Transcript PCR - FPIK Unpad - Universitas Padjadjaran
Slide 1
APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL
DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS
PADA KEPITING
SIDANG KOMPREHENSIF
RINA NOVITA PRANAWATY
NPM. 230110080062
Dibawah bimbingan:
Ir. Ibnu Dwi Buwono, Msi
Ir. Evi Liviawaty, MP
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI PERIKANAN
JATINANGOR
Slide 2
LATAR BELAKANG...
Serangan virus
white spot
Metoda
Deteksi Virus
• PCR
Konvensional
• Real Time PCR
Produksi
Udang Windu
Organisme
Carrier
Slide 3
PCR Konvensional
PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA
dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA
target secara in vitro.
Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi
keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan
keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah
dilakukan proses elektroforesis.
Slide 4
Real Time PCR
Real Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda
analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR
adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk
mengamplifikasi
(memperbanyak)
sekaligus menghitung
(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut (Fatimi 2010).
Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat
lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk
menghitung jumlah kopi DNA atau threshold cycle (Ct) dari
patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).
Slide 5
IDENTIFIKASI
MASALAH
• Berdasarkan uraian diatas maka dapat
diidentifikasi masalah yaitu sejauh mana potensi
dan tingkat serangan kepiting sebagai carrier
dalam penginfeksian penyakit White Spot
Syndrome Virus pada udang windu dengan
menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR
TUJUAN
PENELITIAN
• Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi
White Spot Syndrome Virus yang terbaik pada
kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi
udang windu dengan menggunakan PCR
Konvensional dan Real Time PCR.
KEGUNAAN
PENELITIAN
• Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi kepada petambak udang windu tentang
potensi kepiting yang merupakan carrier WSSV
yang menyerang udang windu sehingga petambak
dapat mengantisipasi secara dini penyakit WSSV.
Slide 6
Pendekatan Masalah...
Budidaya Udang Windu
Mengalami penurunan
produksi
Penurunan
mutu
lingkungan
Serangan
penyakit
Hama
Organisme
carrier
Hasil Penelitian
Deteksi
PCR
Konvensional
Kepiting
Real
Time PCR
Slide 7
Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi
WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa
ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium
yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung
menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam
Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier
dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR.
Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel
kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa
gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one
step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji
Nested PCR.
Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real
time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning
digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per
rekasi. Pada pengujian 1 sampai 108 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas
deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time
PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 104 kopi/µg DNA.
Slide 8
TEMPAT
WAKTU
Pengambilan sampel dilakukan di
tambak udang windu di Kecamatan
Indramayu dan Pasekan Kabupaten
Indramayu.
Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium
Bioteknologi Perikanan Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas
Padjadjaran
Pemeriksaan dengan PCR konvensional
dan pemeriksaan dengan real time PCR
dilakukan di Laboratorium Biologi
Molekuler Balai Uji Standar Karantina
Ikan Jakarta
Penelitian ini dilaksanakan
pada Bulan Mei sampai Juli
2012.
Slide 9
Alat-Alat Penelitian
Pengambilan Sampel
• Botol plastik, cool box
Isolasi
• Autoclave, Analytical balance, gunting, pinset, sumpit plastik, mikrotube 1,5 ml, rak
mikrotube, centrifuge, refrigerator, waterbath, vortex, mikropipet, mikrotips, timer,,
sarung tangan, spidol marker
Amplifikasi
• PCR Chamber, GeneAmp PCR System 9700, Mesin Rotor-Gene Q yang dihubungkan
dengan perangkat komputer, vortex, microcentrifuge, deep freezer, mikrotube 0,2 ml
dan 0,5 ml, mikropipet, mikrotips, cooler block, beaker glass, sarung tangan
Elektroforesis
• Bejana elektroforesis dilengkapi dengan power supply, tangki, sisir, tutup, Analytical
balance, Botol Scott, Gelas ukur ukuran 50 ml, corong, microwave, Ultraviolet
illuminator, sendok kecil, mikropipet, mikrotips, waterpass, cooler block, parafilm,
sendok pipih, refrigerator, kamera digital, sarung tangan
Slide 10
BAHAN-BAHAN PENELITIAN
Metode PCR Konvensional
Pengambilan
Sampel
• Larutan
Preservasi
Alkohol : Gliserol
(4:1)
• Es Curai
Isolasi
• Sampel kepiting
• Nuclei Lysis
Solution
• 0,5M EDTA pH
8,0
• Proteinase K
• RNase Solution
• Protein
Precipitation
Solution
• Isopropanol
• Ethanol 70%
• DNA Rehydration
Solution
• Es curai
Amplifikasi
• Promega Go
Taq® Green
Master Mix
• Plasmid (+)
standar sebagai
kontrol positif
WSSV
• Nuclease Free
Water (NFW)
• Primer WSSV
270 dan WSSV
345
• DNA template
Elektroforesis
• Agarose
• TAE (Tris Acetic
Acid EDTA) Buffer
50X
• Sybr Safe
• Loading Dye
• DNA Marker
• Ethidium Bromide
(EtBr)
• Aquadest Steril
Metode Real Time
PCR
Amplifikasi
dengan Real
Time PCR
• Rnase-free water,
• 2x QuantiTect
Probe PCR Master
Mix
• Primer WSSV
270 dan Primer
WSSV 345
• Probe WSSV
296T
• Standar Positif
(+) WSSV 2 x
105
• DNA template
Slide 11
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah metode
survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin
ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni
pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan
analisis data.
