Slide 1

Licence pro QSR2A
TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.


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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes
2.1. Définitions
• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes
2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
•

Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un microorganisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de
micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est
appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme.
Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou
inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des
zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans
l’échantillon.
Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence
congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre
et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont
découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des
boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont
déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser
simultanément trois échantillons.
Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution
d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).
Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon)
sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidification
Le principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par
l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un microorganisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du microorganisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat
est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.
La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.
Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés
pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier temps
un traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de
micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la
croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture
d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de
bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC,
par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.
Résultats des témoins :
Résultats des essais :
(+)
(-)

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon
présente une zone d’inhibition de 10 mm
minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y
a présence de traces d’antibiotiques dans
l’échantillon). Les témoins positifs doivent
présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes
2.5. Détection par méthode microbiologique
• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitière
Le test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture
ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme
indicateur de pH (principe du test d’acidification).
On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin
négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un
temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune
pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique.
Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats
avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et
inter-laboratoires).
Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les
tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.
Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un
large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identification
précise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les
milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes
2.7. Autres méthodes
Il existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques
chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse
(recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM,
sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).
Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays
européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient
pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation
(identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en
conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90
relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est
ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un
premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques
responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen
d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire
national de référence.
Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes
de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats
positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto
(les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors
que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules
dont on a mis le spectre de masse en mémoire.