Transcript Realizari ale colectivului de genetica al Institutului de Biologie in
Slide 1
"Integrarea si interpretarea analizelor genetice si epigenetice
in abordarea nutrigenomica a starii patologice."
Natalia Cucu (Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie, Departamentul de Genetica)
Lucian Radu, Simona Litescu, Camelia Albu (Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru
Stiinte Biologice, Centrul de Bioanalize), BucurestiRadu Stefanescu, Daniela Nedelcu, Cosmin Arsene- GenXplore, BucurestiPavel Chirila - Naturalia, BucurestiTatiana Onisei- Phytogentec, Bucuresti
Slide 2
Metodele genetice si epigenetice capata actualmente o importanta din ce in ce mai
evidenta in studiul starii patologice. Mai mult, abordarea nivelului informational ereditar
aditional, epigenetic, implica integrarea unui element cheie, pana recent neglijat, si anume,
influenta mediului, respectiv al dietei, nutritiei, poluarii. Mutatiile, precum cele
punctiforme, care caracterizeaza polimorfismele de tip SNP (single nucleotide
polimorphisms) in gene particulare, a caror expresie este cruciala in cai metabolice cheie
pentru mentinerea sanatatii organismului, dar si a stabilitatii genomice sunt astazi
frecvente abordate intr-un nou algoritm de diagnostic al numeroase boli, precum cancerul,
bolile de reproducere si infertilitatea, bolile metabolice si neurodegenerative. Alaturi de
acestea, factorii particulari non-mendelieni, epigenetici, sunt buni informatori ai
efectelor pe termen lung al expunerii ambientale in decursul vietii indivizilor si,
surpinzator, dar evident azi, in decursul vietii parintilor si bunicilor/strabunicilor.
Nutrigenomica, relatia dintre mediu si genom, este asadar un domeniu extrem de tanar,
care ofera oportunitatea evaluarii, alaturi de factorii genetici si epigenetici, potentialul pe
care il are nutritia, alimentele si dieta, in general (care cuprinde asadar si stilul de viata) in
mentinerea stabilitatii genomice, in diagnosticul unor stari patologice si in regandirea
strategiilor de tratamente, in cadrul carora aspectul de personalizare si preventie este
definitoriu.
Slide 3
Paralel cu studiile de nutritie, domeniul genomicii a luat o amploare exploziva in ultimele doua
decade, mai cu seama prin intermediul aplicatiilor biologiei moleculare, ocupand actualmente
locul central in majoritatea sectoarelor de activitate umana, incluzand in mod special sanatatea.
Relatia care s-a stabilit in acest nou context dintre dieta si organismul uman se referea la
intelegerea reactivitatii specifice a organismului uman fata de anumite conditii de mediu,
respectiv, evident, fata de anumite tipuri de dieta. Actualmente, nutrigenomica este domeniul
care se ocupa cu studiul raspunsului indivizilor la o anumita alimentatie, prin corelarea acesteia
cu genotipul individual. O astfel de abordare personalizata a fost facilitata de tehnologiile
postgenomice in plina dezvoltare, care iau in considerare nu numai informatia genetica (secventa
nucleotidica la nivelul ADN), dar si un nivel aditional informativ, epigenetic
Informatia ereditara implica nu numai informatia genetica, dar si un nou nivel
informational, epigenetic. Informatia epigenetica este codificata, dupa cum indica si termenul,
nu la nivelul secventei nucleotidice ADN, ci la nivelul structurii cromatinei- materialul genetic
eucariot, care consta din complexul nucleoproteic: ADN/ proteinele histonice si nonhistonice. Cu
alte cuvinte, codul epigenetic contine grupe chimice, precum metil, acetil, ubiquitil, poli ADP
ribozil, biotinil, fosforil, care sunt transferate prin reactii enzimatice, endogene, la nivelul
resturilor de citozina din cadrul ADN dublucatenar, pe de o parte si la nivelul resturilor de
aminoacizi bazici (arginina si lizina) din cadrul proteinelor histonice si nonhistonice (histonele
octamerice sau nucleozomale, H2A, H2B, H3 si H4, si histona linker-1). Reactiile enzimatice
sunt catalizate de anumite transferaze, denumite efectori epigenetici (ADN metiltransferaze,
histon metilaze, histon acetilaze si histon deacetilaze, histon ubiquitinaze, histon fosforilaze etc),
care utilizeaza, in conditii de sanatate, in mod eficient stocurile de grupe metil, acetil, cofactori,
Slide 4
Pattern-urile particuare de modificari epigenetice constituie epigenotipuri care definesc un anumit
tip celular si deci o anumita fiziologie celulara. Devierea de la normalitate a acestor pattern-uri
inseamna o reprogramare a pattern-ului specific de expresie genica. Unele seturi de gene critice
pot fi astfel silentiate, altele, activate in mod aberant. Mai mult, modificarile epigenetice, ca si
cele genetice, sunt ereditare, dar, in schimb ele sunt reversibile. Epigenomul este reprogramabil
in functie de semnalele ambientale. In mod normal, el depinde de expresia spatio-temporala a
genelor: este foarte important de stiut ca anumite gene nu se modifica prin mutatii in diferite
tesututri. Ele sunt programate sa fie exprimate intr-un anumit tesut si intr-o anumita etapa de
dezvoltare a organului.
In acest mod, se poate explica de ce pattern-ul celular, reprezentat de un anumit set de gene
exprimate intr- un anumit set de proteine celulare, poate varia ca raspuns atat la semnalele
endogene, legate de dezvoltarea orhganismului, deci ontogenice, cat si la semnalele exogene, de
mediu. Astfel de modificari de pattern-uri celulare pot fi normale, de citodiferentiere si
maturizare, intr-o dezvoltare sanatoasa, armonioasa in interactie cu conditiile de mediu, sau poate
fi, dimpotriva, aberanta. Aceasta din urma se refera la transformarea programului geneticcelular
normal si deci la obtinerea unei noi specializari celulare, de obicei maligne.
Slide 5
In acest mod, se poate explica de ce pattern-ul celular, reprezentat de un anumit set de gene
exprimate intr- un anumit set de proteine celulare, poate varia ca raspuns atat la semnalele
endogene, legate de dezvoltarea orhganismului, deci ontogenice, cat si la semnalele exogene, de
mediu. Astfel de modificari de pattern-uri celulare pot fi normale, de citodiferentiere si
maturizare, intr-o dezvoltare sanatoasa, armonioasa in interactie cu conditiile de mediu, sau poate
fi, dimpotriva, aberanta. Aceasta din urma se refera la transformarea programului genetic celular
normal si deci la obtinerea unei noi specializari celulare, de obicei maligne.
