Transcript Biologia_Computazionale_lezione4

RICERCA DI SIMILARITA’ IN BANCHE DATI
• Una sequenza “da sola” non e’ informativa, è utile poterla confontare alle
sequenze note nei database perche’ possano essere formulate delle ipotesi
sulla sue relazioni evolutive con sequenze simili o sulla sua funzione.
• Metodi di ricerca di similarità in banca dati: programmi che permettono di fare
lo “screening” di una banca dati usando una sequenza “sonda”/”esca” (detta
query) come input ( le sequenze nel DB sono chiamate subject)
• Devono essere veloci, selettivi e sensibili
• Si basano su metodi euristici
• Utilizzano allineamenti locali per confrontare
le sequenze
Algoritmo “Euristico” = in matematica e informatica un particolare tipo di
algoritmo la cui soluzione non è la soluzione ottima per quel dato problema ma
una soluzione approssimativamente molto vicina a quella ottima con tempi di
calcolo ragionevoli.
Se due sequenze hanno una identità > 30%:
• Sono strutturalmente e di solito anche funzionalmente simili
•Hanno un antenato in comune
Se due sequenze hanno una identità 15 < X < 30 %:
• Hanno un ripiegamento globale simile
• Siamo nella “twilight zone”
• Se esiste una vera relazione di solito si trovano “icebergs” (regioni di similarità
locali)
Ricerche di similarità in banche dati
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
• 1STEP: Divisione della sequenza in parole di x caratteri (default
x=3)
Esempio se x=2 PAROLE POSSIBILI:
AC, CD, DD, DE, EF, FG, GS, SA, AT, TR, RM, MA, AS, ST, RK
2 STEP: generazione di una lista di parole “affini” (W-mers) simili alle parole della
query usando i punteggi di similarità una matrice di sostituzione selezionata
dall’utente
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
2. Sono considerati tutti i W-mers (parole
affini) che superano una soglia fissata
T quando allineati con parole della
QUERY
3. Vengono esaminate tutte le sequenze
subject, per cercare la presenza di tutti
i W-mers dell’elenco. Ogni
corrispondenza trovata (hit) viene
considerata come parte di un
allineamento più esteso. Si considera
la possibilità di estendere ogni hit in
ambo le direzioni. Si ottiene un
segmento di allineamento locale detto
HSP (high scoring segment pair). Si
estendono i match cercando regioni di
alta similarità fintanto che lo score è
sopra un secondo valore di soglia S,
fermandosi quando lo score non può
più essere migliorato (lo score finale è
chiamato opt)
Valutazione significatività dei match identificati
Quanto il match (query vs seq x del DB) identificato dagli allineamenti locali di BLAST è
significativo?
Tanto più il loro allineamento è diverso da uno generato casualmente tra sequenze di
lunghezza paragonabile
Sequenze che danno un allineamento casuale:
–Sequenze non omologhe
–Sequenze rimescolate(“shuffled”)
–Sequenze generate casualmente
–Sequenze a bassa complessità (con regioni ricche di amminoacidi dello stesso tipo
altamente ripetuti)
N.B. Blast permette di mascherare le regioni di sequenza a bassa complessitè
Valutazione significatività dei match identificati
a) Generazione di un ampio numero di sequenze casuali con la stessa composizione
della query (sequenze shuffled)
b) Ripetizione della ricerca di similarita’su sottoinsiemi casuali delDB utilizzando
come query ciascuna delle seq. casuali
c) Calcolo dei punteggi di allineamento corrispondenti (opt)
DISTRIBUZIONE DEI PUNTEGGI
CASUALI
Due sequenze possono essere considerate
omologhe se il punteggio per il loro
allineamento ottimale (opt) cade fuori dalla
distribuzione dei punteggi ottenuti per caso
Score
significativi
E-value e Z-score
Z-score esprime il numero di deviazioni standard che separano il punteggio (opt) della
query della media dei punteggi casuali
Z-score >= 4
Z-score= (optquery–Mcasuale) / σcasuale
E-value= expectation value, numero atteso di sequenze che danno per caso il
punteggio opt
Indica quanto e’ probabile che si trovi il punteggio S per caso in una distribuzione di
Poisson con valore medio Mcasuale
NB IN BLAST il punteggio OPT puo’ essere convertito in scala logaritmica al punteggio
cosidetto BIT
Indicazioni: opt/bit elevati, Z-score >=4, Evalue prossimo a 0
E-value e Z-score
Z-score esprime il numero di deviazioni standard che separano il punteggio (opt) della
query della media dei punteggi casuali
Z-score >= 4
Z-score= (optquery–Mcasuale) / σcasuale
E-value= expectation value, numero atteso di sequenze che danno per caso il
punteggio opt
Indica quanto e’ probabile che si trovi il punteggio S per caso in una distribuzione di
Poisson con valore medio Mcasuale
NB IN BLAST il punteggio OPT puo’ essere convertito in scala logaritmica al
punteggio cosidetto BIT
BLAST
blastp cerca in database di sequenze proteiche usando come query sequenze
proteiche
blastn cerca in un database di sequenze nucleotidiche usando come query sequenze
nucleotidiche
blastx cerca in un database di sequenze proteiche partendo da una sequenza query
nucleotidica che viene tradotta in tutti i frame
tblastn cerca in un database di sequenze nucleotidiche partendo da una sequenza
query proteica – le seq subject del database sono tradotte in sequenze proteiche in
tutti i frame
PSI-Blast ricerca iterativa con PSI-Blast usando ad ogni iterazione una sequenza
consenso derivata dall’allineamento tra la seq query le le subject dell’interazione
precedente
Strategie per la ricerca di similarità di proteine
1. Utilizzare una matrice tipo BLOSUM62 o PAM120 e la penalità per i
gap di default
2. Se non si trovano risultati significativi utilizzare BLOSUM30 o
PAM250 e una penalità più bassa per i gap
3. Prendere in considerazione i risultati con un grado di significatività
tra EXP 0.05 e 10.
