Transcript ALLINEAMENTI GLOBALI E LOCALI Consideriamo i Nel seguenti due differenti allineamenti delle stesse sequenze primo caso si hanno 14 identità (evidenziate dalle linee verticali.

ALLINEAMENTI GLOBALI E LOCALI
Consideriamo i
Nel
seguenti due differenti allineamenti delle stesse sequenze
primo caso si hanno 14 identità (evidenziate dalle linee verticali che uniscono
aminoacidi uguali) e tre sostituzioni conservative (es. A-I, S-T) distribuite su tutta
la lunghezza della sequenza. Nel secondo caso si hanno 13 identità ed una
sostituzione conservativa su una regione di 14 aminoacidi.
Quale dei due allineamenti è da considerarsi migliore?
(N.B. L’allineamento globale, secondo alcuni, dovrebbe comprendere l’intera
lunghezza di entrambe le sequenze; nell’esempio dovrebbero essere quindi aggiunti
un gap all’inizio ed uno alla fine)
ALLINEAMENTI GLOBALI O
LOCALI?
Dal
punto di vista biologico generalmente vengono privilegiati gli allineamenti
locali, che riguardano regioni limitate delle proteine o di acidi nucleici.
In
Biologia Molecolare avrete sicuramente sentito parlare di domini delle proteine
o anche degli acidi nucleici. Se ad esempio siamo interessati a trovare tutte le
sequenze di proteine di una banca dati che contengono un certo dominio, allora
sicuramente si cercheranno similarità locali.
Gli
allineamenti globali vengono applicati quando si vogliono confrontare
accuratamente due sequenze in cui la similarità sia estesa per tutta la lunghezza
N.B.
Un allineamento locale non è necessariamente limitato ad una piccola
regione della sequenza, ma potrebbe estendersi anche all’intera lunghezza della
sequenza.
Programmazione dinamica
Fornisce l’allineamento ottimale tra due
sequenze
 semplici variazioni dell’algoritmo
producono allineamento globali o locali
 l’allineamento calcolato dipende dalla scelta
di alcuni parametri

ALGORITMO “DINAMICI” DI
ALLINEAMENTO
Ora
inizieremo a considerare alcuni algoritmi esatti di allineamento in grado di
determinare il miglior allineamento possibile tra due sequenze in base ad una certa
matrice di sostituzione (scelta a seconda della distanza “evolutiva” tra le due
sequenze) e ad un criterio di penalità da attribuire ai gap inseriti.
Needleman
e Wunsch nel 1970 furono i primi a risolvere il problema con un
algoritmo in grado di trovare similarità globali in un tempo proporzionale al
prodotto della lunghezza delle due sequenze.
Nel
1981 Smith e Waterman svilupparono un nuovo algoritmo in grado di
individuare anche similarità locali.
Entrambi
questi algoritmi sono basati su un approccio informatico chiamato di
“programmazione dinamica”.
abbiamo visto che per generare e valutare il miglior allineamento
di due sequenze di lunghezza m e n, è necessario effettuare
mxn confronti
il numero di operazioni da effettuare cresce e i tempi di calcolo di
conseguenza si allungano se si vogliono considerare anche i
possibili gap in tutte le posizioni (e di tutte le lunghezze possibili)
di entrambe le sequenze
IPLMTRWDQEQESDFGHKLPIYTREWCTRG
||||||||||
CHKIPLMTRWDQQESDFGHKLPVIYTREW
IPLMTRWDQEQESDFGHKLP-IYTREWCTRG
||||||||| |||||||||| ||||||
CHKIPLMTRWDQ-QESDFGHKLPVIYTREW
abbiamo definito un modo sofisticato di valutare il punteggio di
un allineamento, che tenga conto di
• punteggi diversi per ogni possibile coppia di residui allineati
(matrici di sostituzione)
• gap penalties e
•gap extension penalties per valutare penalizzazioni dovute
all’introduzione di gap nelle sequenze allineate
ora bisogna trovare il modo di utilizzare tutti gli strumenti e le
valutazioni messe a punto finora senza superare la soglia di
complessità di calcolo [ O(mxn) ] che renderebbe il problema non
applicabile alle ricerche di similarità in banche dati
allineamenti tra due sequenze - programmazione
dinamica
buone notizie: la programmazione dinamica è in grado
di trovare il miglior allineamento globale tra due
sequenze
cattive notizie:
1) spesso l’output mostra più allineamenti
DIVERSI col massimo del punteggio
2) ci mette TROPPO TEMPO per effettuare una
ricerca esaustiva
Algoritmi dinamici di allineamento
dividiamo la procedura in 3 passi successivi
1) consideriamo le due sequenze da allineare in una