Este clar actualmente faptul ca starea patologica este definita de o transformare a programului
de expresie genica fie prin modificari ale informatiei genetice, la nivelul secventei ADN, fie ale
informatiei epigenetice, codificate prin modificarile covalente ale ADN (metilarea ADN in
resturile de citozina), dar si a altor componenti cromatinici- proteinele histonice si nonhistonice.
Modificarile covalente ale ADN si histonelor sau nonhistonelor, precum metilarea ADN, pe de o
parte si, pe de alta parte, metilarea/ demetilarea, acetilarea/deacetilarea, fosforilarea,
ubiquitinarea, poliADPribozilarea, biotinilarea histonelor in anumite situri representate de resturi
de citozina si, respectiv, aminoacizi bazici precum lizina si arginina, conduc la o remodelare
activa a conformatiei cromatinei, ceea ce are un efect dramatic asupra proceselor de transcriere si
replicare ADN, deci a proceselor de expresie genica si diviziune celulara.
Slide 6
Pornind de la aceste considerente, starea patologica este definita in prezent nu numai prin mutatii
ale genelor, respectiv prin modificarea secventei ADN sau a informatiei genetice. Acestea sunt
fixate in genom devenind ireversibile si deci transmisibile din generatie in generatie, pornind de la
un fondator al mutatiei initiale. Ele sunt indicii ale unui anumit tip de vulnerabilitate fata de o
anumita boala, denumit risc familial. Se determina prin detectia mutatiilor la nivelul genelor
corespunzatoare, critice pentru o anumita eredopatie.
Un alt aspect care trebuie luat in considerare cand se doreste definirea unei stari patologice este, pe
langa genotipul, si epigenotipul sau pattern-ul distributiei grupelor chimice mentionate, dintre care
grupele metil au o prevalenta neta in discutia aspectelor de nutrigenomica, dar si grupele acetil, la
nivelul ADN si histone (metilarea AND si metilarea histonelor-mai cu seama, in conceptul actual,
metilarea histonei H3) si respectiv, la nivelul histonelor H3 si H4. Exista dovezi numeroase care
implica de asemenea si ubiquitinarea histonei H2B, inlocuirea anumitor histone (precum histona
H3) cu anumite variante (precum histona H3.3, de exemplu), ca si multe alte modificari covalente
care pot avea loc atat la nivelul componentelor cromatinei, histonele si nonhistonele, dar si la
nivelul efectorilor epigenetici, cum au fost denumite enzimele ADN metiltransferaza (DNMT),
histonmetilaza (HMT), histonacetilaza (HAT), histondeacetilaza (HDAC) etc. Activitatea acestor
enzime, dupa cum s-a mentionat anterior, depinde de anumite conditii de reactie, precum
concentratia enzimei/ substratului, de aciditatea mediului de reactie si de temperatura sau
concentratia in anumite minerale, de anumiti cofactori: vitamine, donori de grupe metil/acetil, de
structura specifica a proteinei cu activitate enzimatica, in special referitoare la domeniul catalitic
dar si de cele prin intermediul carora enzima interactioneaza cu alte componente ale reactiei
enzimatice. Cu alte cuvinte, reactiile endogene enzimatice sunt deosebit de complexe, pe masura
diversitatii alternativelor oferite de natura organismelor superioare de a-si proteja genomul, dar in
acelasi timp, de a capata si procesa corect toate informatiile importante provenite din mediu.
Slide 7
Metabolomica- este un domeniu tanar, care aduce un element in plus complexitatii abordarii
genomice si epigenomice in relatia cu mediul: caile metabolice complexe prin care elementele
externe sunt aduse in reactiile importante ale sintezei de acizi nucleici, de intretinere a
strabilitatii genomice, deci a unei structuri cromatinice adecvate unui pattern de expresie genica
corecta, normala. Enzimele si deci genele care controleaza aceste cai metabolice cu efect
indirect asupra stabilitatii genomice au un potential informativ extraordinar asupra
vulnerabilitatii unui organism fata de anumite conditii de mediu si deci de a dezvolta o anumita
boala. Totodata, metabolitii intermediari, precum anumiti donori de grupe metuil (SAM sau Sadenozilmetionina si derivatul sau S-adenozilhomocisteina sau SAH) / acetil / fosforil / ubiquitil
etc, ca si anumiti cofactori precum vitamina B6, B12, vitamina C sau anumite minerale (precum
cationii de Zn si Mg) sunt extrem de importanti in desfasurarea optima a reactiilor metabolice
critice in intretinerea genomica. Estimarea acestora, ca si a polimorfismelor genelor care
controleaza caile metabolice respective fac parte din obiectivele de studiu ale metabolomicii in
relatie cu mediul, respectiv, dieta. In cadrul acestui domeniu, metilomul a capatat recent o
importanta cruciala in nutrigenomica. S-a dovedit de altfel ca grupa metil, sau grupa
purtatoare de un singur atom de carbon, este cruciala in mentinerea unui genom care sa poata
exercita functiile sale in conditii optime.
Slide 8
Fig. 1 Influenta dietei bogate/sarace in folati (donori de grupe metil)
Si a activitatii enzimei critice MTHFR asupra proceselor de metilare ADN si
asupra stabilitatii genomice
Slide 9
Fig.2 Reactiile metabolice ale grupei metil in celula; procesele de sinteza si
metilare ADN sunt corelate cu activitatea de metabolizare in celula a folatilor,
sinteza de metionina si de S-adenozilmetionina; alterarea acestor procese induce
instabilitatea genomica.
Slide 10
Factorii endogeni ereditari, precum mutatia in anumite gene care controleaza cai
metabolice critice, cat si factorii exogeni, reprezentati de o dieta precara in
elemente esentiale desfasurarii reactiilor metabolice cu efecte importante asupra
mentinerii stabilitatii genomice, pot conduce la dezechilibre interne la nivelul
genomului cu potential patogen, prin inducerea instabilitatii genomice. Organismele
pot deveni vulnerabile la o varsta inaintata, devenind sensibile la aceste efecte
aparent minore, dar cu efecte dramatice asupra integritatii genomice si asupra
functiei corecte genomice, respectiv asupra mentinerii pattern-urilor celulare
corecte.
