Transcript Biosensores “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación”

Biosensores
“Instrumentos analíticos que transforman procesos
biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su
cuantificación”
BIOSENSORES
•
Utilizan la especificidad de los procesos biológicos:
–
–
–
–
Enzimas
x
Sustratos
Anticuerpos
x
Antígenos
Lectinas
x
Carbohidratos
Complementariedad de ácidos nucleicos.
•
Ventajas:
–
–
–
–
•
Reutilización
Menor manipulación
Menor tiempo de ensayo
Repetitividad
Tipos y usos mas comercializados:
1.
2.
Tiras colorimétricas
Electroquímicos:
•
•
3.
Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol,
Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos, Colesterol
Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol
Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.
Propiedades de un buen Biosensor
BIOSENSORES
1.
2.
3.
4.
5.
Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas.
Consultas y Urgencias Hospitalarias:
–
Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales
–
Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento
–
Menor riesgo de deterioro de la muestra
Diagnóstico Doméstico:
•
Ensayos de Embarazos
•
Control de Glucosa en diabéticos
Aplicaciones in vivo:
–
Páncreas artificial
–
Corrección de niveles de metabolitos
–
Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad
Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales:
–
Alimentación
–
Cosmética
–
Control de Fermentaciones
–
Controles de Calidad
–
Detección de Explosivos
–
Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas
–
Control de polución.
TIPOS DE BIOSENSORES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS
– Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los
electrones involucrados en procesos redox
– Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones
– Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados
con cambios en el ambiente iónico de las soluciones
BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS
BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS
BIOSENSORES ÓPTICOS
– De onda envanescente
– Resonancia de plasma superficial
BIOSENSORES CELULARES
INMUNOSENSORES
UNIDADES FUNCIONALES
DE UN BIOSENSOR
Material biológico + Analito
Analito unido
Respuesta biológica
Respuesta Electrónica
Respuesta
electrónica
=
(Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito)
(Constante de semisaturación) + (Concentración del analito)
Cinéticas de reacción en biosensores
TIPOS DE BIOSENSORES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS
– Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los
electrones involucrados en procesos redox
– Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones
– Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados
con cambios en el ambiente iónico de las soluciones
BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS
BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS
BIOSENSORES ÓPTICOS
– De onda envanescente
– Resonancia de plasma superficial
BIOSENSORES CELULARES
INMUNOSENSORES
Biosensores Electroquímicos
Amperométricos:
“El electrodo de Oxígeno”
Electrodo de Oxígeno
Electrodo de Oxígeno
(A) Disco de resina epoxy
(B) Cátodo de platino en el centro de un saliente.
(C) Ánodo de plata en forma circular
(D) Anillo de goma que sostiene un papel
espaciador empapado en un electrolito y una
membrana de polytetrafluoroethylene que separa
los electrodos de la mezcla de reacción.
DETERMINACION DE GLUCOSA
DETERMINACION DE GLUCOSA
DETERMINACION DE SACAROSA
Glucosa
Sacarosa
O2
Glucosa
Fructosa
D-gluconolactona
H2O2
respuesta
glucosa
sacarosa
tiempo
flujo
Electrodo
Invertasa Glucosa-oxidasa
DETERMINACION DE
LA FRESCURA DEL PESCADO
Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de
reacciones de degradación progresiva:
ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico
DETERMINACION DE
LA FRESCURA DEL PESCADO
BIOSENSOR:
xantina-oxidasa y nucleósdio fosforilasa inmovilizadas sobre
una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de Oxígeno.
K < 20 El pescado puede ser comido crudo.
20 > K < 40 El pescado debe ser cocinado.
K > 40 Pescado no apto para el consumo
Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y
muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa
Varios mecanismos redox
Mediadores
redox en
biosensores
amperométricos
Miniaturización
Posible por la capacidad
del pirrol para
polimerizar mediante
oxidaciones
electroquímicas en
condiciones
suficientemente suaves
como para atrapar
enzimas y mediadores
sin desnaturalizarlos
Microelectrodo glucosa/lactato
Se puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando
pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de
micro fabricación de microprocesadores, en incluso disponiendo varios
sensores en los mismos
Biosensores Electroquímicos
Potenciométricos
Determinan cambios en la concentración de iones concretos
Biosensores potenciométricos
Biosensor potenciométrico
Biosensores Electroquímicos
Conductimétricos
Detectan cambios en conductividad eléctrica
causados por alteraciones en la concentración de
iones
Sensor de Urea
NH2CONH2 +3H2O
Ureasa
2HN 4 + + HCO3- + OHOtros ejemplos:
amidasas,
decarboxilasas,
esterasas,
fosfatasas y
nucleasas.