4. Utilizzare PSI-BLAST per la ricerca di famiglie di proteine
Ricerca di pattern e motivi funzionali
Uno dei primi scopi della biologia computazionale consiste nel rispondere alla
domanda: data una nuova sequenza, cosa si può dire sulla funzione (o funzioni)
in essa codificata?
Se la ricerca per similarità non fornisce risposte, o se occorrono ulteriori
informazioni, si devono usare altri strumenti: la ricerca di pattern e motivi
funzionali
La pattern recognition è un’area di ricerca dell’informatica e della fisica applicata
con ricadute in campi quali l’intelligenza artificiale, la linguistica computazionale,
le scienze cognitive, la statistica matematica, ecc.
Studia l’organizzazione e il disegno di sistemi che riconoscano motivi e regolarità
nei dati a disposizione
14
Un motivo (pattern) è un insieme di caratteri (nucleotidi o aminoacidi), non
necessariamente contigui, associati spesso ad una precisa struttura o funzione
La loro esistenza dipende dal fatto che l’evoluzione ha prodotto pochi modi per
realizzare una determinata funzione
I motivi possono essere codificati in:
Le espressioni regolari sono formule che
si possono usare per definire pattern
testuali utilizzando le lettere
dell’alfabeto e meta-caratteri
<$+*[{( )?.
ai quali è associata una determinata
funzione
Espressioni regolari – motivi di tipo deterministico
Forme più complesse (allineamenti, profili, HMM, matrici,
consensus)
Motivo ideale  può essere sempre ed univocamente associato ad una precisa
struttura o funzione
Motivo reale  si trova in sequenze che non presentano la funzione (falsi positivi) o
è assente in sequenze funzionalmente correlate al motivo (falsi negativi)
BANCHE DATI DI MOTIVI
• All’interno di un singolo motivo l’informazione
può essere ridotta a una SEQUENZA CONSENSO
che non deve essere necessariamente stringente:
PATTERN;
• Se ci si riferisce a un gruppo di motivi conservati
non contigui nella sequenza: FINGERPRINT
oppure BLOCCHI;
• Se invece non si identificano regioni locali di
similarità tra proteine di una stessa famiglia ma
l’informazione viene dal considerare la similarità
lungo l’intero allineamento si ha un PROFILO
MOTIVI…E MOTIVI
PATTERN
FINGERPRINT O
BLOCCHI
XXXXhhhhXXXbbxxaaxxNGG(X)5-8SWXX…
PROFILO : possibilità
di ricavare una
sequenza consenso
per tutto
l’allineamento
Ricerca di pattern e motivi funzionali in sequenze
proteiche
Dallo studio di allineamenti multipli di sequenze appartenenti ad una stessa
famiglia di proteine, appare evidente che alcune regioni sono più conservate 
regioni importanti per la funzione o la struttura
Le regioni più conservate sono in genere quelle più importanti per la funzione
Dalle regioni costanti e variabili di un multi-allineamento di proteine
omologhe derivare un pattern che serva a distinguerle, cioè si può
identificare un motivo che possa servire alla caratterizzazione funzionale delle
proteine che lo contengono.
Esistono diversi programmi per l’individuazione di motivi:
PROSITE
BLOCKS, PRINTS (fingerprint= insieme di piu’ motivi)
E di domini:
PFAM, SMART
Le proteine ed i domini proteici che appartengono ad una particolare
famiglia generalmente condividono attributi funzionali e derivano da un
“antenato” comune.
Dallo studio di sequenze risulta evidente che alcune regioni si conservano
meglio di altre nel corso dell’evoluzione. Queste regioni in genere sono
importanti per il mantenimento della struttura tridimensionale o per la
funzione di una proteina.
Analizzando le proprietà che vengono mantenute costanti e quelle che
invece variano è possibile ottenere una “signature” per ogni famiglia
proteica o dominio che consente di distinguere i suoi membri dalle altre
proteine non correlate.
