Transcript Cultivos Microbianos Dr. Claudio Voget Curso CABBIO, Noviembre 2005 Relaciones entre nutrición, metabolismo y crecimiento h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h Excepto algunos átomos de C de los nucleótidos,

Cultivos Microbianos
Dr. Claudio Voget
Curso CABBIO, Noviembre 2005
Relaciones entre nutrición, metabolismo y crecimiento
h
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Excepto algunos átomos de C de los nucleótidos, la asimilación del C deriva de 8
intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA,
oxalacetato, -cetoglutarato.
Conceptos básicos de cinética microbiana
qi velocidad específica
ri velocidad volumétrica
de consumo de sustrato
o formación de producto
de consumo de sustrato
o formación de producto
(qi mmol/ g biomasa x h )
P
O2
S
qO2
qp
ri ( mmol/ litro x h )
ri = qi * X
X concentración de biomasa
µ
qS
qCO2
CO2
estado fisiológico de la célula
(flujos metabólicos)
V
rO2 = qO2 * X
Los rendimientos pueden expresarse como cociente de velocidades !
Rendimientos verdaderos y mantenimiento
rx
rs
S
rN
d1 CH2O + α1 NH3 + β1 O2 
rsx
rp
d2 CH2O + α2 NH3 + β2 O2 
rsp
NH3
O2
rO2
d3 CH2O
g1 biomasa + δ1CO2 + w1H2O + Δh1
s2 producto + δ2 CO2 + w2H2O + Δh2
+ β3 O2  mantenimiento + δ3 CO2 + w3 H2O + Δh3
rsm
Rendimientos verdaderos
y' x / s 
g 1 rx

d 1 rsx
y' p / s 
s 2 rp

d 2 rps
(d1+d2+d3) = d , (α1+ α2) =α , (β1+ β2+ β3) = β , (δ1+ δ2+ δ3) = δ, Si d=1  α=a, β=b, δ= yco2/s
CH2O + a NH3 + b O2
rx , rp
rs ,rO2
yx/s biomasa + yp/s producto + yco2/s CO2 + w H20 + Δh
Rendimientos experimentales
g 1 rx
yx / s  
d rs
s 2 rp
yp / s  
d rs
yx / s  y' x / s
yp / s  y' p / s
Ecuación lineal de consumo de sustrato (ELCS)
rs  rsx  rsp  rsm
rp = 0
rs 
rx
rs 
 ms  x
y' x / s
rx
y'x / s

rp
y'p / s
qs 
 ms  x

y' x / s
 ms
ms = 0.05 g glucosa / g biomasa x h
1
1
ms


yx / s
y' x / s

µ (h-1)
yx/s / y´x/s
0.05
0,645
0.1
0,78
0.3
0,92
Factores que afectan la velocidad de crecimiento (µ)
Ecuación de Monod µ = f(S)
Temperatura
pH
Sext
øH2O
Composición del medio
qs
u
u max
µ
membrana
celular
Se
Se  K m
qs  qs max
≡
 q y
0,8
s*
0,6
u
 0.5
u max
Sint
E
vs  v max
1,0
qi
Se
Se  K s
x/s
0,4
0,2
S  Ks
0,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
S (g/l)
cultivo
restricto
cultivo
irrestricto µ ≠ f(S)

