Transcript LAB_MOD_BIO_MOL

gruppi di amminoacidi in base alle catene laterali
STRUTTURE TERZIARIE (singola catena polipeptidica)
Proteine multi-dominio
Un unico dominio strutturale
STRUTTURE QUATERNARIE (associazioni di diverse catene polipeptidiche)
Banche dati di sequenze proteiche
UniProt raccoglie le informazioni dei database Swiss-prot e
TrEMBL . Viene curato anche un database NON RIDONDANTE
(UniRef).
Molto curato e dettagliato, con
annotazioni circa funzione,
struttura, modificazioni e altre
informazioni utili
E’ la traduzione in silico di ogni entry
codificante del database nucleotidico
dell’EMBL, non è accurato, ma è ricchissimo
Fast-A FORMAT
>tr|P73799 Slr1259 protein - Synechocystis sp. (strain PCC
6803).
MLFRQLFDPETSTYTYVIADPKGRSAALVDSVLEQVDRDLNLLKELDLKLTFCLETHV
HADHITGAGKLRQLTGCQNLVPQYAEVDCADRHLQDGEIVHVGSIPIQAIATPGHTDS
HLAFLVNQTHVLTGDALLIRGCGRTDFQSGDAGTLYDAIHGKLFTLPEDVFVYPGHDY
RGHTVSTIGEEKRFNPRLLGRDRQNFIEFMDSLNLPDPKKIMEAVPANQLCGQRTVAV
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ALLINEAMENTO DI SEQUENZE
A COPPIE
AGTTTGAATGTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC
||||||||||||||||||| |||||||| ||| | |||||| |||||||||||||||||
AGTTTGAATGTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC
MULTIPLO
KFKHHLKEHLRIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl
KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKTKFKHHLKEHVRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl
KFKHHLKEHIRIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV---------------KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTs
Allineamento GLOBALE o LOCALE
GLOBALE
considera la similarita’ tra due sequenze in tutta
la loro lunghezza (da N- a C-terminale)
LOCALE
considera solo specifiche REGIONI simili tra
alcune parti delle sequenze in analisi (solo regioni a ↑ densità di
similarità generando più sub-allineamenti)
Global alignment
LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK
||. | | | .|
.| || || | ||
TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG
Local alignment
LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK
||||||||.||||
TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHK
ALLINEAMENTO DI SEQUENZA
• PER ESEGUIRE UN ALLINEAMENTO DI SEQUENZA SONO
NECESSARI ESSENZIALMENTE 3 STRUMENTI:
-
Avere a disposizione una MATRICE DI SOSTITUZIONE. La matrice definisce la
il GRADO di SIMILARITA’ tra amminoacidi;
-
Avere a disposizione un ALGORITMO DI ALLINEAMENTO cercando di
massimizzare il punteggio dato dalla matrice e valutando quanti gap
(interruzioni) inserire;
-
Avere a disposizione per evitare allineamenti senza senso una PENALITA’
per l’introduzione dei GAP.
I GAP riflettono inserzioni/delezioni
avvenute durante l’evoluzione
LLTTVRNN
LLTTVRNN
LLVRNN
LL--VRNN
Similarità e distanza
Esistono due modi per misurare il grado di omologia tra due
sequenze:
1. Calcolare la similarità contando i match
2. Calcolare la distanza contando mismatch e indels
Similarità elevata ↔ bassa distanza
Due sequenze identiche hanno una distanza pari a zero
SIMILARITA’ DI SEQUENZA
• Nel punteggio di similarità di sequenza si tiene conto del fatto
che gli amminoacidi a confronto in ogni posizione siano simili,
differenti o identici e di una penalità per i gap.
2 penalità per i gap
(apertura (fisso),
estensione (lunghezza
dipendente))
L
NG
i 1
k i
S ab   s(ai , bi )   (   l (k )  1)
• PER DEFINIRE LA SIMILARITA’ TRA LE DUE SEQUENZE SI USANO
MATRICI BASATE SU PRESUPPOSTI DIVERSI:
-
identità/non identità;
Caratteristiche chimico-fisiche degli aa;
Basate sul codice genetico: valutare quante mutazioni fare in una tripletta per
passare da un aa a un altro. (se ad es. si cambia un solo nucleotide la sostituzione la
sostituzione sarà meno penalizzata perché si tratta di evento probabile nel corso dell’evoluzione)
-
Basate su criteri evolutivi estrapolati da confronto di sequenze di proteine
omologhe (MATRICI BLOSUM E PAM)
Quale matrice PAM conviene utilizzare?
• In generale per due sequenze filogeneticamente vicine è
meglio utilizzare una matrice PAM a basso indice e viceversa
• In assenza di informazioni si utilizzano PAM40, PAM120 e PAM
250
•
•
•
•
PAM250 individua similarità del 20%
PAM120 individua similarità del 40%
PAM80 individua similarità del 50%
PAM60 individua similarità del 60%
13 aprile 2015
12
L’utilizzo della matrice di similarita’ appropriata per ciascuna analisi
e’ cruciale per avere buoni risultati.
Infatti relazioni importanti da un punto di vista biologico possono
essere indicate da anche molto debole similarità.
Sequenze
poco divergenti