Instabilizarea genomica este o marca cunoscuta atat a unei celule canceroase, dar si
a unei celule senescente si a celulelor unui organism imbatranit. Din punct de vedere
genetic, celulele in procesul imbatranirii sufera schimbari majore ale controlului
proesului de dezvoltare. Etapa imbatranirii este deci caracterizata de un program
genetic si epigenetic nou, deci de pattern-uri modificate celulare, care difera de
cele ale celulelor unui organism tanar prin elemente inca neidentificate cu precizie.
Se cunosc insa foarte bine efectele modificarii acestui program genetic vizibile la
nivelul tesuturilor pielii, la nivelul functionarii sistemului digestiv, neuronal, dar si
circulator, organismul batran fiind mult mai vulnerabil la anumite boli precum cele
cognitive (Alzheimer, Parkinson, pierderea memoriei, demente etc), metabolice
(diabetul, bolile cardiovasculare), dar si cancerul. Aceasta vulnerabilitate este
evident legata de instabilitatea genomica, dar biomarkerii specifici ai procesului de
imbatranire sunt departe de a fi definiti. Exista numeroase descoperiri privind
modificarile specifice acestei perioade de dezvoltare la nivelul anumitor gene
(acumularea de mutatii, dar si de modificari epigenetice) cat si la nivelul unor
proteine interesante cu activitate enzimatica, reprezentand tinte moleculare in
studiile farmacogenomice.
Slide 11
Actualmente exista teorii privind mutatiile in cadrul unor anumite gene asociate cu bolile
mentionate anterior, precum genele pentru apolipoproteine (A,B,C,E etc), care sunt corelate cu
nivelul trigliceridelor, colesterolului, dar si cu longevitatea sanatoasa si dezvoltarea bolii
Alzhheimer, genele pentru proteina TAU, corelate cu formarea placii proteice specifice bolii
Alzheimer, genele pentru sirtuine, proteine cu activitate HDAC, avand rol protector genomic,
fiind activate in special in urma dietelor de restrictie calorica, genele pentru angiotensina (ACE)
corelate cu bolile cardiovasculare, dar si gena mthfr, asociata cu imposibilitatea asigurarii unui
nivel de folati celulari adecvati pentru reactiile de metilare genomica sau proteica. Noutatile din
domeniu sunt extrem de numeroase: ele se refera la o pleiada de multe alte gene care
controleaza capacitatea de reparare a ADN, desfasurarea ciclului celular in conditii optime, de
inhibare a proliferarii celulare in cazul in care exista o tentdinta marita a genomului imbatranit
de a acumula mutatii sau epimutatii si de a angaja nucleul in proliferare necontrolata, precum
cea neoplazica.
In continuare se vor prezenta rezultatele obtinute in diferite sisteme biologice asociate
imbatrabirii prin abordarea analizei polimorfismelor SNP.
Slide 12
Bolile cardiovasculare (CVD) si sistemul renina-angiotensinaaldosterona, caracterizat prin polimorfismul genei ACE
(angiotensincatabolizing enzyme)
Slide 13
ACE- angiotensin converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 1
Locus cromozomal : 17q23.3
Regiunea ADN codificata: 21 kb -26
exoni
Produsul genei ACE: enzima ACE,;
contine1306 aa,; este o peptida cu rol de
semnalizare in axa raa
contine doua domenii catalitice
C-terminal reprezinta approximativ 75%
din capacitatea catalitica
N-terminal-este folosit in inactivareat
bradykininei, neurotensinei si a
substantei-P
Rol: este o enzima proteolitica converteste
forma inactiva a angiotensinei II intr-o
forma activa (vasoconstrictoare) ;
inactiveaza bradykinina si kallidina
(vasodilatatoare)
ACE-structura 3D
Slide 14
Polimorfismul genei ACE: insertie-deletie
(I/D) a unui segment de baze de
dimensiunea 287 pb in intronul 16
A. Titia Lely 2007
Genotipul ACE DD a fost asociat cu concentratia crescuta in plasma a
enzimei ACE circulante, ceea ce determina conversia mai eficienta a
angiotensinei I la II
Slide 15
Pattern-ul electroforetic al polimorfismelor ACE I/D
L- Ladder
ID- heterozigot (insertie/deletie)
DD- homozigot (deletie)
II- homozigot (insertie)
Slide 16
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR )
Caile metabolice ale obtinerii metioninei/ homocisteinei
/ADN metilat
(THF-tetrahidrofolat,SAM S-adenosimetionina- donor de
grupe metil)
M. C. Koch et al, 1997
Slide 17
Gena MTHFR
Locus cromozomal 1p36.3
DNA codificator: 2,2kb , 11 exoni
Produsul genei: enzima MTHFR 656AA; 74,5kDa
Forma activa este un dimer cu 2 domenii majoreN-terminal (catalitic) si C- terminal (reglator)
Slide 18
Polimorfismul C677T in gena MTHFR
Exonul 4 : 677 C - - - → T; alanina - - - → valina
Efectul: forma termolabila, instabila, a enzimei
Homozigotii TT : prezinta o activitate mai slaba MTHFR – 3550% fata de cea normala → aceasta forma este asociata cu
concentratie mare de homocisteina
Polimorfismul 1298C polymorphism in gena MTHFR
Exonul 7: 1298 A ---→C, glutamat ---→alanina
Homozogotii CC – prezinta o scadere slaba a activitatii (60%)
-Nu este asociat cu cresterea honcentratiei in Hcis
-Efectul: de obicei este in combinatie cu efectul polimorfismului
C677T
-heterozigotii cu ambele polimorfisme: prezinta o crestere
semnificativa a Hcis, in particular- in conditiile unei concentratii
scazute de folati
Slide 19
Metoda-Reverse hybridization - pentru analiza polimorfismelor
in gena pentru MTHFR C677 si A1298
SNP-MTHFR-C677T este
foarte comun.
-Cca 40% din populatie este
homozigota pentru tipul salbatic
C677,
-45% este heterozigota pentru
ambele alele C677 si T677; iar -cca 15% sunt homozogoti
purtatori ai alelei cu mutatia
T677.