Slide 12
PROSEDUR PENELITIAN
Pengambilan
Sampel
Kepiting sebanyak
7 ekor dari setiap
lokasi tambak
Isolasi
Pemeriksaan dengan
PCR Konvensional
Pemeriksaan dengan
Real Time PCR
Amplifikasi
Setting Profil PCR
Elektroforesis
Preparasi Reagen PCR
Proses Real Time PCR
Analisis
Data
Interpretasi Data
Slide 13
First Step PCR
8,5µl NFW x (jumlah
sampel + 2)*
23µl
1µl F1 x (jumlah
sampel + 2)*
23µl
1µl R1 x (jumlah
sampel + 2)*
12,5µl Master Mix x
(jumlah sampel + 2)*
23µl
23µl
Kontrol Negatif
2 µl template
DNA sampel
2 µl template
DNA sampel
2 µl plasmid +
sebagai kontrol
positif
Slide 14
ELEKTROFORESIS
Pembuatan Gel Agarose
Loading Hasil Amplifikasi
PCR
Running Elektroforesis
Dokumentasi Gel dengan
UV
Slide 15
1µl + 9µl
NFW
1µl + 9µl
NFW
Pengenceran
Standar Positif
Stok 105
9 µl Rnase-free water x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl NTC
12.25 µl 2x QuantiTect
Probe PCR Master Mix x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl template
DNA sampel
23µl
2 µl template
DNA sampel
104
0.5µl Primer WSSV270 x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl template
DNA sampel
Pembuatan
Campuran
Reaksi Real
Time PCR
103
0.5µl Primer WSSV345 x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl plasmid
kontrol + 105
0.5µl Probe WSSV296T x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl plasmid
kontrol + 104
23µl
2 µl plasmid
kontrol + 103
Slide 16
Analisa Data...
Data yang diperoleh dari hasil penelitian
akan dianalisis secara deskriptif kualitatif
yaitu membandingkan hasil DNA WSSV
yang terdeteksi dengan menggunakan metoda
PCR Konvensional dan Real Time PCR.
Slide 17
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan Gejala Klinis
Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA
Genom
Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR
Konvensional
Hasil Deteksi Wssv Dengan Real Time
PCR
Perbandingan Hasil Deteksi PCR
Konvensional Dan Real Time PCR
Slide 18
PENGAMATAN GEJALA KLINIS
Lokasi
Organisme
Scylla serrata
Helice tridens
Pachygrapsus marmoratus
Helice tridens
Ocypode quadrata
Uca minax
Pasekan
Karangsong
Total
Jumlah (ekor)
2
1
4
4
1
2
14
Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis
terserang virus white spot, yaitu adanya bintik putih pada bagian tubuh.
