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ESFEROCITOSIS
HEREDITARIA
Experiencia en el Hospital Posadas
Bioq. Aliano Analía
Bioq. Fanessi Viviana


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Introducción: Anemias
hemolíticas
Las anemias hemolíticas (AH) resultan de
una menor sobrevida eritrocitaria.
 Características:
Acumulación productos degradación de Hb
Aumento actividad médula ósea

anemias regenerativas


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Clasificación de las Anemias Hemolíticas
1. Por defectos corpusculares


Hereditarios
Anormalidades de membrana: Esferocitosis Hereditaria,
Eliptocitosis, etc
Anormalidades de la hemoglobina
Estructurales : Hb S, Hb C, etc
Velocidad de síntesis: Talasemias
Anormalidades del metabolismo: deficit de G6PDH, PK, etc.



Adquiridos

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
2. Por defectos extra corpusculares (adquiridos)


Por anticuerpos

An Hem autoinmune







Idiopáticas
Secundarias: Infecciones, drogas, enf hematológicas, colagenopatías

An Hem alloinmune: postransfusional, Enf Hemolítica del recién nacido

Por traumatismo mecánico
Anemia hemolítica microangiopática: SUH, PTT, CID, etc
Valvulopatías aórtica
Prótesis Valvulares



Por tóxicos directos: Infecciones, toxinas, agentes físicos y qcos, venenos serpientes y arañas



Por estímulo externo: esfuerzo, quemaduras



Por hepatopatía



Por hiperesplenismo


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Interacciones verticales

Membrana del eritrocito
Glicoforina A
Banda
3

Glicoforina C
Banda
3

Banda
3

Banda
3
Adducina

4.2

4.1

4.9

Ankirina

Actina
β Espectrina β

p55

Tropomiosina

α Espectrina

Tropomodulina

Interacciones horizontales


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Esferocitosis Hereditaria(SH)
 Síndrome caracterizado por: presencia de

esferocitos en sangre periférica, anemia,
ictericia y esplenomegalia.
 Expresión heterogénea si consideramos la

severidad de la enfermedad, la alteración
proteica involucrada y el modo de
transmisión.


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Antecedentes históricos
1907. Chauffard
1871. Vanlair Masius.

1890. Wilson.

1970. Alteraciones 1985.
Aumento de fragilidad osmótica.
proteínas de
Alteraciones
”Enfermedad de Minkowsky Chauffard” membrana
moleculares


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Generalidades de la
Esferocitosis hereditaria
Herencia:
75% Autosómica dominante (AD)

25%

50% Autosómica recesiva (AR) o AD con
penetrancia incompleta
50% mutaciones de novo


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Epidemiología
 AH congénita crónica más frecuente en los

países occidentales.
 Mayor incidencia: Norte de Europa y
América del norte.
 Frecuencia: 1/5000 - 1/2000.
 Argentina: no existen datos de incidencia,
pero se sabe que es la anemia hemolítica
crónica más frecuente.


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Fisiopatología
Mecanismos
fisiopatológicos

Defecto intrínseco de
la membrana
eritrocitaria

Bazo intacto
remueve hematíes
dañados.


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Fisiopatología
Déficit espectrina,
prot 4.2 o ankirina

↓pH
↑contacto GRMacrofago
↓glu
↑(oxidantes)

Hemólisis

Eritrostasis

↓ S/V

Secuestro

↓ deformabilidad esplénico
celular

Condicionamiento
esplénico

Déficit de banda 3

Esferocitos en
frotis de sangre
periférica
Adaptado de Narla Mohandas, Silverio Perrotta, Patrick G Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com Vol 372 October 18, 2008

Pérdida
membrana


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Causas de Esferocitosis
Hereditaria

N. Mohandas, S. Perrotta, P.Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com. 18/10/08


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Clasificación de Esferocitosis
hereditaria
Actualmente la clasificación se basa en los niveles de Hb:
Severa: Hb<8 g/l
Moderada: 8-10 g/l
Mínima: 1010
N. Mohandas, S. Perrotta, P.Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com. 18/10/08


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Complicaciones
 Crisis hemolíticas, muy frecuentes durante las
infecciones virales, rara vez son graves.
 Crisis aplásticas por infección de parvovirus
B19.
 Crisis megaloblásticas resultan de la deficiencia
de ácido fólico, en particular en las
embarazadas.