A- homozigota pentru MTHFR 1298C Mut
B- heterozigota pentru MTHFR C677 – WT si MTHFR 677T Mut
C- heterozigota pentru MTHFR A1298 – WT si MTHFR 1298C Mut
D- homozigota ptr MTHFR 1298C Mut
E- homozigota ptr MTHFR C677 – WT
F- homozigota ptr MTHFR A1298
Slide 20
Factorii epigenetici studiati: procesele de metilare ADN. La nivel global, un proces de
instabilizare genomica este frecvent asociat cu hipometilarea ADN. La nivel local, in
gene critice, procesul de metilare ADN aberant este asociat cu hipermetilarea
promotorilor.
Metoda de estimare a hipometilarii globale ADN utilizeaza perechi de enzime
isoschizomere ex. (MspI/HpaII) si este abordata pentru estimarea comparataiva a
profilelor de restrictie a ADN genomic.
Hipometilarea aberanta ADN global este frecvent asociata cu aneuploidii si cu
fenomene de anafaze timpurii sau disocieri promature de cetromeri (cromatide
surori)-PCD.
Metoda de estimare a hipermetilarii (methylation specific PCR-MSPCR) este deseori
asociata cu silentierea aberanta a unor gene critice precum cele care sunt implicate
in metabolismul si activitatea hormonala. O astfel de gena critica in cancerogeneza si
in imbatranire este gena pentru receptorul de estrogen (ESR). Hipermetilarea
promotorului acestei gene a fost asociata cu cancerul mamar, endometrial si cu
imbatranirea.
Slide 21
Exemple de electroforegrame reprezentand profile de restrictie cu enzime
izoschizomere care demonstreaza hipometilarea globala ADN genomic la persoane
varstnice (b) , comparativ cu persoane tinere (a)
Slide 22
ESR1 (Estrogen Receptor 1)
Locus cromozomal 6q25.1
Fragmentul DNA: 412.78 kb ; 8 exoni
Produsul genic: ER-α , subfamilia 3 de receptori nucleari, grupa
A, member 1
Domenii:
N terminal -modulator
Domeniul central- bipartite zinc finger DNA binding domain
Domeniul NLS (nuclear localization signal ) cu afnitate pentru
ADN; este necesar pentru interactia cu inalta afinitate indusa de
estradiol
C terminal - domeniu de legare a ligandului; include un domeniu
de transactivare si un domeniu de dimerizare
Este activat de hormonul de sex, estrogen
Slide 23
Exemplu de electroforegrame reprezentand ampliconii unei reactii
MSPCR de detectie a statusului de metilare in promotorul genei ESR 1;
forma M-metilata este asociata cu silentierea aberanta a ESR1 in
cancerogeneza si in imbatranire
Nr pacient
ERα
1
2
3
4
5
6
7
8
9
U
M
U
U
U
U
U
-
M
Slide 24
Exemplu de cariotip alterat datorat demetilarii ADN centromeric si pericentromeric;
acest fenomen este asociat cu aneuploidii si PCD (A), dar si cu mutatii precum
deletii (cr. 4,6,15 (B) in cancerogeneza si la persoane varstnice
A
A - fenomene PCD-premature chromatides
dissociations
B
B - deletii pe cromozomii 4,6,15
Slide 25
Investigatiile metabolomice au
implicat abordarea HPLC pentru
estimarea metabolitilor :donor de
grupe metil -SAM si a produsului
acestuia, SAH. Exemplu de rezultate
obtinute in urma examinarii
raportului SAM/SAH in probe de
sange uman. Variatia este asociata cu
varsta, sex, stare de sanatate.
Slide 26
Colectivul propune un algoritm de studiu al instabilitatii genomice in diferite
stari patologice si in procesul imbatranirii, care include:
Factori genetici- Testele clasice de cariotipare, care urmaresc identificarea
mutatiilor prin variatia morfologiei cromozomale (deletii, ruperi cromozomale etc)
Factori epigenetici- Fenomene PCD in cariotipuri clasice-asociate cu alterarea
conformatiei heterocromatinei in regiunea pericentromerica
-Hipometilarea ADN globala
-Hipermetilarea ADN locala (gene critice/tumor supresoare)
Factori bipchimici (metabolomici) asociati cu instabilitatea metilomului celular
-genotiparea mutatiilor punctiforme- (SNP)
- estimarea raportului SAM/SAH, ca precursori ai Hcis
Slide 27
Referinte
Abdel Halim Salem and Mark A Batzer (2009); High frequency of the D allele of the angiotensin-converting enzyme gene in Arabic populations. BMC
Research Notes, 2:99
Zhang R, Xu X, Chen T, Li L, Rao P (May 2000). "An assay for angiotensin-converting enzyme using capillary zone electrophoresis". Anal. Biochem.
280 (2): 286–90.
M. C. Koch á K. Stegmann á A. Ziegler á B. SchroÈ ter á A. Ermert; Evaluation of the MTHFR C677T allele and the MTHFR gene locus in a German
spina bifida population. Eur J Pediatr (1998) 157: 487-492
Goyette P, Summer JS, Milos R, Duncan AMV, Rosenblatt DS, Matthews RG and Rozen R (1994) Human methylenetetrahydrofolate reductase:
Isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet 7:195-200.
Goyette, P., A. Pai, R. Milos, P. Frosst, P. Tran, Z. Chen, M. Chan and R. Rozen, 1998. Gene structure of human and mouse
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR). Mamm Genome, 9: 652-656.
Walter P, Green S, Greene G, Krust A, Bornert JM, Jeltsch JM, Staub A, Jensen E, Scrace G, Waterfield M (December 1985). Cloning of the human
estrogen receptor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (23): 7889–93
Greene GL, Gilna P, Waterfield M, Baker A, Hort Y, Shine J (March 1986). "Sequence and expression of human estrogen receptor complementary
DNA". Science (journal) 231 (4742): 1150–4.
Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, Cambien F, Corvol P, Soubrier F. An insertion/deletion polymorphism in angiotensin I-converting enzyme gene
accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest. 1990;86:1343–1346.
Bowen DJ, Bowley S, John M (1998) Factor V Leiden (G1691A), the Prothrombin 3'-Untranslated Region Variant (G20210A) and Thermolabile
Methylenetetrahydrofolate Reductase (C677T): A Single Genetic Test Genotypes all Three Loci - Determination of Frequencies in the S. Wales
Population of the UK
Thromb Haemost 79: 949-954
This work was supported by the National Research Program contract AGECVD coordinated by National Institute of Gerontology and Geriatry “Ana
Aslan”; parteners of the Consortium: University of Bucharest, Stefan Nicolau” Institute of Virology, Coltea Hospital, National Institute of Biological
Sciences. The contribution of the Cytogenomic Medical Laboratory is aknowledged.