Slide 19
Pengukuran
Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom
1
Sampel
Pachygrapsus marmoratus (A1)
Pachygrapsus marmoratus (A2)
Pachygrapsus marmoratus (A3)
Pachygrapsus marmoratus (A4)
Scylla serrata (B1)
Scylla serrata (B2)
Helice tridens (C1)
Helice tridens (D1)
Helice tridens (D2)
Helice tridens (D3)
Helice tridens (D4)
Uca minax (D5)
Ocypode quadrata (D6)
Uca minax (D7)
Panjang Gelombang
(nm)
A260
A280
0,031
0,012
0,039
0,018
0,001
0,009
0,133
0,074
0,021
0,007
0,067
0,035
0,016
0,004
0,200
0,111
0,109
0,050
0,354
0,180
0,115
0,053
0,099
0,046
0,059
0,026
0,064
0,030
Konsentrasi/
C (ng/µl)
160
185
5
665
105
330
75
1005
540
1765
565
490
290
320
Rasio
Absorbansi
(R)
2,583
2,167
0,111
1,797
3,000
1,914
4,000
1,802
2,180
1,967
2,170
2,152
2,269
2,133
SPEKTROFOTOMETER
1
ELEKTROFORESIS
2 3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Slide 20
:
Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional
1
M
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Keterangan :
M
= Marker 100 bp DNA Ladder
9
= Sampel C1 Helice Tridens
1
= Kontrol Positif (76 bp)
10
= Sampel D1 Helice Tridens
2
= Kontrol Negatif
11
= Sampel D2 Helice Tridens
3
= Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)
12
= Sampel D3 Helice Tridens
4
= Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)
13
= Sampel D4 Helice Tridens
5
= Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)
14
= Sampel D5 Uca minax
6
= Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus
15
= Sampel D6 Ocypode quadrata (76 bp)
7
= Sampel B1 Scylla serrata (76 bp)
16
= Sampel D7 Uca minax (76 bp)
8
= Sampel B2 Scylla serrata (76 bp)
Slide 21
Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR
Pengenceran Standar
Kurva
CT (Siklus ke-)
y = -4.457x + 39.629
Kurva standar sampel sampel asal
tambak Karangsong memiliki nilai
slope -4.64589, nilai efisiensi
64,15% dan nilai R2 mencapai
0.99941. Persamaan garis dari
kurva standar yaitu y = -4.646x +
43.805 dengan y adalah nilai Ct
dan x adalah log konsentrasi virus
yang diuji.
CT (Siklus ke-)
Konsentrasi WSSV
Kurva standar sampel asal tambak
Pasekan memiliki nilai slope 4,45724, nilai efisiensi 67,63%
dan nilai R2 mencapai 0.99398.
Adapun persamaan garis dari kurva
standar yaitu y = -4.457x + 39.629
dengan y adalah nilai Ct dan x
adalah log konsentrasi virus yang
diuji.
Konsentrasi WSSV
Slide 22
Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan
Keterangan :
6 Sampel positif WSSV
1 Sampel negatif WSSV
Slide 23
Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong
Keterangan :
6 Sampel positif WSSV
1 Sampel negatif WSSV
Slide 24
PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR
KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR
Nilai Ct
Jumlah Kopi
WSSV
Std wssv 2 x 105
16.20
180,335.5
Kontrol +
Std wssv 2 x
104
20.06
24,599.6
3.
Kontrol +
Std wssv 2 x 103
25.12
1,803.4
4.
A1
Pachygrapsus marmoratus
Positif
Positif
29.84
157.0
5.
A2
Pachygrapsus marmoratus
Positif
Positif
30.86
92.5
6.
A3
Pachygrapsus marmoratus
Positif
Positif
31.68
60.8
7.
A4
Pachygrapsus marmoratus
Negatif
Positif
30.92
89.9
8.
B1
Scylla serrata
Positif
Positif
30.19
131.2
9.
B2
Scylla serrata
Positif
Positif
31.67
61.0
10.
C1
Helice tridens
Negatif
Negatif
-
-
11.
D1
Helice tridens
Negatif
Positif
37.39
24.1
12.
D2
Helice tridens
Negatif
Negatif
-
-
13.
D3
Helice tridens
Negatif
Positif
37.83
19.3
14.
D4
Helice tridens
Negatif
Positif
37.78
19.8
15.
D5
Uca minax
Negatif
Positif
37.19
26.5
16.
D6
Ocypode quadrata
Positif
Positif
36.67
34.3
17.
D7
Uca minax
Positif
Positif
35.03
77.6
No.
Kode
Sampel
Spesies
1.
Kontrol +
2.
PCR Konvensional*
Keterangan :
12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV)
2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV
Real Time
PCR
Slide 25
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinis
dibandingkan dengan PCR konvensional.
2. Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah Pachygrapsus marmoratus,
Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax.
3. Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76
bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan
Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan
Indramayu.
4. Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan
adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel
Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice
tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan
Indramayu.
SARAN
Berdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan
penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis,
serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.