Biosensores Termométricos:
“Sensores bioquímicos y TELISA”
Biosensor
termométrico
Precisa un aislamiento Correcto
Puede detectar diferencias de 0,0001 ºC
Reacciones usadas en biosensores
termométricos
Biosensores Termométricos
1) Poco éxito comercial
2) Ventaja: se puede acoplar fácilmente varias reacciones en un
único reactor
3) Ejemplo:
1) Detector de Lactato
Lactato + O2------(lactato -oxidasa)---> piruvato + H2O
Piruvato + NADH+ H+--(lactato deshidrogenasa)--> lactato + NAD+
4) Puede utilizarse células viables
5) Puede acoplarse a un inmunoensayo enzimático: ELISA
termométrico o TELISA
Biosensores Piezoeléctricos:
“Narices bioelectrónicas”
Aprovechan las propiedades eléctricas de los cristales:
- En transmisores y emisores de radio
- En transistores
- En chips
Efecto Piezoeléctrico
“Producción de un campo eléctrico por
separación de las cargas positivas y
negativas en algunos tipos de cristales al
someterlos a ciertas tensiones”
1) Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo
eléctrico se deformará.
2) Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo
eléctrico que oscila a una frecuencia determinada
vibrará con una frecuencia característica.
Efecto Piezoeléctrico
1) La frecuencia de resonancia se encuentra en el
rango de los 10 MHz (radiofrecuencia).
2) La frecuencia de resonancia depende de:
• La composición del cristal
• El Grosor
• La forma en que fue cortado
3) Un cristal piezoeléctrico varía su frecuencia de
resonancia cuando se adhieren moléculas a su
superficie.
Biosensores Piezoeléctricos
1) Se detectan variaciones muy pequeñas en la
frecuencia de resonancia: cantidades de hasta un
ngr/cm2
2) La medida se compra con un electrodo de
referencia con cristal sin material biológico.
3) Ejemplos:
1) Detectores gaseosos: SO2, CO, HCl, NH3, CO2
2) Detector de Cocaina
3) Detector de Formaldehido
4) Detector de Pesticidas (Organofosforados)
Biosensores Piezoeléctricos
1) Detector de Cocaína:
• Anticuerpos contra cocaína fijados
sobre un cristal piezoeléctrico.
• Detecta una parte por billón
• 50 MHz de cambio en la frecuencia de
resonancia.
• Se limpia en segundos por aireación.
Biosensores Piezoeléctricos
2) Detector de Formaldehido:
CH2 +H2O +NAD+ g
NADH +HC02H + H2
Catalizada por la formaldehido deshidrogenasa
inmovilizada con glutation (cofactor) por
entrecruzamiento con glutaraldehido en un
cristal de cuarzo a 9 MHz
Biosensores Piezoeléctricos
3) Detector de Pesticidas Organofosforados:
• Colinesterasa inmovilizada en un cristal
de cuarzo mediante glutaraldehido.
Biosensores Piezoeléctricos
Inconvenientes:
• Muy influidos por la humedad.
Baja = poco sensibles
Alta = desaparece el efecto piezoelectrico
• Inutilizables en líquidos.
Introducir y secar
Biosensores Ópticos:
• Permiten el uso de materiales detectores no
eléctricos, seguros en ambientes peligrosos
o sensibles (in vivo)
• No precisan sensores de referencia
Biosensor de
fibra óptica
para lactato
• Detecta cambios en la en
la concentración de
oxígeno determinando la
reducción de la
fluorescencia de un
fluorocromo (quenching)
Biosensor de célula óptica para
albúmina sérica
• Detecta la absorción de luz a
630 nm que pasa a través de la
célula detectora.