"Integrarea si interpretarea analizelor genetice si epigenetice
in abordarea nutrigenomica a starii patologice."
Natalia Cucu (Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie, Departamentul de Genetica)
Lucian Radu, Simona Litescu, Camelia Albu (Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru
Stiinte Biologice, Centrul de Bioanalize), BucurestiRadu Stefanescu, Daniela Nedelcu, Cosmin Arsene- GenXplore, BucurestiPavel Chirila - Naturalia, BucurestiTatiana Onisei- Phytogentec, Bucuresti
Slide 2
Metodele genetice si epigenetice capata actualmente o importanta din ce in ce mai
evidenta in studiul starii patologice. Mai mult, abordarea nivelului informational ereditar
aditional, epigenetic, implica integrarea unui element cheie, pana recent neglijat, si anume,
influenta mediului, respectiv al dietei, nutritiei, poluarii. Mutatiile, precum cele
punctiforme, care caracterizeaza polimorfismele de tip SNP (single nucleotide
polimorphisms) in gene particulare, a caror expresie este cruciala in cai metabolice cheie
pentru mentinerea sanatatii organismului, dar si a stabilitatii genomice sunt astazi
frecvente abordate intr-un nou algoritm de diagnostic al numeroase boli, precum cancerul,
bolile de reproducere si infertilitatea, bolile metabolice si neurodegenerative. Alaturi de
acestea, factorii particulari non-mendelieni, epigenetici, sunt buni informatori ai
efectelor pe termen lung al expunerii ambientale in decursul vietii indivizilor si,
surpinzator, dar evident azi, in decursul vietii parintilor si bunicilor/strabunicilor.
Nutrigenomica, relatia dintre mediu si genom, este asadar un domeniu extrem de tanar,
care ofera oportunitatea evaluarii, alaturi de factorii genetici si epigenetici, potentialul pe
care il are nutritia, alimentele si dieta, in general (care cuprinde asadar si stilul de viata) in
mentinerea stabilitatii genomice, in diagnosticul unor stari patologice si in regandirea
strategiilor de tratamente, in cadrul carora aspectul de personalizare si preventie este
definitoriu.
Slide 3
Paralel cu studiile de nutritie, domeniul genomicii a luat o amploare exploziva in ultimele doua
decade, mai cu seama prin intermediul aplicatiilor biologiei moleculare, ocupand actualmente
locul central in majoritatea sectoarelor de activitate umana, incluzand in mod special sanatatea.
Relatia care s-a stabilit in acest nou context dintre dieta si organismul uman se referea la
intelegerea reactivitatii specifice a organismului uman fata de anumite conditii de mediu,
respectiv, evident, fata de anumite tipuri de dieta. Actualmente, nutrigenomica este domeniul
care se ocupa cu studiul raspunsului indivizilor la o anumita alimentatie, prin corelarea acesteia
cu genotipul individual. O astfel de abordare personalizata a fost facilitata de tehnologiile
postgenomice in plina dezvoltare, care iau in considerare nu numai informatia genetica (secventa
nucleotidica la nivelul ADN), dar si un nivel aditional informativ, epigenetic
Informatia ereditara implica nu numai informatia genetica, dar si un nou nivel
informational, epigenetic. Informatia epigenetica este codificata, dupa cum indica si termenul,
nu la nivelul secventei nucleotidice ADN, ci la nivelul structurii cromatinei- materialul genetic
eucariot, care consta din complexul nucleoproteic: ADN/ proteinele histonice si nonhistonice. Cu
alte cuvinte, codul epigenetic contine grupe chimice, precum metil, acetil, ubiquitil, poli ADP
ribozil, biotinil, fosforil, care sunt transferate prin reactii enzimatice, endogene, la nivelul
resturilor de citozina din cadrul ADN dublucatenar, pe de o parte si la nivelul resturilor de
aminoacizi bazici (arginina si lizina) din cadrul proteinelor histonice si nonhistonice (histonele
octamerice sau nucleozomale, H2A, H2B, H3 si H4, si histona linker-1). Reactiile enzimatice
sunt catalizate de anumite transferaze, denumite efectori epigenetici (ADN metiltransferaze,
histon metilaze, histon acetilaze si histon deacetilaze, histon ubiquitinaze, histon fosforilaze etc),
care utilizeaza, in conditii de sanatate, in mod eficient stocurile de grupe metil, acetil, cofactori,
Slide 4
Pattern-urile particuare de modificari epigenetice constituie epigenotipuri care definesc un anumit
tip celular si deci o anumita fiziologie celulara. Devierea de la normalitate a acestor pattern-uri
inseamna o reprogramare a pattern-ului specific de expresie genica. Unele seturi de gene critice
pot fi astfel silentiate, altele, activate in mod aberant. Mai mult, modificarile epigenetice, ca si
cele genetice, sunt ereditare, dar, in schimb ele sunt reversibile. Epigenomul este reprogramabil
in functie de semnalele ambientale. In mod normal, el depinde de expresia spatio-temporala a
genelor: este foarte important de stiut ca anumite gene nu se modifica prin mutatii in diferite
tesututri. Ele sunt programate sa fie exprimate intr-un anumit tesut si intr-o anumita etapa de
dezvoltare a organului.
In acest mod, se poate explica de ce pattern-ul celular, reprezentat de un anumit set de gene
exprimate intr- un anumit set de proteine celulare, poate varia ca raspuns atat la semnalele
endogene, legate de dezvoltarea orhganismului, deci ontogenice, cat si la semnalele exogene, de
mediu. Astfel de modificari de pattern-uri celulare pot fi normale, de citodiferentiere si
maturizare, intr-o dezvoltare sanatoasa, armonioasa in interactie cu conditiile de mediu, sau poate
fi, dimpotriva, aberanta. Aceasta din urma se refera la transformarea programului geneticcelular
normal si deci la obtinerea unei noi specializari celulare, de obicei maligne.
Slide 5
In acest mod, se poate explica de ce pattern-ul celular, reprezentat de un anumit set de gene
exprimate intr- un anumit set de proteine celulare, poate varia ca raspuns atat la semnalele
endogene, legate de dezvoltarea orhganismului, deci ontogenice, cat si la semnalele exogene, de
mediu. Astfel de modificari de pattern-uri celulare pot fi normale, de citodiferentiere si
maturizare, intr-o dezvoltare sanatoasa, armonioasa in interactie cu conditiile de mediu, sau poate
fi, dimpotriva, aberanta. Aceasta din urma se refera la transformarea programului genetic celular
normal si deci la obtinerea unei noi specializari celulare, de obicei maligne.