Ks = ug a mg/l
Se
max
Se  K s
Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana
Crecimiento de Saccharomyces cereviseae
El metabolismo de S cereviseae es
netamente oxidativo hasta una µ de
0.2-0.25 h-1. Por encima de este valor
se induce la fermentación alcohólica
dando lugar a un metabolismo mixto
oxidativo-fermentativo. El rendimiento
celular
disminuye.
La
producción
aeróbica de etanol en S. cereviseae se
denomina Efecto Crabtree
µ < µcrit
CH 2O  b O2  a NH 3  yx / s X  yCO 2/ S CO2  
µ > µcrit
CH 2O  b O2  a NH 3  yx / s X  yco2/ s CO2  yp / s EtOH  
Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana
Parámetros de crecimiento y actividad β-galactosidasa
Cultivo Continuo (µ = 0.1 h-1)
Nutriente
limitante
Yx/s
g/g
Actividad
LAU/mg
Carbohidratos
totales %
Proteína
%
Glucosa
0.44
0.19
30
42.5
Lactosa
0.47
18
30
43.5
Amonio
0.38
3.2
52
29
-
-
Batch (fase estacionaria)
Lactosa
0.40
4.3
Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 ºC, pH 4.7, Medio definido
Sistemas de cultivo
Los procesos fermentativos
dividirse básicamente en 2
grupos
pueden
grandes
Fermentaciones líquidas sumergidas (FLS)
Contenido de agua del medio 90-95 %
Fermentaciones en sustrato sólido (FSS)
El medio son partículas húmedas con ausencia o
casi ausencia de agua libre
Reactores empleados en fermentaciones líquidas
sumergidas
Fermentación en sustrato sólido
Hay dos formas básicas de cultivos sólidos
Cultivos
en
sustratos
naturales
(granos,
residuos
agroindustriales)
Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo
(inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano)
Comparación a
nivel de
microescala
entre FLS y FSS
Tipos de reactores empleados en fermentaciones en
sustrato sólido
Comparación entre FSS y fermentación líquida sumergida
FSS
Fermentación sumergida
Medios simples. Requieren adición de agua o una
solución mineral. Sustratos variables
Medios con mayor cantidad de ingredientes,
mayor costo. Buena reproducibilidad en medios
definidos
Bajo øH20 reduce riesgos de contaminación
Mayores riesgos de contaminación
Medios concentrados. Elevada concentración de
producto Menor volumen de reactor
Medios diluídos, Volúmenes de fermentación
grandes. Altas concentraciones de medio puede
afectar crecimiento. Alimentación de sustrato es
común
Menor consumo de energia para aerear
Transferencia G-L es generalmente limitante
Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusión
puede limitar el proceso
Mezclado intenso.
La difusión de nutrientes es generalmente no
limitante
Remoción de calor es crítica. Transferencia de
calor por evaporación puede ser importante
Alto contenido de agua facilita control de Tra
Control del proceso dificultosa.
Estimación de biomasa no es directa
Amplio desarrollo en sistemas de medición y
control
Downstream processing simple. Contaminación
de producto con componentes del medio es alta
Bajos volúmenes de efluentes líquidos
La remoción de grandes volúmenes de agua
aumenta costos en los procesos de separación y
purificación
Cinética y fenómenos de transporte poco
conocidos
Modelos cinéticos y difusionales
Operación de reactores
Y, Fgs
Co, Fo,
VL
VG
C
Y
C, FS
Ecuaciones de
balance
interfase G-L
d CVL
Fase líquida
Fase gaseosa
Yo, Fgo
dt
 Fo Co  Fs C  ri VL  rdi VL  transfiere
dYVG
 Fgo Yo  Fgs Y
dt

transfiere
Cultivo Batch
Es el cultivo mas simple
Volumen constante
Cerrado para fase líquida Fo = Fs = 0
Composición inicial del medio determina el curso del cultivo
5
20
15
r max
o2
S0
4
X (biomasa) g/l
25
rO2
(mmol / L x h)
30
10
8
X
f
3
6
2
4
1
2
10
5
0
X0
0
Sf
0
2
4
6
8
10
tiempo (h)
inóculo
Fase exponencial
12
14
glucosa (g/l)
35
Xf  Xo
Y x/s  
Sf  S 0
Xf  Xo
Yx / o  t
0 ro 2 dt
Cultivo Batch
Fo  Fs  0
d Ci
dt
 ri

transfiere
VL  cte
ó
1,5
dt
 ri
Balance para biomasa
1,0
estacionaria
desaceleración
0,5
ln X
d Ci
dX
dt
0,0
m (pendiente) =
-0,5
 rx   X
dX
µmax
dt
-1,0
-1,5
0
Lag
2
4
6
tiempo (h)
  max X
X  Xo e
exponencial
8
10
12
  f (t )
max t
ln Xt  ln Xi   max t
Velocidades de crecimiento de microorganismos y células
Cultivo
µ (h-1)
tiempo de
duplicación
(h)
bacterias
0,6-1,4
0,5-1,15
levaduras y
hongos
filamentosos
0,2-0,6
1,15-3,0
células animales
0,01-0,04
17-70
células vegetales
0,007-0,03
23-100
Fase de desaceleración y estacionaria
Puede deberse a inhibición por producto, agotamiento de
nutrientes, limitación por oxígeno
En medios complejos la fase de desaceleración es mas
extendida en comparación con medios definidos.
La característica de la biomasa al final del batch puede ser
controlada con la composición inicial del medio (el cultivo
puede limitarse en C, N, P, etc)
En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a
la falta de nutrientes (condición de starvation): supervivencia
prolongada, incremento en la resistencia a condiciones de
stress (salino, térmico, oxidativo, osmótico), etc. Hay expresión
diferencial de genes al entrar al estado estacionario
Algunas células pierden la capacidad de reproducirse, pero se
mantienen viables (viables no cultivables)
Desventajas del cultivo batch
Dificultad de controlar el µ, excepto variando la
composición del medio o las condiciones de proceso
Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el
crecimiento debido al aumento de la presión osmótica del
medio o toxicidad de nutrientes
Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación
debido a una insuficiente capacidad del reactor para
transferir O2 al medio
Inconvenientes para remover calor
Tiempos muertos entre
productividad. Pie de cuba
procesos
disminuye
la
Cultivo continuo
El tipo básico es el quimiostato, que consiste en una
suspensión celular perfectamente mezclada a la cual se
adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira
cultivo a igual velocidad, de este modo el VL es cte. La
composición del medio que se alimenta se diseña según que
sustrato es el limitante
Cio
rebalse
Ci
medio
fresco
reservorio
Fo
bomba
BIOREACTOR
Fo, Ci
Cultivo continuo
10
4
X
X (g/l)
3
6
2
4
transitorio
1
estacionario
2
s
0
0
10
20
30
tiempo (h)
inicio alimentación
40
0
50
Sustrato limitante (g/l)
8
Cultivo continuo
VL  cte
Fo  Fs  F
VL
d Ci
dt
 F (Cio  Ci )  ri VL  transfiere
en e.e
d Ci
dt
0
D (Cio  C i)  ri  transfiere 0
D
F
VL
D velocidad de dilución (h
1
)
Cultivo continuo
Balance de biomasa
rx  D X
como
rx   X entonces   D
Balance de sustrato
rs  D ( So  S )
qs 
yx / s 
D ( So  S )
X
Balance de producto
rp  D P
qp 
D P
X
rx
rs