• Se evalúa el cambio de
amarillo a azul verdoso del verde
de bromocresol cuando se une a
la albúmina sérica a pH 3.8
• Respuesta lineal a la albúmina
en un intervalo de 5 a 35 mg/cm3
Biosensores Ópticos
1) Detección de Vapores:
• Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de
alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y 2,6diclorindofenol sólidos dispersados sobre placas de TLC
(cromatografía en capa fina) de celulosa microcristalina
transparente.
2) Tiras colorimétricas de un solo uso:
• Los más utilizados: análisis de sangre y orina.
• Control de la glucemia en diabéticos
- Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un
cromógeno que cambia el color al ser oxidado
Cromógeno (2H) + H2O2----(peroxidasa)--->colorante + 2H2O
Biosensores Ópticos
3) Reacciones luminiscentes:
• Utilización de luciferasa
• Detecta la presencia de microorganismos en orina al
liberar ATP en su destrucción
Luciferina + ATP----(luciferasa)---> oxiluciferina + CO2 + AMP + ppi + luz
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“Un haz de luz será reflejado en su totalidad cuando incida
sobre una superficie transparente presente entre dos medios,
cuando proceda del medio con mayor índice de refracción y
cuando el ángulo de incidencia sea mayor que un valor critico”
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“En el punto donde se produce la reflexión, se induce un campo
electromagnético que penetra en el medio que tiene menor
índice de refracción”
“Este campo es denominado onda evanescente y decae
exponencialmente con la distancia de penetración,
desapareciendo tras unos pocos nanómetros”
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“La onda evanescente decae exponencialmente con la distancia
de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros”
“La profundidad a la que penetra depende del índice de
refracción, de la longitud de onda de la luz utilizada y puede ser
controlada con el ángulo de incidencia.
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“La onda evanescente puede interaccionar a su vez con el
medio, provocando un campo electromagnético que puede
volver al medio con mayor índice de refracción, dando lugar a
cambios en la luz que continúa a lo largo de la guía de ondas.”
Inmunosensor de onda evanescente
Especialmente indicados para
inmunoensayos:
• No es necesario separar el resto
de los componentes de una muestra
clínica
• La onda solo penetra hasta el
complejo antígeno anticuerpo
• Se excitan fluorocromos unidos a
la superficie mediante la onda
evanescente, y la luz emitida por
ellos volverá a la fibra óptica
• La cantidad de muestra necesaria
es mínima
Resonancia de plasma superficial
“Si la superficie del cristal está recubierta por una capa metálica
(oro, plata, paladio) los electrones de su superficie pueden
oscilar en resonancia con los fotones generando un onda de
plasma superficial y amplificando el campo evanescente en la
cara mas alejada del metal”
Resonancia de plasma superficial
“Si la capa de metal es lo suficientemente delgada como para
permitir al campo evanescente penetrar hasta la superficie
opuesta, el efecto será muy dependiente del medio adyacente al
metal”
Resonancia de plasma superficial
“Este fenómeno sucede sólo cuando la luz incide con un ángulo
específico, el cual depende de la frecuencia, el grosor de la capa
metálica y el índice de refracción del medio que se encuentra
inmediatamente sobre la superficie metálica”
Resonancia de plasma superficial
“La producción de esta resonancia de plasma superficial
absorbe parte de la energía de la luz reduciendo la intensidad de
la luz reflejada internamente”
Resonancia de plasma superficial
“Los cambios que suceden en el medio provocados por
interacciones biológicas pueden ser apreciados detectando los
cambios de intensidad de la luz reflejada o el ángulo de
resonancia”
Cambio en la absorción por
efecto de la resonancia de plasma
superficial
“Detección de la
gonadotropina
coriónica humana
(hCG) mediante un
anticuerpo unido a
la superficie del
biosensor:
La unión cause un
cambio
en
el
ángulo
de
resonancia”
Resonancia de plasma superficial
•
•
•
Permiten detectar partes por millón
Un análisis típico requiere 50µl de muestra y tarda 5 a 10 minutos
Puede utilizarse con DNA y RNA.
Biosensores celulares
Inmunosensores
Tipos de
inmunosensores