Slide 26
TERIMA KASIH
APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL
DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS
PADA KEPITING
SIDANG KOMPREHENSIF
RINA NOVITA PRANAWATY
NPM. 230110080062
Dibawah bimbingan:
Ir. Ibnu Dwi Buwono, Msi
Ir. Evi Liviawaty, MP
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI PERIKANAN
JATINANGOR
Slide 2
LATAR BELAKANG...
Serangan virus
white spot
Metoda
Deteksi Virus
• PCR
Konvensional
• Real Time PCR
Produksi
Udang Windu
Organisme
Carrier
Slide 3
PCR Konvensional
PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA
dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA
target secara in vitro.
Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi
keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan
keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah
dilakukan proses elektroforesis.
Slide 4
Real Time PCR
Real Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda
analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR
adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk
mengamplifikasi
(memperbanyak)
sekaligus menghitung
(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut (Fatimi 2010).
Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat
lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk
menghitung jumlah kopi DNA atau threshold cycle (Ct) dari
patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).
Slide 5
IDENTIFIKASI
MASALAH
• Berdasarkan uraian diatas maka dapat
diidentifikasi masalah yaitu sejauh mana potensi
dan tingkat serangan kepiting sebagai carrier
dalam penginfeksian penyakit White Spot
Syndrome Virus pada udang windu dengan
menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR
TUJUAN
PENELITIAN
• Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi
White Spot Syndrome Virus yang terbaik pada
kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi
udang windu dengan menggunakan PCR
Konvensional dan Real Time PCR.
KEGUNAAN
PENELITIAN
• Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi kepada petambak udang windu tentang
potensi kepiting yang merupakan carrier WSSV
yang menyerang udang windu sehingga petambak
dapat mengantisipasi secara dini penyakit WSSV.
Slide 6
Pendekatan Masalah...
Budidaya Udang Windu
Mengalami penurunan
produksi
Penurunan
mutu
lingkungan
Serangan
penyakit
Hama
Organisme
carrier
Hasil Penelitian
Deteksi
PCR
Konvensional
Kepiting
Real
Time PCR
Slide 7
Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi
WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa
ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium
yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung
menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam
Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier
dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR.
Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel
kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa
gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one
step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji
Nested PCR.
Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real
time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning
digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per
rekasi. Pada pengujian 1 sampai 108 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas
deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time
PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 104 kopi/µg DNA.
Slide 8
TEMPAT
WAKTU
Pengambilan sampel dilakukan di
tambak udang windu di Kecamatan
Indramayu dan Pasekan Kabupaten
Indramayu.
Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium
Bioteknologi Perikanan Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas
Padjadjaran
Pemeriksaan dengan PCR konvensional
dan pemeriksaan dengan real time PCR
dilakukan di Laboratorium Biologi
Molekuler Balai Uji Standar Karantina
Ikan Jakarta
Penelitian ini dilaksanakan
pada Bulan Mei sampai Juli
2012.
Slide 9
Alat-Alat Penelitian
Pengambilan Sampel
• Botol plastik, cool box
Isolasi
• Autoclave, Analytical balance, gunting, pinset, sumpit plastik, mikrotube 1,5 ml, rak
mikrotube, centrifuge, refrigerator, waterbath, vortex, mikropipet, mikrotips, timer,,
sarung tangan, spidol marker
Amplifikasi
• PCR Chamber, GeneAmp PCR System 9700, Mesin Rotor-Gene Q yang dihubungkan
dengan perangkat komputer, vortex, microcentrifuge, deep freezer, mikrotube 0,2 ml
dan 0,5 ml, mikropipet, mikrotips, cooler block, beaker glass, sarung tangan
Elektroforesis
• Bejana elektroforesis dilengkapi dengan power supply, tangki, sisir, tutup, Analytical
balance, Botol Scott, Gelas ukur ukuran 50 ml, corong, microwave, Ultraviolet
illuminator, sendok kecil, mikropipet, mikrotips, waterpass, cooler block, parafilm,
sendok pipih, refrigerator, kamera digital, sarung tangan
Slide 10
BAHAN-BAHAN PENELITIAN
Metode PCR Konvensional
Pengambilan
Sampel
• Larutan
Preservasi
Alkohol : Gliserol
(4:1)
• Es Curai
Isolasi
• Sampel kepiting
• Nuclei Lysis
Solution
• 0,5M EDTA pH
8,0
• Proteinase K
• RNase Solution
• Protein
Precipitation
Solution
• Isopropanol
• Ethanol 70%
• DNA Rehydration
Solution
• Es curai
Amplifikasi
• Promega Go
Taq® Green
Master Mix
• Plasmid (+)
standar sebagai
kontrol positif
WSSV
• Nuclease Free
Water (NFW)
• Primer WSSV
270 dan WSSV
345
• DNA template
Elektroforesis
• Agarose
• TAE (Tris Acetic
Acid EDTA) Buffer
50X
• Sybr Safe
• Loading Dye
• DNA Marker
• Ethidium Bromide
(EtBr)
• Aquadest Steril
Metode Real Time
PCR
Amplifikasi
dengan Real
Time PCR
• Rnase-free water,
• 2x QuantiTect
Probe PCR Master
Mix
• Primer WSSV
270 dan Primer
WSSV 345
• Probe WSSV
296T
• Standar Positif
(+) WSSV 2 x
105
• DNA template
Slide 11
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah metode
survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin
ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni
pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan
analisis data.