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Complicaciones
 Litiasis vesicular, colelitiasis u obstrucción
biliar.

Poco frecuente:
 Ulceras recurrentes o dermatitis en miembros
inferiores, hemopoyesis extramedular, gota,
retraso en crecimiento y desarrollo sexual.


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Diagnóstico


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Anemias Hemolíticas
↓ Hb + ↑ Reticulocitos
Hemólisis Intravascular
↑ Hb plasmática, LDH

Hemólisis extravascular
↑ Bilirrubina Total e Indirecta

↓ Haptoglobina y hemopexina
Hemoglobinuria y hemosiderinuria

↑ Estercobilinógeno fecal
↑ Urobilina en orina

Prueba de Coombs Directa
Negativa
Historia familiar!!!

Positiva
Anemias hemolíticas Inmunes

FROTIS (morfología GR)

Esferocitos
Eliptocitos
Investigar

Membranopatías

Inespecífica

TODAS las
DETERMINACIONES

Dianocitos, falciformes
Hipocromía, microcitos
Investigar
Hemoglobinopatías


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LABORATORIO
General

Parámetros de
Anemia
Hemólisis

Específico

Estudios de
screening y
confirmatorios


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Laboratorio

General

• Alteraciones indicativas de hemólisis
Extravascular: Bilirrubina Indirecta, Urobilinógeno fecal, Urobilina
Intravascular: Hemoglobinemia, LDH, disminución de Haptoglobina,
Hemoglobinuria, Hemosiderinuria

• Prueba de Coombs directa: negativa
Adultos: no descartar la posibilidad de una anemia hereditaria

• Reticulocitos: aumentados
Tener en cuenta los valores de referencia adecuados
Edad gestacional: > %Retic a menor edad gestacional
Días de vida: valores elevados al nacimiento hasta el 3º día

• Hemograma: VCM, HCM, ADE, CHCM.
• FROTIS: MORFOLOGIA!!


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•FROTIS: MORFOLOGÍA!!
Sin alteraciones

Déficit banda 3

Hongos

Esferocitos

Déficit de βespectrina

Esferoacantocitos


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LABORATORIO
General
Parámetros de
Anemia
Hemólisis

Específico
Estudios de screening
y
confirmatorios


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Estudios de Membrana
Screening
Hemólisis aumentada
- Prueba de Autohemólisis
- Test de glicerol acidificado
- Pink test
Fragilidad osmótica aumentada
- Curvas de fragilidad osmótica
- Técnica de Dacie
- Fragilímetro
- Nefelometría
- Criohemólisis hipertónica
Deformabilidad celular alterada
- Ectacitometría
- Reoscopía
Otras
Citometría de flujo

Confirmatorios
Determinación cuantitativa de las
proteínas de membrana
-

Electroforesis PAGE-SDS

-

Electroforesis bidimensional

-

Electroforesis capilar

Análisis genético


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Prueba de Autohemólisis
 Fundamento:

Mide la capacidad de los hematíes para
mantener su integridad in vitro después de 48 hs de
incubación a 37ºC en su a su propio plasma.


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Prueba de Autohemólisis
Técnica :
 Se incuba 48 Hs sangre
heparinizada estéril con y
sin agregado de glucosa
a 37ºC
 Se evalúa % hemólisis
leyendo absorbancia a
540nm.
Desventajas
 Volumen relativamente
grande de muestra
 Posibilidad de
contaminación 
duplicados de cada tubo.

Límites de % hemólisis normales
 Sin glucosa añadida: 0.2-2 %

 Con glucosa añadida: 0-0.9%


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Curva de fragilidad osmótica
 Fundamento:

Se suspenden los eritrocitos en soluciones de
hipotonía creciente de NaCl. (0 a 0.9% NaCl)
El H2O penetra en el interior del GR para
equilibrar su presión osmótica con la del medio
La célula se vuelve esférica y al alcanzar un
volumen crítico se rompe.
En la SH el Vc del esferocito <<<< Vc glóbulo rojo


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Curva de fragilidad osmótica
Técnica

CONTROL

 Eritrocitos + soluciones

de hipotonía creciente de
NaCl.
Incubación 20 min a TA se
centrifugan los tubos y se
cuantifica el grado de
hemólisis.

