Transcript Técnicas moleculares III

INTRODUCCION A LA BIOLOGIA
CELULAR Y MOLECULAR
- MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ESTUDIO
CELULAR –
http://swehsc.pharmacy.arizona.edu/exppath/micro/lightmicro.html
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/
Características de un Microscopio
Magnificación
Resolución
Aumento que logra el
equipo en esas condiciones
Distancia mínima a la cual
el equipo puede mostrar
dos puntos separados
Microscopio: Componentes
Lentes oculares
Objetivos
Ajuste
macrométrico
Ajuste
micrométrico
Control de
voltaje
Platina
Condensador
Fuente de luz
Microscopio: Objetivos y concepto de Resolución
Resolución
Tres características críticas en el
diseño de los objetivos determina
el límite de resolución en un
microscopio:
1- longitud de onda (l): aquella
usada para iluminar la muestra
2- apertura angular (m): del cono
de luz capturado por el objetivo
Distancia mínima a la cual
el equipo puede mostrar
dos puntos separados
R= l
2n(sen m)
3- índice de refracción (n): del
medio que se encuentra entre el
objetivo y la muestra.
Resolución: Apertura numérica (NA)
Apertura numérica (NA): medida de la habilidad del objetivo
de colectar luz y de resolver detalles finos de la muestra a
una distancia fijada. Y esta determinada por:
Apertura angular(m): las ondas generadas cuando la luz
atraviesa la muestra entran en el objetivo en un cono
invertido, el corte longitudinal de este cono determinan este
parámetro. Que a su vez esta determinado por la longitud
focal del objetivo
Indice de refracción (n): del medio que se encuentra entre el
frente de la lente y el cubre objeto.
NA = n sen (m)
Resolución: Indice de refracción (n)
(a) Interfase de aire: Los rayos que atraviesan
la muestra son refractados y solamente los dos
rayos mas cercanos al eje óptico tiene el ángulo
apropiado para entrar por la lente del objetivo.
(b) Interfase de aceite: en este caso el aire se
reemplaza colocando aceite de inmersión cuyo
índice de refracción es el mismo que el del
vidrio y los rayos pasan a través de esta interfase
son ninguna desviación debido a la refracción
Resolución: Longitud de onda (l)
El espectro de luz blanca esta constituido por distintas longitudes de onda, aquellas que
poseen menor longitud son aquellas que se dispersan mas o sea que varían mas su
ángulo luego de incidir sobre la muestra.
Microscopio: Formación de la imagen y el efecto de la interferencia
Alguno de estos rayos desviados se encuentran 180º desfasados con respecto a los rayos
que no han sido modificados, causando una interferencia destructiva y que conlleva a
una reducción en la intensidad y genera áreas más o menos oscuras. Este patrón de luces
y sombras son las que finalmente generan la imagen de la muestra.
Microscopio: El problema del contraste
El contraste producido por una muestra es
una medida de distintos fenómenos entre
ellos:
* la luz absorbida
* brillo
* refractancia
* difracción
* fluorescencia
* rayos desviados
* o variaciones en el color
Entonces la capacidad de un detalle de sobresalir por sobre el background es una medida de su
contraste: porcentaje de contraste (C) = (Is –Ib) x 100 donde Is: intensidad de la muestra
Ib
Ib: intensidad del background
Microscopio de campo oscuro:
El microscopio de campo oscuro es una técnica de iluminación especializada que capitaliza
un direccionamiento oblicuo de la misma para aumentar el contraste. En el condensador se
coloca un stop opaco de tal manera que los rayos lumínicos que pasan a través de la muestra a
partir del ángulo oblicuo son difractados, refractados y reflejados hacia el objetivo generando
una imagen brillante sobre un fondo oscuro.
Microscopio de contraste de fase:
Objetos en fase son aquellos que son incapaces de
absorber luz, alterando levemente la fase de la luz en ¼
de onda con respecto a la luz de orden 0 y esto es
imperceptible para el ojo.
Esta técnica emplea un mecanismo óptico que traslada estas pequeñas diferencias en la fase de
una onda en su correspondiente cambio en la amplitud, pudiéndose visualizar como diferencias
en el contraste de la imagen.
Microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) o Nomarsky
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/differential-interference-contrast-step-by-step-guide-to-optimal-dic-setup/
Básicamente es un microscopio de luz polarizada al que se le adicionan 2 prismas, uno por
debajo del condensador y el otro por detrás del objetivo. Aumentando la resolución y evitando
la generación de artefactos.
Microscopio de Fluorescencia: Conceptos básicos de fluorescencia
Inmunofluorescencia
Fluoresceina
Rodamina
DAPI
Bromuro
de Etidio
Naranja
de Acridina
Ficoeritrina
Microscopio Confocal: No irse de plano….
Microscopios electrónicos de Barrido y Transmisión
ME de transmisión
ME de barrido
Fuente de electrones
Permiten una capacidad de aumento de hasta 500000 x en comparación de los microscopios
ópticos que solo consiguen una magnificación de 1000x, dado que el l de los electrones es
mucho menor que la de fotones.
Microscopía electrónica. Ventajas y desventajas
Ventajas
• proporciona resultados de amplia resolución y magnificación que permiten
visualizar muestras muy pequeñas.
Desventajas
• elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada y esto impide
el uso de esta técnica en cualquier laboratorio.
• altos costos de procesamiento de las muestras
• la manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición
toxica de los mismos.
• procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos
• la complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado.
Comparación entre imágenes de distintos microscopios
Microscopio electrónico de barrido
Microscopio electrónico de transmisión
Otras técnicas…….Fluorescent IN SITU Hibridization (FISH)
Es una técnica relativamente nueva donde se usan sondas de ADN marcadas fluorescentemente
para detectar o confirmar anormalidades cromosómicas o génicas, las muestras de ADN (ya sea
núcleos interfásicos o los cromosomas metafásicos) son desnaturalizadas para separar ambas
cadenas, se agrega luego la sonda de interés y se procede a la hibridización. La señal de la sonda
puede ser detectada mediante microscopía de fluorescencia.
Citometría de Flujo
Las células pueden estar vivas o fijadas pero deben estar dispersas, ya que deben pasar en fila
india a través del rayo láser en un flujo continuo de la suspensión. Cada célula dispersa parte
de la luz del láser y a su vez emite fluorescencia si estas células han sido marcadas. La luz
emitida es captada por los fotomultiplicadores (PMT) que captan una determinada longitud de.
onda y amplifican su señal. Esto me permite evaluar distintos parámetros a la vez:
1- dispersión lateral debido al diametro celular
2- dispersión ortogonal proporcional a la estructura granular de la célula
3- fluorescencia por marcaje con fluorocromos.
Citometría de flujo y cell sorting
Protocolos
Técnicas histológicas: Sirven en conjunto para facilitar el estudio de las muestras de tejidos.
 Espesor de la muestra
Técnicas de fijación: permite que el tejido a analizar no pierda su conformación durante
la manipulación y cuando es sometido al corte. Permitiendo mantener la morfología y la
composición química de la célula con la menor cantidad de artefactos. Además cuanto mayor
sea la firmeza de la muestra se podrán realizar cortes más delgados.
• Medios físicos: en general se utiliza calor o frío extremo (-160 a -190ºC) seguida de
deshidratación al vacío a -30/-40ºC
• Medios químicos: por ejemplo: formol, formaldehído, glutaraldehído, metanol o ácido
acético dependiendo del tipo de macromolécula que se quiera analizar. En general estos
compuestos llevan a la deshidratación del tejido y llevan la formación de fuertes uniones
entre las moléculas.
Desventajas: en general se generan artefactos producto de la deshidratación de la muestra
en el caso del tratamiento en frío se compensa esto.
 Espesor de la muestra: AUMENTANDO LA FIRMEZA….
1- Congelación
2- Inclusión en parafina: si bien este tratamiento aumenta la consistencia del tejido y permite
obtener secciones de menor espesor (1-50 mm) y mayor calidad. Es una sustancia hidrofóbica
por lo que primero el tejido debe ser deshidratado.
¿Cómo se realizan los cortes?
Micrótomos: son instrumentos que permiten la obtención de estos cortes ultrafinos hay de
distinto tipo; por ejemplo de congelamiento o ultramicrótomo
 Contraste de la muestra y los problemas asociados
Las características de las muestran hacen que tengan un índice de refracción similar a la luz de
orden 0 por lo tanto la muestran se suelen colorear o teñir. En general estos colorantes son
compuestos orgánicos y aromáticos; son capaces de explotar las propiedades que poseen
algunos componentes celulares de ionizarse como bases o ácidos.
Colorantes ácidos: tienen la capacidad de unirse a moléculas que presentan carga + , algunos
ejemplos son: ácido pícrico, eosina, naranja G y azul de anilina.
Colorantes básicos: tienen la capacidad de unirse a moléculas que presentan carga -, algunos
ejemplos son: azul de metileno, hematoxilina, cristal violeta, safranina.
Dado que la mayoría de los colorantes son solubles en agua las muestras deben re-hidratarse
antes de su tinción
Microscopía: Un poquito de óptica
Difracción
En física, la difracción es un fenómeno característico de las ondas que consiste
en la dispersión y curvado aparente de las ondas cuando encuentran un
obstáculo.
Reflexión y Refracción
La reflexión es el cambio abrupto en la dirección de la onda cuando ésta
llega a la unión de dos medios diferentes, regresando al medio original.
Por otro lado, la refracción es el cambio en velocidad de una onda cuando
pasa de un medio a otro. A menudo el cambio en velocidad implica un
cambio de dirección.
Dispersión de la luz
El grado con el que una onda se refracta al cambiar de medio depende de las
características propias de la onda. En el caso de la luz, no se refracta igual la
luz azul que la luz roja.
Así, cuando varias ondas viajan juntas y cambian de medio, las distintas
ondas que la forman pueden separarse, un ejemplo es un prisma.
¿Cómo funcionan las lentes de un microscopio?
La luz de un objeto muy lejano a la lente
entran en foco en un punto por detrás de la
lente = punto focal localizado en el plano
focal. La imagen virtual que se obtiene es
menor que la del objeto real.
Si ahora acercamos el objeto, vemos que
si bien la distancia focal no varia mientras que
la imagen virtual aumenta.
Si acercamos nuestro objeto hasta alcanzar
una distancia que es 2 veces la distancia focal
obtenemos una imagen virtual del mismo
tamaño que el objeto real pero invertido
2x df
Finalmente si el objeto es colocado justo
por delante de la lente el objeto virtual es
de mayor tamaño que el real, obteniéndose
una MAGNIFICACION del objeto.