Este clar actualmente faptul ca starea patologica este definita de o transformare a programului
de expresie genica fie prin modificari ale informatiei genetice, la nivelul secventei ADN, fie ale
informatiei epigenetice, codificate prin modificarile covalente ale ADN (metilarea ADN in
resturile de citozina), dar si a altor componenti cromatinici- proteinele histonice si nonhistonice.
Modificarile covalente ale ADN si histonelor sau nonhistonelor, precum metilarea ADN, pe de o
parte si, pe de alta parte, metilarea/ demetilarea, acetilarea/deacetilarea, fosforilarea,
ubiquitinarea, poliADPribozilarea, biotinilarea histonelor in anumite situri representate de resturi
de citozina si, respectiv, aminoacizi bazici precum lizina si arginina, conduc la o remodelare
activa a conformatiei cromatinei, ceea ce are un efect dramatic asupra proceselor de transcriere si
replicare ADN, deci a proceselor de expresie genica si diviziune celulara.
Slide 6
Pornind de la aceste considerente, starea patologica este definita in prezent nu numai prin mutatii
ale genelor, respectiv prin modificarea secventei ADN sau a informatiei genetice. Acestea sunt
fixate in genom devenind ireversibile si deci transmisibile din generatie in generatie, pornind de la
un fondator al mutatiei initiale. Ele sunt indicii ale unui anumit tip de vulnerabilitate fata de o
anumita boala, denumit risc familial. Se determina prin detectia mutatiilor la nivelul genelor
corespunzatoare, critice pentru o anumita eredopatie.
Un alt aspect care trebuie luat in considerare cand se doreste definirea unei stari patologice este, pe
langa genotipul, si epigenotipul sau pattern-ul distributiei grupelor chimice mentionate, dintre care
grupele metil au o prevalenta neta in discutia aspectelor de nutrigenomica, dar si grupele acetil, la
nivelul ADN si histone (metilarea AND si metilarea histonelor-mai cu seama, in conceptul actual,
metilarea histonei H3) si respectiv, la nivelul histonelor H3 si H4. Exista dovezi numeroase care
implica de asemenea si ubiquitinarea histonei H2B, inlocuirea anumitor histone (precum histona
H3) cu anumite variante (precum histona H3.3, de exemplu), ca si multe alte modificari covalente
care pot avea loc atat la nivelul componentelor cromatinei, histonele si nonhistonele, dar si la
nivelul efectorilor epigenetici, cum au fost denumite enzimele ADN metiltransferaza (DNMT),
histonmetilaza (HMT), histonacetilaza (HAT), histondeacetilaza (HDAC) etc. Activitatea acestor
enzime, dupa cum s-a mentionat anterior, depinde de anumite conditii de reactie, precum
concentratia enzimei/ substratului, de aciditatea mediului de reactie si de temperatura sau
concentratia in anumite minerale, de anumiti cofactori: vitamine, donori de grupe metil/acetil, de
structura specifica a proteinei cu activitate enzimatica, in special referitoare la domeniul catalitic
dar si de cele prin intermediul carora enzima interactioneaza cu alte componente ale reactiei
enzimatice. Cu alte cuvinte, reactiile endogene enzimatice sunt deosebit de complexe, pe masura
diversitatii alternativelor oferite de natura organismelor superioare de a-si proteja genomul, dar in
acelasi timp, de a capata si procesa corect toate informatiile importante provenite din mediu.
Slide 7
Metabolomica- este un domeniu tanar, care aduce un element in plus complexitatii abordarii
genomice si epigenomice in relatia cu mediul: caile metabolice complexe prin care elementele
externe sunt aduse in reactiile importante ale sintezei de acizi nucleici, de intretinere a
strabilitatii genomice, deci a unei structuri cromatinice adecvate unui pattern de expresie genica
corecta, normala. Enzimele si deci genele care controleaza aceste cai metabolice cu efect
indirect asupra stabilitatii genomice au un potential informativ extraordinar asupra
vulnerabilitatii unui organism fata de anumite conditii de mediu si deci de a dezvolta o anumita
boala. Totodata, metabolitii intermediari, precum anumiti donori de grupe metuil (SAM sau Sadenozilmetionina si derivatul sau S-adenozilhomocisteina sau SAH) / acetil / fosforil / ubiquitil
etc, ca si anumiti cofactori precum vitamina B6, B12, vitamina C sau anumite minerale (precum
cationii de Zn si Mg) sunt extrem de importanti in desfasurarea optima a reactiilor metabolice
critice in intretinerea genomica. Estimarea acestora, ca si a polimorfismelor genelor care
controleaza caile metabolice respective fac parte din obiectivele de studiu ale metabolomicii in
relatie cu mediul, respectiv, dieta. In cadrul acestui domeniu, metilomul a capatat recent o
importanta cruciala in nutrigenomica. S-a dovedit de altfel ca grupa metil, sau grupa
purtatoare de un singur atom de carbon, este cruciala in mentinerea unui genom care sa poata
exercita functiile sale in conditii optime.
Slide 8
Fig. 1 Influenta dietei bogate/sarace in folati (donori de grupe metil)
Si a activitatii enzimei critice MTHFR asupra proceselor de metilare ADN si
asupra stabilitatii genomice
Slide 9
Fig.2 Reactiile metabolice ale grupei metil in celula; procesele de sinteza si
metilare ADN sunt corelate cu activitatea de metabolizare in celula a folatilor,
sinteza de metionina si de S-adenozilmetionina; alterarea acestor procese induce
instabilitatea genomica.
Slide 10
Factorii endogeni ereditari, precum mutatia in anumite gene care controleaza cai
metabolice critice, cat si factorii exogeni, reprezentati de o dieta precara in
elemente esentiale desfasurarii reactiilor metabolice cu efecte importante asupra
mentinerii stabilitatii genomice, pot conduce la dezechilibre interne la nivelul
genomului cu potential patogen, prin inducerea instabilitatii genomice. Organismele
pot deveni vulnerabile la o varsta inaintata, devenind sensibile la aceste efecte
aparent minore, dar cu efecte dramatice asupra integritatii genomice si asupra
functiei corecte genomice, respectiv asupra mentinerii pattern-urilor celulare
corecte.
