which the native MeCP2 protein operates in
the cell are not well understood.
Historically, MeCP2 has been characterized as a proximal gene
silencer with 2 functional domains:
1. a methyl DNA binding domain and
2. a transcription repression domain.
However, several lines of new data indicate that MeCP2 structure
and function relationships are more complex: an analysis of cellbased experiments suggesting MeCP2 is a regulator, rather than a
strict silencer, of transcription. The new data establish MeCP2 as a
multifunctional nuclear protein, with potentially important roles in
chromatin architecture, regulation of RNA splicing, and active
transcription..
methyl DNA binding protein 2 (MeCP2) (b)
One complex shown to associate with MeCP2 is the Sin3A
corepressor complex. This complex contains histone deacetylase
(HDAC) 1 and HDAC2 and was originally shown to mediate
repression by the DNA-binding heterodimer, Mad-Max .
MeCP2 also interacts with two other corepressors, the protooncoprotein of the Sloan-Kettering virus named after the SloanKettering Institute (c-Ski) and the nuclear receptor corepressor
(N-CoR). c-Ski and N-CoR are components of histone deacetylase
complexes that can but do not always function together
It is interesting that repression by MeCP2 is not completely
alleviated by the histone-deacetylase inhibitor, trichostatin A
(TSA), suggesting that MeCP2 may also repress transcription in
an HDAC-independent manner
Modeling Rett Syndrome with Stem Cells
Cell 143: 499, 2010
METILAZIONE DEL DNA E CANCRO
The alterations of DNA methylation level and
patterns are a common feature of human cancer
cells. A global DNA hypomethylation has been
observed in many cancers, without obvious
sequence specificity
Recently, an extensive study of about 1200 CpG islands has
indicated that hypermethylated CpG islands are not randomly
distributed and the patterns of the hypermethylation might
be specific of subclasses of cancers.
The methylation status of tumor suppressor genes has been
extensively investigated and such alterations have been
reported in many human tumors (Robertson and Jones,
2000).
METILAZIONE DEL DNA E CANCRO
Several reports link genome hypomethylation to
genome instability. In particular, it was shown
recently that strongly reduced DNMT activity in a
transgenic mouse model caused demethylation of
centromeric satellite and other repeat sequences,
which resulted in a variety of chromosome defects
and concomitant tumorigenesis
FARMACI E METILAZIONE
Peter Jones nel 1970 descrisse il differenziamento di cellule
embrioniche in cellule muscolari dopo esposizione a una molecola
capace di aumentare lo stato di metilazione del DNA (5-Azacytidine) .
Nel 2004 la 5-azacytidine ( Vidaza) è stato approvato per il
trattamento della sindrome mielodisplastica
Nel 2006 è stato approvata un’altra molecola la decitabina (Dacogen) :
queste molecole sono substrati dell DNA methyltransferasi.
Altri farmaci epigenetici in studio sono gli inibitori delle
acetiltransferasi (HDAC inhibitors) il primo di questi, SAHA (zolinza) è
stato approvato nel 2006 per il linfoma a cellule T cutaneo.
FARMACI E ACETILAZIONE
O
N
N
H
N-hydroxy-N'-phenyl-octanediamide
O
H
OH
VORINOSTAT (Zolinza) è il primo inibitore delle acetilasi
istoniche approvato per il trattamento di neoplasie
Nel 2006 il VORINOSTAT è stato approvato per il
trattamento del linfoma a cellule T cutaneo
Esistono studi preclinici che indicano una attività
antinfiammatoria del vorinostat
Nel 2007 ricerche presso la Mayo Clinics hanno dimostrato
che il Vorinostat è efficace nel glioblastoma ricorrente
HDAC inhibitors can activate both the deathreceptor and intrinsic apoptotic pathways
REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE
A LIVELLO TRASCRIZIONALE
TBP + 12 TAFs (TBP ass. factors)
TFIID recognizes TATA (Inr)
commitment
TFIIA; TFIIB; TFIIF
Pol II entry
TFIIE; TFIIH
Promoter clearence
TFIIF pol II binding
TFII H helicase and kinase
Bob Roeder
Lasker Award 2003
Promotori prossimali e promotori distali
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’ TRASCRIZIONE
RNA, trascritto primario
Capping e poliadenilazione
MODIFICAZ.
TP
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
TRADUZIONE
Modificazioni post-traduzionali
Biogenesi di RNA
messaggero e
regolazione genica
post-trascrizionale
Cell 136:777, 2009
INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO
DELL’APPARATO DI SPLICING
5’
Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 1
3’
5’
3’
5’
3’
Commitment complex (E complex)
U1 lega il sito di taglio in 5’ e U2AF lega
il sito polipirimidinico
Complex A U2 lega il sito “branch”
Complex B si associano U5, U6, U4
Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 2.
Riposizionamento, U1 si dissocia,
U5 si associa all’introne; U 6 lega
il sito di taglio in 5’
Complex C U4 si dissocia,
U6 e U2 catalizzano la
transesterificazione
U5 l’esone al sito di taglio in 3’
Avviene il taglio in 5’ e si forma il lariate
Avviene il taglio in 3’ e la ligazione
Tra gli esoni
LE SEQUENZE DI SPLICING SONO CONSERVATE NEI VERTEBRATI
5’ splice site: 5’-GU-3’
Tratto polipirimidinico
3’ splice site 5’-AG-3’
Esistono introni AU-AC sono simili a introni GU-AG ma richiedono
Un apparato di splicing differente
L’eliminazione di sequenze di RNA che non abbiano
subito il processamento è assicurata dalla presenza
di “nonsense-mediated mRNA decay” un
meccanismo di turnover di RNA che degrada
sequenze in cui sia presente un segnale di stop
Questo suggerisce la co-evoluzione dei meccanismi
di splicing e di traduzione del segnale
Mutazioni che alterano il codice di
slicing causano patologie specifiche
Micro RNA e regolazione della espressione genica
Cell 136: 777, 2009