19
BANCHE DATI DI MOTIVI
• All’interno di un singolo motivo l’informazione
può essere ridotta a una SEQUENZA CONSENSO
che non deve essere necessariamente stringente:
PATTERN PROSITE
• Se ci si riferisce a un gruppo di motivi conservati
non contigui nella sequenza: FINGERPRINT
oppure BLOCCHI BLOCKS
PRINTS
• Se invece non si identificano regioni locali di
similarità tra proteine di una stessa famiglia ma
l’informazione viene dal considerare la similarità
lungo l’intero allineamento si ha un PROFILO
Prosite Pfam
MOTIVI…E MOTIVI
PATTERN
FINGERPRINT O
BLOCCHI
XXXXhhhhXXXbbxxaaxxNGG(X)5-8SWXX…
PROFILO : possibilità
di ricavare una
sequenza consenso
per tutto
l’allineamento
PROSITE
Database
of
protein
families and domains
PROSITE è un database di famiglie proteiche (motivi associati a funzione)
Consiste di siti, pattern e profili che aiutano ad identificare a quale famiglia di
proteine note (se esiste) appartenga una nuova sequenza.
Questo database si basa sull’osservazione che, nonostante esista un numero
considerevole di proteine, la maggior parte di esse possono essere raggruppate in un
numero limitato di famiglie a seconda del livello di similarità tra le sequenze.
I motivi possono essere codificati in due modi:
1. Pattern – riconducibili ad espressioni regolari
2. Matrici (o profili) – riferiti a l’intera sequenza/domini
22
E’ un database di famiglie e domini proteici comprensiva di pattern e
motivi (signatures) che identificano e rendono riconoscibili e
classificabili le proteine
una signature
formattata,
definita anche pattern.
Es. phosphorylation
by CK2
[ST]-x(2)-[DE]
PROSITE contiene anche pattern
ad ALTA OCCORRENZA, corti e
aspecifici (modifiche posttraduzionali)
POTERE DIAGNOSTICO DEL PATTERN
•La sensibilità di un motivo è la misura della proporzione di
sequenze della famiglia selezionate dal motivo ed è data da:
•Sensibilità = VP/(VP + FN) se FN=0 sensibilità=1
Dove VP= veri positivi e FN=falsi negativi
•La selettività di un motivo misura la proporzione di
sequenze della famiglia sul totale delle sequenze selezionate
ed è data da:
Selettività= VP/(VP + FP) se FP=0 selettività=1
•Dove FP= falsi positivi
La specificità misura la proporzione di sequenze che
non fanno parte della famiglia, ma non vengono
selezionate dal motivo ed è data da:
Specificità = VN/(VN + FP)
Dove VN=veri negativi e FP=falsi positivi
• PROSITE: pattern funzionali – pattern relativi a corte seq con
alta probabilità di accadimento (modificazioni e non
funzioni) – profili – indicazioni su SPECIFICITA’ e
SENSIBILITA’ del pattern (POTERE DIAGNOSTICo);
• PRINTS: costruisce la signature di una famiglia – si
autoimplementa usando SwissProt partendo da un
allineamento seme – punteggi basati sulla freq di vedere un aa
in una posizione
• BLOCKS: parte dalle famiglie di Prosite – punteggi dati con
Blosum 62 – ogni blocco valutato sulla base di 2 punteggi:
livello a cui 99,5% sono negativi e forza della ricerca (devono
essere ben distinti e la forza maggiore del primo punteggio)
• Pfam: fornisce info più strutturali – entry: famiglie (in
comune più domini) oppure domini – ci sono poi repeats,
sequenze segnale, regioni transmembrana, regioni a bassa
complessità
Pfam è una raccolta di proteine allineate e di profili generati con gli HMM (Hidden
Markov Models) che descrivono quasi tutte le famiglie e i domini proteici
conosciuti. Permette di ottenere informazioni strutturali e la composizione in domini
di una sequenza
Profilo= rappresentazione numerica dell’allineamento che
valuta:
a) Quali residui sono presenti in ogni posizione e con quale frequenza.
b) Presenza di residui assolutamente conservati.
c) Presenza di eventuali gap.
Dagli allineamenti multipli si possono costruire delle positionspecific scoring tables (PSST), che riflettono la probabilità di
trovare un certo aminoacido in ogni posizione.
METODO DEI PROFILI
• ALLINEAMENTO MULTIPLO di seq
OMOLOGHE: vedo come seq libera di variare nel
corso dell’evoluzione;
• Metodo dei profili permette analisi della
VARIABILITA’ dei residui in una certa posizione
per una certa famiglia
• Costruzione di MATRICI POSIZIONEDIPENDENTI
• Un profilo è una matrice nX20 dove n è la posizione
nell’allin.multiplo
I programmi che partendo da un
allineamento multiplo generano i
profili riportano la sequenza
consenso derivante dagli
allineamenti - la sequenza
consenso mi da’ informazioni sui
residui piu’ frequenti in quelle
posizioni dell’allineamento
Il profilo può essere utilizzato per una ricerca in
banca dati mediante la variante di Blast PSIBLAST.
Il programma effettua, data una sequenza
query, una serie di iterazioni in cui ogni volta
l’utente sceglie un certo numero di sequenze
individuate e su queste viene ricostruito il
profilo.
Ad ogni iterazione successiva verranno
individuate nuove sequenze, in modo più o
meno accurato a seconda delle scelte fatte in
precedenza.