specie di dot matrix : nelle caselle scriviamo i
punteggi in rosso derivati dalla matrice di sostituzione
scelta
allineamento
punteggio
QERTY
|||:
QERS
QQ + EE + RR + TS =
4 + 4 + 6 + 1 = 15
cominciamo a calcolare la matrice di questo allineamento usata
nell’algoritmo di programmazione dinamica
Q
E
R
S
Q
4
2
1
-1
E
2
4
-1
0
R
1
-1
6
0
T
-1
0
-1
1
Y
-4
-4
-4
-3
calcolando le somme lungo le diagonali, effettueremmo
un’operazione equivalente al calcolo dei punteggi
ottenuto facendo scorrere le due sequenze l’una
sull’altra
resterebbe aperto il problema della valutazione dei gap
Algoritmi dinamici di allineamento
passo 2 della procedura:
ricerca del percorso che consente di ottenere il
massimo punteggio in base a delle regole stabilite,
tenendo anche conto dei gap
qualche semplice osservazione ci consente di
risparmiare tempo di calcolo:
se una sequenza è scritta da sinistra a destra e l’altra
dall'alto in basso, allora qualsiasi percorso valido deve
mantenere sempre una direzione tendenziale che va
dall'angolo in alto a sinistra a quello in basso a destra
Misura della similarità:
i punteggi in diagonale si SOMMANO
fuori dalla diagonale, si PENALIZZA di 5 punti
vediamo quindi come si calcolano le cifre riportate in
nero nella matrice
evidenzieremo poi in grigio il migliore percorso
all’interno della matrice, secondo le regole e i punteggi
stabiliti
il migliore allineamento globale per le sequenze in
matrice risulta quindi il seguente:
TFDERILGVQ-TYWAECLA
|| | | | . ||
QTFWECIKGDNATY
per ricostruire l’allineamento migliore si può memorizzare il
percorso disegnato riempiendo la matrice
TFDERILGVQ-TYWAECLA
|| | | | . ||
QTFWECIKGDNATY
alla fine bisogna partire dalla casella a punteggio maggiore e
ricostruire il percorso a ritroso seguendo le freccette
PERCORSI VALIDI
Un
allineamento tra le due sequenze è rappresentato da un percorso all’interno
della matrice, avente direzione tendenziale dall’angolo in alto a sinistra all’angolo
in basso a destra (frecce nere di figura).
Non avrebbero senso percorsi da destra a sinistra o dal basso verso l’alto: ciò
significherebbe considerare nuovamente un aminoacido già allineato (una sorta di
ripiegamento).
Spostamenti orizzontali o verticali equivalgono all’inserimento di gap allineati
con il simbolo che si raggiunge nella nuova riga o colonna
PUNTEGGI
In
ogni casella viene memorizzato il punteggio dell’allineamento fino a quella
casella.
La “programmazione dinamica” consiste proprio nell’assegnare un valore ad
ogni casella della matrice di allineamento a partire dai valori contenuti nelle tre
caselle adiacenti (raffigurate con il “?” in figura) che a loro volta saranno state
calcolate precedentemente. L’algoritmo infatti procede da sinistra a destra lungo le
righe della matrice e terminata una riga passa alla riga successiva. Se vengono
predefinite la prima riga e la prima colonna, l’algoritmo è quindi in grado di
riempire automaticamente tutto il resto della matrice.
PERCORSO OTTIMALE: ALL.
GLOBALI
Così
come è stato ideato da N. & W. l’allineamento globale comprende l’intera
lunghezza di entrambe le sequenze e pertanto un percorso ottimale inizierà
necessariamente dall’angolo in alto a sinistra della matrice e terminerà nella casella
in basso a destra (che conterrà anche il punteggio dell’allineamento ottimo
globale).
abbiamo
deciso di trascurare i gap iniziali e finali nelle due sequenze, per cui gli
allineamenti “globali” che consideriamo sono quelli che iniziano dalla prima riga o
dalla prima colonna e terminano nell’ultima riga o nell’ultima colonna.
Per individuare l’allineamento ottimale è sufficiente individuare appunto
nell’ultima riga o colonna la casella con il massimo punteggio e poi ricostruire il
percorso che ha portato a quella casella a partire da una casella della prima riga o
colonna
ALLINEAMENTO GLOBALE
Nella
versione di allineamento globale viene effettuata una sorta di preelaborazione, che consiste nel riportare tutti i punteggi di allineamento per ogni
possibile coppia di simboli che si incontrerà nella matrice, in maniera da averli già
tutti pronti e non doverli cercare successivamente nella matrice di sostituzione.