Slide 12
PROSEDUR PENELITIAN
Pengambilan
Sampel
Kepiting sebanyak
7 ekor dari setiap
lokasi tambak
Isolasi
Pemeriksaan dengan
PCR Konvensional
Pemeriksaan dengan
Real Time PCR
Amplifikasi
Setting Profil PCR
Elektroforesis
Preparasi Reagen PCR
Proses Real Time PCR
Analisis
Data
Interpretasi Data
Slide 13
First Step PCR
8,5µl NFW x (jumlah
sampel + 2)*
23µl
1µl F1 x (jumlah
sampel + 2)*
23µl
1µl R1 x (jumlah
sampel + 2)*
12,5µl Master Mix x
(jumlah sampel + 2)*
23µl
23µl
Kontrol Negatif
2 µl template
DNA sampel
2 µl template
DNA sampel
2 µl plasmid +
sebagai kontrol
positif
Slide 14
ELEKTROFORESIS
Pembuatan Gel Agarose
Loading Hasil Amplifikasi
PCR
Running Elektroforesis
Dokumentasi Gel dengan
UV
Slide 15
1µl + 9µl
NFW
1µl + 9µl
NFW
Pengenceran
Standar Positif
Stok 105
9 µl Rnase-free water x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl NTC
12.25 µl 2x QuantiTect
Probe PCR Master Mix x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl template
DNA sampel
23µl
2 µl template
DNA sampel
104
0.5µl Primer WSSV270 x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl template
DNA sampel
Pembuatan
Campuran
Reaksi Real
Time PCR
103
0.5µl Primer WSSV345 x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl plasmid
kontrol + 105
0.5µl Probe WSSV296T x
(jumlah sampel + 4)*
23µl
2 µl plasmid
kontrol + 104
23µl
2 µl plasmid
kontrol + 103
Slide 16
Analisa Data...
Data yang diperoleh dari hasil penelitian
akan dianalisis secara deskriptif kualitatif
yaitu membandingkan hasil DNA WSSV
yang terdeteksi dengan menggunakan metoda
PCR Konvensional dan Real Time PCR.
Slide 17
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan Gejala Klinis
Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA
Genom
Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR
Konvensional
Hasil Deteksi Wssv Dengan Real Time
PCR
Perbandingan Hasil Deteksi PCR
Konvensional Dan Real Time PCR
Slide 18
PENGAMATAN GEJALA KLINIS
Lokasi
Organisme
Scylla serrata
Helice tridens
Pachygrapsus marmoratus
Helice tridens
Ocypode quadrata
Uca minax
Pasekan
Karangsong
Total
Jumlah (ekor)
2
1
4
4
1
2
14
Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis
terserang virus white spot, yaitu adanya bintik putih pada bagian tubuh.