PACIENTE


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Curva de fragilidad
osmótica
Población condicionada

Coincidente con la normal

I

Resistencia mínima VN: 0.48-0.51 gr% ClNa
Fragilidad corpuscular media

VN: 0.43-0.475 gr ClNa

Resistencia máxima VN: 0.30-0.33 gr.% ClNa


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Curva de fragilidad osmótica diferida
 Incremento de la sensibilidad, preincubación de
las células 24hs en soluciones de distinta
concentración salina estériles a 37ºC.
 Se produce stress metabólico de los eritrocitos y
maduración de reticulocitos que son
osmoticamente más resistentes, acentuando las

diferencias entre las poblaciones.
 Hipocromía debido a una ferropénia latente
puede enmascarar un descenso de la resistencia

osmótica.


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Curva de fragilidad osmótica

basal y
diferida

Gráfico: % Hemólisis vs [ClNa]

 Gráfico : Incremento del % Hemólisis vs [ClNa]


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Criohemólisis hipertónica
 Fundamento:

Evalúa el efecto de un cambio brusco de
temperatura en los eritrocitos suspendidos en
un medio hipertónico.
No depende de la relación S/V, sino de la
integridad de las proteínas de membrana.


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Criohemólisis hipertónica
 Se suspenden los eritrocitos en solución hipertónica
de sucrosa a 37ºC durante 10 minutos y luego igual
tiempo a 0º C.
 Se cuantifica el % hemólisis en el sobrenadante.

Valores de corte : Criohemólisis > 2,8 %
E: 95 % y S: 79 %
 Ventajas:Arroja resultados normales en la AHAI

American Journal of Haematology 58.206-212 (1996)


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Citometría de flujo
 Fundamento:

evalúa la intensidad de la fluorescencia que
presentan los eritrocitos intactos luego de ser
incubados con el colorante 5-eosina-maleimida
(5-EMA) que se une covalentemente en un 80%
al residuo Lys de la proteína banda 3, el 20% a
glicoproteínas del grupo Rh.
 Cada muestra de paciente se debe correr con 6
controles normales y se informa como
disminución de la fluorescencia del histograma


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Citometría de flujo
 Histogramas de fluorescencia

Permiten diferenciar SH, EH y
PPH
 Esferocitosis (SH)

Reducción de fluorescencia
 Eliptocitosis (EH)
No presenta diferencias entre
la población eritrociatria
normal
 Piropoiquilocitosis (PPH)
Doble pico de fluorescencia
British Journal of Haematology 2000,924-933


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Citometría de flujo
Ventajas:
 Rapidez en la obtención de resultados
 Pequeño volumen de muestra
 Permite diferenciar los esferocitos
presentes en EH de los presentes en AHAI
 Sensibilidad del 92.7% y una especificidad
del 99.1% reportada por bibliografía.


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Electroforesis SDS-PAGE de membrana
 Método de referencia para identificación de
proteína deficiente.
 Tiene bajo porcentaje de recuperación.
 Permite diferenciar la presencia o no de proteínas
del citoesqueleto eritrocitario.
 Permite confirmar el diagnóstico de EH en :
 Aquellos casos en que no haya historia familiar positiva
 Cuando las pruebas de screening no son concluyentes
 Cuando la clínica que presenta el paciente no guarda
relación con la que presenta el resto del grupo familiar.

Clin. Lab, Haem. 25,373-376


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Tratamiento
 Esplenectomía
Las HS deficientes en banda 3 no se beneficiarían con la
esplenectomía.
Blood 2002; 100: 2208-2215

Riesgos :
3 semanas antes de la cirugía, vacuna para
Neumococo, Haemophilus,Meningococo , Influenza,
Hepatitis A y B
 Transfusión de paquete globular en crisis :

1) megaloblástica, 2) hemolítica 3) aplásica
 Suplementar con ácido fólico


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Membranopatía Hereditaria
• Cuadro clínico
• Parámetros de laboratorio general
• Historia familiar positiva

No se requieren estudios adicionales
Bolton-Maggs PH, Br. J Haematol. 2004


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Conclusiones
 El 75 % de las EH pueden ser diagnosticadas con:
 Cuadro clínico
 Parámetros de laboratorio general
 Historia familiar positiva

 De las restantes, el 66 % pueden diagnosticarse mediante estudios

confirmatorios simples:
 Prueba de autohemólisis
 Curvas de Fragilidad eritrocitaria
 Criohemólisis hipertónica

 Muy pocas veces se requieren estudios específicos para arribar al diagnóstico:
 Electroforesis de membrana (PAGE-SDS)
 ¿Valor pronóstico?