E’ da
notare che anche la matrice di sostituzione usata non è una classica PAM o
BLOSUM ma è stata normalizzata in modo da non contenere valori negativi. In
questo modo si garantisce che il punteggio dell’allineamento non diminuirà
spostandosi verso destra e verso il basso nella matrice di allineamento.
Smith & Waterman (1981)

Allineamento locale
– Il sistema di punteggio deve includere valori
negativi per amminoacidi diversi
– quando il valore della matrice diventa negativo,
allora viene fissato a 0
– l’allineamento viene prodotto a partire dalla
casella che contiene il valore massimo attraverso
un retropercorso che si ferma ad una casella con
valore 0
Algoritmi dinamici di allineamento
il valore assoluto dei punteggi che associamo agli
allineamenti dipende dai valori contenuti nella matrice
di sostituzione che utilizziamo
ci sono matrici i cui valori variano tra 0 e 100, altre che
variano da -1 a +1, adottando punteggi decimali
é importante notare che il punteggio è
massimo in senso relativo
Algoritmi dinamici di allineamento
L’ algoritmo di Needleman e Wunsch è stato
sviluppato per l’allineamento globale
L’ algoritmo di Smith e Waterman è stato sviluppato
per l’allineamento locale
Ma ciò che realmente fa diventare un algoritmo di
questo tipo locale o globale è il tipo di matrice di
sostituzione che si usa:
se contiene solo valori +
allineamenti globali
se contiene valori +/allineamenti locali
RICOSTRUZIONE ALLINEAMENTO
Proviamo
a ricostruire l’allineamento “globale” trovato come ottimo
nell’esempio.
Si parte dalla casella con il valore 66 (quella con il valore massimo nell’ultima
riga o colonna).
Il 66 è stato ottenuto da 56+10, da 59-5 o da 51-5? Da 56+10 e quindi si può
allineare Y con Y.
Il 56 da dove è stato ottenuto? Da 57-5, da45-5 o da 48+8?
.....
N&W SU EMBOSS
Sempre
sul sito GUI di
EMBOSS
http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/
EMBOSS/
è
disponibile una versione
eseguibile sul WEB
dell’algoritmo di Needleman &
Wunsch (needle).
PARAMETRI
In
genere si lasciano i parametri prefissati, però è possibile cambiare il punteggio
attribuito all’apertura di un gap (10) e alla sua estensione (0.5).
Anche
la matrice di sostituzione può essere scelta, a seconda della distanza
filogenetica tra le sequenze da confrontare
ESEMPIO
Proviamo
a confontare le due diverse proteine derivanti dallo stesso gene
“subunità 1A di rubisco” di Arabidopsis thaliana
ESEMPIO
Accediamo
al record del gene e attraverso i link ai due diversi record delle
proteine (hanno i codici NP_176880 e NP_974098)
Link ai record dei mRNA
corrispondenti (nel database GENBANK)
Link ai record delle proteine
corrispondenti (nel database PROTEIN)
ESEMPIO
Codici GENBANK
: 15219826 e 42572015
Codici REFSEQ (database composto di sequenze “pulite e verificate” di mRNA e
PROTEINE: NP_176880 e NP_974098
180 AA
136 AA
ESEMPIO
ESEMPIO
| Aminoacidi conservati
: Aminoacidi sostituiti in modo conservativo
ALTRO ESEMPIO
Proviamo
ad allineare anche le due sequenze nucleotidiche dei mRNA delle due
varianti della 1A di rubisco di arabidopsis (clickare sui link mRNA dal record di
GENE )
ALTRO ESEMPIO
Proviamo
ad allineare anche le due sequenze nucleotidiche dei mRNA delle due
varianti della 1A di rubisco di arabidopsis (clickare sui link mRNA dal record di
GENE )
S&W SU EMBOSS
Sempre
sul sito GUI di
EMBOSS
http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/
EMBOSS/
è
disponibile una versione
eseguibile sul WEB
dell’algoritmo di Smith &
Waterman (water).
ESEMPIO
Sempre
le due varianti della 1A di rubisco di arabidopsis
ESEMPIO
ALTRO ESEMPIO
Proviamo
anche con le due sequenze nucleotidiche
METODI EURISTICI
I
programmi dinamici visti sinora (N&W e S&W) sono ideali per allineare
sequenze in modo esatto, ma sono troppo lenti per effettuare ricerche di similarità
in banche dati (abbiamo visto le dimensioni delle banche dati...).