Slide 19
Pengukuran
Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom
1
Sampel
Pachygrapsus marmoratus (A1)
Pachygrapsus marmoratus (A2)
Pachygrapsus marmoratus (A3)
Pachygrapsus marmoratus (A4)
Scylla serrata (B1)
Scylla serrata (B2)
Helice tridens (C1)
Helice tridens (D1)
Helice tridens (D2)
Helice tridens (D3)
Helice tridens (D4)
Uca minax (D5)
Ocypode quadrata (D6)
Uca minax (D7)
Panjang Gelombang
(nm)
A260
A280
0,031
0,012
0,039
0,018
0,001
0,009
0,133
0,074
0,021
0,007
0,067
0,035
0,016
0,004
0,200
0,111
0,109
0,050
0,354
0,180
0,115
0,053
0,099
0,046
0,059
0,026
0,064
0,030
Konsentrasi/
C (ng/µl)
160
185
5
665
105
330
75
1005
540
1765
565
490
290
320
Rasio
Absorbansi
(R)
2,583
2,167
0,111
1,797
3,000
1,914
4,000
1,802
2,180
1,967
2,170
2,152
2,269
2,133
SPEKTROFOTOMETER
1
ELEKTROFORESIS
2 3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Slide 20
:
Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional
1
M
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Keterangan :
M
= Marker 100 bp DNA Ladder
9
= Sampel C1 Helice Tridens
1
= Kontrol Positif (76 bp)
10
= Sampel D1 Helice Tridens
2
= Kontrol Negatif
11
= Sampel D2 Helice Tridens
3
= Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)
12
= Sampel D3 Helice Tridens
4
= Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)
13
= Sampel D4 Helice Tridens
5
= Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)
14
= Sampel D5 Uca minax
6
= Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus
15
= Sampel D6 Ocypode quadrata (76 bp)
7
= Sampel B1 Scylla serrata (76 bp)
16
= Sampel D7 Uca minax (76 bp)
8
= Sampel B2 Scylla serrata (76 bp)
Slide 21
Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR
Pengenceran Standar
Kurva
CT (Siklus ke-)
y = -4.457x + 39.629
Kurva standar sampel sampel asal
tambak Karangsong memiliki nilai
slope -4.64589, nilai efisiensi
64,15% dan nilai R2 mencapai
0.99941. Persamaan garis dari
kurva standar yaitu y = -4.646x +
43.805 dengan y adalah nilai Ct
dan x adalah log konsentrasi virus
yang diuji.
CT (Siklus ke-)
Konsentrasi WSSV
Kurva standar sampel asal tambak
Pasekan memiliki nilai slope 4,45724, nilai efisiensi 67,63%
dan nilai R2 mencapai 0.99398.
Adapun persamaan garis dari kurva
standar yaitu y = -4.457x + 39.629
dengan y adalah nilai Ct dan x
adalah log konsentrasi virus yang
diuji.
Konsentrasi WSSV
Slide 22
Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan
Keterangan :
6 Sampel positif WSSV
1 Sampel negatif WSSV
Slide 23
Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong
Keterangan :
6 Sampel positif WSSV
1 Sampel negatif WSSV
Slide 24
PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR
KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR
Nilai Ct
Jumlah Kopi
WSSV
Std wssv 2 x 105
16.20
180,335.5
Kontrol +
Std wssv 2 x
104
20.06
24,599.6
3.
Kontrol +
Std wssv 2 x 103
25.12
1,803.4
4.
A1
Pachygrapsus marmoratus
Positif
Positif
29.84
157.0
5.
A2
Pachygrapsus marmoratus
Positif
Positif
30.86
92.5
6.
A3
Pachygrapsus marmoratus
Positif
Positif
31.68
60.8
7.
A4
Pachygrapsus marmoratus
Negatif
Positif
30.92
89.9
8.
B1
Scylla serrata
Positif
Positif
30.19
131.2
9.
B2
Scylla serrata
Positif
Positif
31.67
61.0
10.
C1
Helice tridens
Negatif
Negatif
-
-
11.
D1
Helice tridens
Negatif
Positif
37.39
24.1
12.
D2
Helice tridens
Negatif
Negatif
-
-
13.
D3
Helice tridens
Negatif
Positif
37.83
19.3
14.
D4
Helice tridens
Negatif
Positif
37.78
19.8
15.
D5
Uca minax
Negatif
Positif
37.19
26.5
16.
D6
Ocypode quadrata
Positif
Positif
36.67
34.3
17.
D7
Uca minax
Positif
Positif
35.03
77.6
No.
Kode
Sampel
Spesies
1.
Kontrol +
2.
PCR Konvensional*
Keterangan :
12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV)
2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV
Real Time
PCR
Slide 25
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinis
dibandingkan dengan PCR konvensional.
2. Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah Pachygrapsus marmoratus,
Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax.
3. Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76
bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan
Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan
Indramayu.
4. Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan
adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel
Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice
tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan
Indramayu.
SARAN
Berdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan
penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis,
serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.
Slide 26
TERIMA KASIH