X
D (S 0 S )
Cultivo continuo
   max
S
Ks  S
D   max
S
Ks  S
S 
D Ks
 max  D
Balance de sustrato con mantenimiento (rp = 0)
rx
D ( So S )  (
 ms X )  0
y 'x / s
X 
Y 'x / s D ( So  S )
D  ms Y 'x / s
Cultivo continuo
X 
Y 'x / s D ( So  S )
D  ms Y 'x / s
1,2
 max  D
2,5
X (ms= 0)
1,0
µmax = 1.0 h-1
2,0
0,8
1,5
0,6
1,0
0,4
0,5
0,0
0,0
0,0
Y´x/s = 0,5 gX /gS
ms = 0,05 gS/gX h
Ks = 5 mg/l
X
0,2
glucosa (g/l)
X (biomasa) g/l
S 
D Ks
0,2
0,4
0,6
-1
D (h )
0,8
1,0
S0 = 2,0 g/l
Aplicaciones del cultivo continuo
Estudios fisiológicos. Se puede discriminar el efecto de
la velocidad de crecimiento y de las condiciones de
cultivo en la fisiología celular.
Varío la composición del medio y parámetros del
cultivo a µ =cte
Varío µ manteniendo cte el resto de los parámetros
Muestreo estadístico en el estado estacionario
Inconvenientes del sistema continuo
Inestabilidad genética de la cepa, pérdida de
plásmidos
Contaminación
Imposibilidad de establecer estado estacionario
Cultivo batch alimentado (B.A)
Es un cultivo que se alimenta con medio fresco. El volumen varía
con el tiempo pues no se retira cultivo. Dos tipos de B.A
Controlado por alimentación: el cultivo sigue el curso que le
dicta la alimentación
Con alimentación controlada: el estado del cultivo ( captado
por sensores ) controla la alimentación
Vf
C(t)
reservorio
Vr = Vf - Vo
Vo
F(t)
bomba
C(t)
V(t)
BIOREACTOR
Cultivo B. A
d (CV )
 F (t ) C(t )  ri V
dt
Balance de biomasa
d ( XV )
dt
 rx V
Balance de sustrato
d ( SV )
dt
 F (t ) Sr (t )  rs V
Balance de producto
d ( PV )
dt
 rp V
F  cte
Cultivo B. A
d ( XV )
dt

rx V
Si ms  0
d ( SV )
dt
0
d ( SV )
  ( XV )
d ( SV )
dt
dt
 F Sr 
 F Sr 
rs V
 ( XV )
d ( XV )
dt
Sr  cte
Yx / s
 F Sr Yx / s
XV  Xo Vo  F Sr Yx / s t
F  cte
Cultivo B. A
 ( XV )
d ( SV )
 F Sr 

dt
Y 'x / s
Si ms  0
d ( XV )

dt
( XV ) 
F Sr
ms
Sr  cte
ms ( XV )
ms ( XV ) Y 'x / s  F Sr Y 'x / s
 ( XoVo 
F Sr
ms
) e  ms Y 'x/ s t
t   XV  ( XV )max 
F Sr
ms
Cultivo B. A
El objetivo del BA es básicamente controlar el µ
Limitar la demanda de O2 del cultivo
ro2  qo2 X 

Yx / o
X
Obtener altas concentraciones de X evitando el efecto
osmótico y tóxico de nutrientes
Incrementar el qp (metabolitos secundarios, proteínas
recombinantes) para maximizar el Yp/s.
Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en
levaduras)