Slide 1

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 2

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 3

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 4

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 5

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3








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



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


DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 6

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 7

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 8

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 9

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 10

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 11

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 12

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 13

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 14

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 15

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 16

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 17

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 18

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 19

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 20

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 21

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 22

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 23

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 24

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 25

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 26

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 27

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 28

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 29

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 30

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 31

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 32

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 33

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 34

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 35

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 36

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 37

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 38

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 39

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

38

Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

39

BIENVENUE A GATTACA

40


Slide 40

RETARD MENTAL
&
CGH Array

1

D. LE TESSIER, I. JÉGOUX, A. MÉNARD
Laboratoire de cytogénétique
Hôpital Cochin. Paris

LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE


Selon l’Organisation Mondiale de la Santé :



« Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un



développement mental incomplet, caractérisé par une
insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence,
notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité
et des performances sociales. Des capacités intellectuelles
réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le
diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité
d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement
social »
L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition
que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans
(Chelly 2000)

2

EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

Type de retard
mental

Valeur du QI

Fréquence

Léger

50-70

85%

Modéré

35-49

10%

Sévère

20-34

4%

Profond

<20

1-2%

3


















DI légère
Repérée lors des premières difficultés scolaires.
Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion
d’arithmétique (éducation spécialisée).
Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales.
Intégration dans la société.
DI modérée
Langage acquis.
Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être
assimilés mais de façon limitée.
Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel.
DI grave ou profonde
Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs.
Pas de langage ou de façon très atténuée.
Accompagnement dans des institutions spécialisées.
Pas d’accès au monde du travail.
4

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
ENVIRONNEMENT ( 20% des DI)








Infections maternelles périnatales : rubéole, toxoplasmose,
syphilis, cytomégalovirus.

RCIU : corrélation entre le faible poids de naissance et
l’augmentation de la prévalence de DI.
Alcoolisme et autres substances toxiques :
prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800
(selon études) en France.
métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues.
Complications vaccinales : devenues rares
o

Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres
plus élevée que dans les pays riches.

5

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE I (40% des DI)


Anomalies chromosomiques entraînant la modification de
l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique
remaniée.


Aneuploïdies



Trisomie 21 …



Anomalies de structure déséquilibrées



Inversions ,translocation, anneaux…



Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal)



Microduplications



Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques).



Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont
détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

6

µdel 70% des cas de PWS
30% avec DUP

µdel 70% des cas de AS
5% avec DUP

7

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE II


Mutations affectant un seul gène induisant les causes
monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué
dans le développement des fonctions cognitives.
Pathologies liée à l’X



Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1)



Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) ……..

ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability)




Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation
16p13.3. Gène TSC2)
Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1)

ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)
8

Vous ne voyez rien car tellement de gènes

9

ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:
GENETIQUE III


Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques
ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre
d’empreinte)



Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS)



Syndrome d’Angelman (10%)



Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat)



Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

10

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb

LA FISH: choix des sondes (ciblée)

11

LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE
La M FISH:
information sur les remaniements

CGH sur métaphases:
résolution 3-10Mb
ADN patient

ADN témoin

Métaphase
normale

12

Microarray : support en verre sur lequel sont déposées
ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA
(Analyse Chromosomique sur Puce à ADN)
Dépôt (= Spotting)
de produits de PCR/
BAC/PAC

Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60
nucléotides)

Jet d’encre (Agilent)

2000 spots/cm²

18.000 spots/cm²
2 types de technologies

Photolithographie
(Affy;Nimblegen)

>100000 spots/cm²
13

ADN patient
Cy3

Extraction des données: logiciel

ADN Témoin
Cy5

Duplication
vert > rouge

Combinaison

Normal
vert = rouge

4 H ou plus

20 à 40 h

Hybridation

CGX-3

CGX-6

Délétion
vert < rouge

CGX-12

Lavages
et scan
30 min

1 spot= 1 séquence ADN en
plusieurs copies

14

AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array


Avantages








Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques.
1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution.
Localisation précise des déséquilibres.
Identification des marqueurs surnuméraires.
Puces « à façon » disponibles.

Limites
Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées.
 Interprétation des résultats délicate.
 Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement
déséquilibré.
 Problème des mosaïques.


15

LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN®
EXPÉRIENCE DE COCHIN

16

LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array

Puce utilisée: 12x135K

1 puce= 12 patients

135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne
1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

CGX-12

17

RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES
Extraction ADN
260/280 >1,8
260/230 ≥ 1,9
Migration +++

Qualité de l’ ADN

18

STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch)
CY 3

24 marquages
12 Hybridations
12 résultats

Cy5

Patient 1 / Patient 2
Patient 2 / Patient 3
Patient 3 / Patient 1

Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5

Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5

19

SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

20

GENOGLYPHIX®

Chromosome15( dup + del)

21

GENOGLYPHIX®

délétion

Amplification
Clones maison

Gènes de la région

Clones UCSC

Variants

22

Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb.

Patient Cy5

Patient Cy3

Variants

23

PATIENT 1: CO. S
Petite fille née le 23/12/2002






Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité
modérée. Nystagmus.
Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression
des acquisitions . Langage limité à des sons.
Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

24

RESULTAT DE LA PUCE

Patient Cy3

Nuage de points

Patient Cy5

Miroir

25



Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4
emportant une partie du gène CASK

Taille de la délétion
Patient Cy3

Nuage de points

Miroir

Patient Cy5

26

ETUDE DU PATIENT

FISH

PCRq

2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.5

1 copie
QR=0.45

27

CARTE UCSC du gène CASK
Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

28

ETUDE DES PARENTS
FISH

PCRq
2 copies
QR=1

1 copie
QR=0.45

2 copies
Q R=0.98

1 copie
QR=0.45

29

INTERPRÉTATION - CONSEIL GÉNÉTIQUE




La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion
de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette
délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette
délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène
CASK impliqué dans le développement cérébral.
La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce
gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau
clinique de la patiente
conseil génétique adapté.

30

PATIENT 2: CA.R




Garçon né le 30.04.2001

Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de
propreté acquise.



Evolution par paliers sans réelle régression.



Absence de langage, nombreuses stéréotypies.



Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.
31

Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du
chromosome 16 en 16p13.1

Patient Cy3

Patient Cy5
Variants

32

Carte Ensembl! du gène MYH11
Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952 ……

Gène MYH11

33

PCR quantitative du patient et de la famille

34

FISH patient et famille

Patient

Soeur

Maman

35
Frère

INTERPRÉTATION ET CONSEIL GÉNÉTIQUE










La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle
16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une
technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11

Cette duplication est d'origine maternelle.
Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle
lisse.
L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer
l’hypothèse
d’une
insertion
interchromosomique
comme
mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur
noyaux interphasiques
La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents
et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait
de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne
peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du
patient.

36

LES CNVs (Copie Number Variation)








Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de
nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants
de structure .
Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors
que d’autres sont pathogènes.
Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre
de copies variables.

Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de
CGH array.
37

INTERPRETATION DES CNVS
Interprétation des CNVs
CGH Array
Normal

CNVs
Inconnu
Analyse
des parents
par FISH et PCRq

Connu
(bases de données)

Hérité

CNV
causal

Polymorphisme

de novo

CNV causal

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Activité 2010
226 CGH array
133 rendues normales
46 avec anomalies
(47 non rendues car attente des parents)

Activité 2011
 352 CGH Array
65 remaniements détectés
Soit un taux d’anomalies de 18,5%

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BIENVENUE A GATTACA

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