Instabilizarea genomica este o marca cunoscuta atat a unei celule canceroase, dar si
a unei celule senescente si a celulelor unui organism imbatranit. Din punct de vedere
genetic, celulele in procesul imbatranirii sufera schimbari majore ale controlului
proesului de dezvoltare. Etapa imbatranirii este deci caracterizata de un program
genetic si epigenetic nou, deci de pattern-uri modificate celulare, care difera de
cele ale celulelor unui organism tanar prin elemente inca neidentificate cu precizie.
Se cunosc insa foarte bine efectele modificarii acestui program genetic vizibile la
nivelul tesuturilor pielii, la nivelul functionarii sistemului digestiv, neuronal, dar si
circulator, organismul batran fiind mult mai vulnerabil la anumite boli precum cele
cognitive (Alzheimer, Parkinson, pierderea memoriei, demente etc), metabolice
(diabetul, bolile cardiovasculare), dar si cancerul. Aceasta vulnerabilitate este
evident legata de instabilitatea genomica, dar biomarkerii specifici ai procesului de
imbatranire sunt departe de a fi definiti. Exista numeroase descoperiri privind
modificarile specifice acestei perioade de dezvoltare la nivelul anumitor gene
(acumularea de mutatii, dar si de modificari epigenetice) cat si la nivelul unor
proteine interesante cu activitate enzimatica, reprezentand tinte moleculare in
studiile farmacogenomice.
Slide 11
Actualmente exista teorii privind mutatiile in cadrul unor anumite gene asociate cu bolile
mentionate anterior, precum genele pentru apolipoproteine (A,B,C,E etc), care sunt corelate cu
nivelul trigliceridelor, colesterolului, dar si cu longevitatea sanatoasa si dezvoltarea bolii
Alzhheimer, genele pentru proteina TAU, corelate cu formarea placii proteice specifice bolii
Alzheimer, genele pentru sirtuine, proteine cu activitate HDAC, avand rol protector genomic,
fiind activate in special in urma dietelor de restrictie calorica, genele pentru angiotensina (ACE)
corelate cu bolile cardiovasculare, dar si gena mthfr, asociata cu imposibilitatea asigurarii unui
nivel de folati celulari adecvati pentru reactiile de metilare genomica sau proteica. Noutatile din
domeniu sunt extrem de numeroase: ele se refera la o pleiada de multe alte gene care
controleaza capacitatea de reparare a ADN, desfasurarea ciclului celular in conditii optime, de
inhibare a proliferarii celulare in cazul in care exista o tentdinta marita a genomului imbatranit
de a acumula mutatii sau epimutatii si de a angaja nucleul in proliferare necontrolata, precum
cea neoplazica.
In continuare se vor prezenta rezultatele obtinute in diferite sisteme biologice asociate
imbatrabirii prin abordarea analizei polimorfismelor SNP.
Slide 12
Bolile cardiovasculare (CVD) si sistemul renina-angiotensinaaldosterona, caracterizat prin polimorfismul genei ACE
(angiotensincatabolizing enzyme)
Slide 13
ACE- angiotensin converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 1
Locus cromozomal : 17q23.3
Regiunea ADN codificata: 21 kb -26
exoni
Produsul genei ACE: enzima ACE,;
contine1306 aa,; este o peptida cu rol de
semnalizare in axa raa
contine doua domenii catalitice
C-terminal reprezinta approximativ 75%
din capacitatea catalitica
N-terminal-este folosit in inactivareat
bradykininei, neurotensinei si a
substantei-P
Rol: este o enzima proteolitica converteste
forma inactiva a angiotensinei II intr-o
forma activa (vasoconstrictoare) ;
inactiveaza bradykinina si kallidina
(vasodilatatoare)
ACE-structura 3D
Slide 14
Polimorfismul genei ACE: insertie-deletie
(I/D) a unui segment de baze de
dimensiunea 287 pb in intronul 16
A. Titia Lely 2007
Genotipul ACE DD a fost asociat cu concentratia crescuta in plasma a
enzimei ACE circulante, ceea ce determina conversia mai eficienta a
angiotensinei I la II
Slide 15
Pattern-ul electroforetic al polimorfismelor ACE I/D
L- Ladder
ID- heterozigot (insertie/deletie)
DD- homozigot (deletie)
II- homozigot (insertie)
Slide 16
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR )
Caile metabolice ale obtinerii metioninei/ homocisteinei
/ADN metilat
(THF-tetrahidrofolat,SAM S-adenosimetionina- donor de
grupe metil)
M. C. Koch et al, 1997
Slide 17
Gena MTHFR
Locus cromozomal 1p36.3
DNA codificator: 2,2kb , 11 exoni
Produsul genei: enzima MTHFR 656AA; 74,5kDa
Forma activa este un dimer cu 2 domenii majoreN-terminal (catalitic) si C- terminal (reglator)
Slide 18
Polimorfismul C677T in gena MTHFR
Exonul 4 : 677 C - - - → T; alanina - - - → valina
Efectul: forma termolabila, instabila, a enzimei
Homozigotii TT : prezinta o activitate mai slaba MTHFR – 3550% fata de cea normala → aceasta forma este asociata cu
concentratie mare de homocisteina
Polimorfismul 1298C polymorphism in gena MTHFR
Exonul 7: 1298 A ---→C, glutamat ---→alanina
Homozogotii CC – prezinta o scadere slaba a activitatii (60%)
-Nu este asociat cu cresterea honcentratiei in Hcis
-Efectul: de obicei este in combinatie cu efectul polimorfismului
C677T
-heterozigotii cu ambele polimorfisme: prezinta o crestere
semnificativa a Hcis, in particular- in conditiile unei concentratii
scazute de folati
Slide 19
Metoda-Reverse hybridization - pentru analiza polimorfismelor
in gena pentru MTHFR C677 si A1298
SNP-MTHFR-C677T este
foarte comun.
-Cca 40% din populatie este
homozigota pentru tipul salbatic
C677,
-45% este heterozigota pentru
ambele alele C677 si T677; iar -cca 15% sunt homozogoti
purtatori ai alelei cu mutatia
T677.
A- homozigota pentru MTHFR 1298C Mut
B- heterozigota pentru MTHFR C677 – WT si MTHFR 677T Mut
C- heterozigota pentru MTHFR A1298 – WT si MTHFR 1298C Mut
D- homozigota ptr MTHFR 1298C Mut
E- homozigota ptr MTHFR C677 – WT
F- homozigota ptr MTHFR A1298
Slide 20
Factorii epigenetici studiati: procesele de metilare ADN. La nivel global, un proces de
instabilizare genomica este frecvent asociat cu hipometilarea ADN. La nivel local, in
gene critice, procesul de metilare ADN aberant este asociat cu hipermetilarea
promotorilor.