 Análisis genético
 Documentar mutaciones “de novo”


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Población estudiada


Slide 39

Resultados


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Resultados


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Resultados


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Conclusiones del trabajo
 Recalcamos la utilidad de realizar varias pruebas, no






todas son simultáneamente positivas.
EMA-FC y CH test fáciles de ejecutar, con mayor
sensibilidad que otros test para diagnóstico de HS.
Incorporación nuevo parámetro para evaluar la
citometría, que es el % incremento del CV.
Proteínas deficientes más frecuentes en la población
estudiada son espectrina y ankirina.
Estudio extendido a los familiares del paciente
permiten establecer el diagnóstico de esferocitosis
asintomáticas y detectar portadores sanos.


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Bibliografía
 Sara Streichman* and Yehudit Gescheidt . Cryohemolysis for the Detection of
Hereditary Spherocytosis: Correlation Studies With Osmotic Fragility and
Autohemolysis. American Journal of Hematology 58:206–212 (1998)
 May-Jean King, Judith Behrens, Chris Rogers, Clare Flynn, David Greenwood and
Keith Chambers. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane
cytoskeleton-associated haemolytic anemia. British Journal of Haematology, 2000,
111, 924±933.
 P. S. Kedar, R. B. Colah, S. Kulkarni, K. Ghosh, D. Mohanty. Experience with eosin-5¢maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin.
Lab. Haem. 2003, 25, 373–376
 Walter E. Rodríguez*, German F. Sáenz*, Jessie Orlich. Diagnostico de la esferocitosis
hereditaria con pruebas de glicerolisis
 María del Pilar Ricard Andrés. La esferocitosis hereditaria y su diagnóstico en la
práctica clínica. Universidad complutense de Madrid facultad de medicina
departamento de medicina. Madrid, 1993.


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Bibliografía
 Narla Mohandas, Silverio Perrotta, Patrick G Gallagher. Hereditary spherocytosis.
www.thelancet.com Vol 372 October 18, 2008
 P. H. B. Bolton-Maggs, R. F. Stevens2, N. J. Dodd3, G. Lamont4, P. Tittensor5and M.-J.
King on behalf of the General Haematology Task Force of the British Committee for
Standards in Haematology. Guidelines for the diagnosis and management of
hereditary spherocytosis . 2004 Blackwell Publishing Ltd, British Journal of
Haematology, 126, 455–474
 Mariagabriella Mariani, Wilma Barcellini, Cristina Vercellati, Anna Paola Marcello,Elisa
Fermo, Paola Pedotti, Carla Boschetti, and Alberto Zanella. Clinical and hematologic
features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to
the type of the membrane protein defect. Published Ahead of Print on July 18, 2008,
as doi:10.3324/haematol.12546
 Crisp R, Solari L, Chamorro M, Gammela D, Vota D, Garcia E, Venegas B, Miguez G,
Schvartzman G, Caldarola S, Ricchieri C, Alfomso G, Nesse A, Donato H. Hereditary
spherocytosis: relationship between clinical outcome, diagnostic test results and
membrane protein deficiency. A prospedtive study from argentina. Poster
presentedat EHA 15 on: 1012--P Renée Crisp 12th June 2010


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Agradecimientos
 Dra. Renée Crisp del Servicio Médico de







Hematología del Hospital
Profesionales del Sector de Citometría de
flujo del Laboratorio Central
Dra. Sandra Cozzarín y demás profesionales
y técnicos del Sector de Hematología del
Laboratorio Central
Profesionales y técnicos de Endocrinología y
Bacteriología
Nuestros compañeros de Residencia


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GRACIAS!!!!