Per allineare due sequenze di mille basi servono 1000x1000
operazioni=1.000.000. Anche contando un centesimo di secondo per allineamento
provate ad immaginare una ricerca in un database di milioni di sequenze...
Richiederebbe decine di migliaia di secondi cioè diverse ore!
Perciò
sono stati ideati dei programmi molto più veloci ma “approssimati” che
rinunciano ad un po’ di precisione (non è garantito che la sequenza indicata come
più simile lo sia effettivamente!).
FASTA
Sviluppato da
Lipman e Pearson nel
1985.
Effettua una indicizzazione di parole
(ktup=2 per proteine (400 possibilità)
e ktup=6 per acidi nucleici), cioè un
elenco delle posizioni in cui
compaiono tutte le possibili parole di
quella lunghezza, sia per query, sia per
ogni sequenza (subject) del database.
Ogni volta che una parola è trovata
su entrambe le sequenze questa è
rappresentata come diagonale (fig. A).
Il programma poi assegnando degli
score cerca di unire più diagonali in
modo da trovare il percorso migliore
SERVER WEB FASTA
http://www.ebi.ac.uk/fasta33/
ESEMPIO ESECUZIONE
Proviamo
a cercare nel database SWISSPROT la solita sequenza proteica della
subunità 1A di RUBISCO
Si
può subito notare il tempo impiegato per la ricerca!
RISULTATI
Elenco
delle proteine più simili trovate
E-VALUE
I
programmi di ricerca di similarità restituiscono un E-VALUE come indice della
bontà dell’allineamento.
Tale valore (che dipende da molti fattori, tra cui la lunghezza della sequenza
query, la lunghezza del match trovato, la dimensione del database su cui si è
effettuata la ricerca...) rappresenta la probabilità che tale allineamento sia dovuto al
caso.
Quanto più tale valore è prossimo allo 0 tanto migliore è l’allineamento. In genere
viene usata la notazione scientifica per esprimere l’e-value.
1.9e-110 significa 10
elevato alla –110 quindi un valore molto prossimo allo 0!
0.1 invece significa che una volta su 10 si può ottenere casualmente lo stesso
allineamento
BLAST
Basic
Local Alignment Search Tool è
stato sviluppato (e successivamente)
migliorato da Altschul ed altri ricercatori
del NCBI a partire dal 1990.
Anche BLAST effettua una
indicizzazione di parole. Si crea un indice
di parole di una certa lunghezza (es W=3
per le proteine). Per ogni parola di
lunghezza W della query viene generata
una lista di parole affini (W-mers) che
producono uno score superiore ad una
soglia T se allineati con la parola della
sequenza query. Si cercano quindi in tutte
le sequenze della banca dati le W-mers.
BLAST cerca quindi di estendere
l’allineamento in entrambe le direzioni,
ottenendo dei segmenti HSP di
allineamento locale non ulteriormente
estensibili.
LE VERSIONI DI BLAST
Esistono differenti versioni di
BLAST a seconda della natura della sequenza
query e del database.
BLASTN:
query nucleotidi, database nucleotidi
BLASTP: query aminoacidi, database aminoacidi
BLASTX: query nucleotidi (tradotta nei 6 possibili frame), database aminoac
TBLASTN: query aminoacidi, database nucleotidi (tradotto nei 6 frame)
TBLASTX: query nucleotidi (tradotta), database nucleotidi (tradotto)
tblastn
A
A
tblastx
N
QUERY
blastp
A
blastx
N
CONFRONTO A
LIVELLO?
blastn
N
DATABASE
SERVER WEB BLAST
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/
(cercare NCBI BLAST)
TUTORIAL BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html
BLASTP
sequenza query
database
mascheramento
repeat
matrice
BLASTP
BLASTP
visualizzazione
grafica degli
allineamenti
colori
BLASTP
ALTRI BLAST
PSI-BLAST
usa
una ricerca iterativa. Le sequenze trovate in ogni ciclo sono usate per
costruire un modello di sequenza da cercare nel ciclo successivo. In questo modo si
trovano sequenze simili a quelle simili trovate in un solo passo!
secondo ciclo di BLAST
sequenza query
sequenze simili alla query
(primo ciclo di BLAST)
BLAST2SEQUENCE
Effettua il
BLAST tra due sequenze
questa sequenza potrebbe
essere particolarmente
interessante ma non l’avrei
trovata con un semplice BLAST
ESEMPIO BLAST2SEQUENCE
Proviamo
ad allineare con il BLAST2SEQUENCE le solite due sequenze
nucleotidiche
ESEMPIO BLAST2SEQUENCE
Vengono trovati due
allineamenti locali