Metoda de estimare a hipometilarii globale ADN utilizeaza perechi de enzime
isoschizomere ex. (MspI/HpaII) si este abordata pentru estimarea comparataiva a
profilelor de restrictie a ADN genomic.
Hipometilarea aberanta ADN global este frecvent asociata cu aneuploidii si cu
fenomene de anafaze timpurii sau disocieri promature de cetromeri (cromatide
surori)-PCD.
Metoda de estimare a hipermetilarii (methylation specific PCR-MSPCR) este deseori
asociata cu silentierea aberanta a unor gene critice precum cele care sunt implicate
in metabolismul si activitatea hormonala. O astfel de gena critica in cancerogeneza si
in imbatranire este gena pentru receptorul de estrogen (ESR). Hipermetilarea
promotorului acestei gene a fost asociata cu cancerul mamar, endometrial si cu
imbatranirea.
Slide 21
Exemple de electroforegrame reprezentand profile de restrictie cu enzime
izoschizomere care demonstreaza hipometilarea globala ADN genomic la persoane
varstnice (b) , comparativ cu persoane tinere (a)
Slide 22
ESR1 (Estrogen Receptor 1)
Locus cromozomal 6q25.1
Fragmentul DNA: 412.78 kb ; 8 exoni
Produsul genic: ER-α , subfamilia 3 de receptori nucleari, grupa
A, member 1
Domenii:
N terminal -modulator
Domeniul central- bipartite zinc finger DNA binding domain
Domeniul NLS (nuclear localization signal ) cu afnitate pentru
ADN; este necesar pentru interactia cu inalta afinitate indusa de
estradiol
C terminal - domeniu de legare a ligandului; include un domeniu
de transactivare si un domeniu de dimerizare
Este activat de hormonul de sex, estrogen
Slide 23
Exemplu de electroforegrame reprezentand ampliconii unei reactii
MSPCR de detectie a statusului de metilare in promotorul genei ESR 1;
forma M-metilata este asociata cu silentierea aberanta a ESR1 in
cancerogeneza si in imbatranire
Nr pacient
ERα
1
2
3
4
5
6
7
8
9
U
M
U
U
U
U
U
-
M
Slide 24
Exemplu de cariotip alterat datorat demetilarii ADN centromeric si pericentromeric;
acest fenomen este asociat cu aneuploidii si PCD (A), dar si cu mutatii precum
deletii (cr. 4,6,15 (B) in cancerogeneza si la persoane varstnice
A
A - fenomene PCD-premature chromatides
dissociations
B
B - deletii pe cromozomii 4,6,15
Slide 25
Investigatiile metabolomice au
implicat abordarea HPLC pentru
estimarea metabolitilor :donor de
grupe metil -SAM si a produsului
acestuia, SAH. Exemplu de rezultate
obtinute in urma examinarii
raportului SAM/SAH in probe de
sange uman. Variatia este asociata cu
varsta, sex, stare de sanatate.
Slide 26
Colectivul propune un algoritm de studiu al instabilitatii genomice in diferite
stari patologice si in procesul imbatranirii, care include:
Factori genetici- Testele clasice de cariotipare, care urmaresc identificarea
mutatiilor prin variatia morfologiei cromozomale (deletii, ruperi cromozomale etc)
Factori epigenetici- Fenomene PCD in cariotipuri clasice-asociate cu alterarea
conformatiei heterocromatinei in regiunea pericentromerica
-Hipometilarea ADN globala
-Hipermetilarea ADN locala (gene critice/tumor supresoare)
Factori bipchimici (metabolomici) asociati cu instabilitatea metilomului celular
-genotiparea mutatiilor punctiforme- (SNP)
- estimarea raportului SAM/SAH, ca precursori ai Hcis
Slide 27
Referinte
Abdel Halim Salem and Mark A Batzer (2009); High frequency of the D allele of the angiotensin-converting enzyme gene in Arabic populations. BMC
Research Notes, 2:99
Zhang R, Xu X, Chen T, Li L, Rao P (May 2000). "An assay for angiotensin-converting enzyme using capillary zone electrophoresis". Anal. Biochem.
280 (2): 286–90.
M. C. Koch á K. Stegmann á A. Ziegler á B. SchroÈ ter á A. Ermert; Evaluation of the MTHFR C677T allele and the MTHFR gene locus in a German
spina bifida population. Eur J Pediatr (1998) 157: 487-492
Goyette P, Summer JS, Milos R, Duncan AMV, Rosenblatt DS, Matthews RG and Rozen R (1994) Human methylenetetrahydrofolate reductase:
Isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet 7:195-200.
Goyette, P., A. Pai, R. Milos, P. Frosst, P. Tran, Z. Chen, M. Chan and R. Rozen, 1998. Gene structure of human and mouse
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR). Mamm Genome, 9: 652-656.
Walter P, Green S, Greene G, Krust A, Bornert JM, Jeltsch JM, Staub A, Jensen E, Scrace G, Waterfield M (December 1985). Cloning of the human
estrogen receptor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (23): 7889–93
Greene GL, Gilna P, Waterfield M, Baker A, Hort Y, Shine J (March 1986). "Sequence and expression of human estrogen receptor complementary
DNA". Science (journal) 231 (4742): 1150–4.
Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, Cambien F, Corvol P, Soubrier F. An insertion/deletion polymorphism in angiotensin I-converting enzyme gene
accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest. 1990;86:1343–1346.
Bowen DJ, Bowley S, John M (1998) Factor V Leiden (G1691A), the Prothrombin 3'-Untranslated Region Variant (G20210A) and Thermolabile
Methylenetetrahydrofolate Reductase (C677T): A Single Genetic Test Genotypes all Three Loci - Determination of Frequencies in the S. Wales
Population of the UK
Thromb Haemost 79: 949-954
This work was supported by the National Research Program contract AGECVD coordinated by National Institute of Gerontology and Geriatry “Ana
Aslan”; parteners of the Consortium: University of Bucharest, Stefan Nicolau” Institute of Virology, Coltea Hospital, National Institute of Biological
Sciences. The contribution of the Cytogenomic Medical Laboratory is aknowledged.