molto
divergenti
BLOSUM80
PAM1
BLOSUM62
PAM120
BLOSUM45
PAM250
ALLINEAMENTI MULTIPLI
L’allineamento multiplo è un’ipotesi di omologia posizionale tra basi o
aminoacidi
Tutti i residui presenti nella stessa colonna di un multi-allineamento sono
evolutivamente correlati
No applicabili algoritmi di allineamento globale esatto (cresce esponenzialmente
con il numero di sequenze da allineare)
Teoricamente sarebbe possibile applicare l’algoritmo di allineamento globale, ma
in pratica non lo è perché richiede tempi di esecuzione troppo lunghi
METODI APPROSSIMATI
Es. ALLINEAMENTO PROGRESSIVO (implementato in Clustal W)
ALLINEAMENTO PROGRESSIVO
• Basato su costruzione di una successione di allineamenti a coppie
• Dato un insieme S costituito da n sequenze da allineare, si scelgono due
sequenze s1 e s2 e si allineano; questo allineamento resta fissato nei passi
successivi
• Si sceglie una terza sequenza s3 e si allinea al precedente allineamento, e così
via
• Prevedono che coppie di sequenze che presentano un maggior grado di
similarità tra loro siano allineate per prime (giustificato dal fatto che coppie di seq +
simili avranno maggiore probabilità di essere derivate + recentemente da un antenato
comune e il loro allineamento fornisce informazioni più affidabili - le posizioni dei gap in
seq maggiormente correlate sono tipicamente + accurate rispetto a quelle relative a seq
meno simili, per cui i gap degli allineamenti iniziali vanno preservati durante
l’allineamento progressivo)
ClustalW
• Otterremo un albero i cui rami hanno lunghezza proporzionale
alla distanza tra le sequenze:
A
B
D
C
• Quest’albero verrà utilizzato per guidare l’allineamento
progressivo.
• Nel nostro esempio verranno allineate per prime le sequenze
A e B. Successivamente verrà allineata la sequenza D
all’allineamento AB e infine verrà allineata la sequenza C
all’allineamento ABD.
Allineamento con ClustalW



La presenza di un
simbolo * in fondo
ad una colonna
indica un match del
100%.
Il simbolo : indica
un’alta similarità
(>75%).
Il simbolo . indica
una media
similarità (50%75%).
INPUT
CLUSTALW
Sito EBI
FORMATO
RICHIESTO:
FastA
OUTPUT
CLUSTALW
Sito EBI
Tabella riassuntiva con
link a: file di OUTPUT
(con le indicazioni sulla
costruzione dei gruppi) allineamento
File di output
Elenco seq – attribuzione di
un numero a ogni seq
Confronti a coppie
Formazione gruppi
•Quando le sequenze da allineare non sono molto divergenti
(similarita’ >45% per le proteine) ClustalW dà una risposta ottimale
•In caso contrario sono necessari aggiustamenti (correzione manuale
dell’allineamento)
• Una volta che 2 o + seq siano state allineate in un blocco, questo
allineamento è fissato e non può più essere modificato nelle fasi
successive dell’allineamento progressivo.
• Problemi di minimo locale: se in una qualunque fase viene
introdotto un errore si propagherà sulle fasi successive
• Affidabilità del multiallineamento dipende danche dal set di seq
considerate – es. Se si include una seq non realmente omologa
allineamento prodotto risulta alterato da inserzione molti gap
addizionali (controllo seq input per rimuovere quelle “spurie”)
RICERCA DI SIMILARITA’ IN BANCHE DATI
• Una sequenza “da sola” non e’ informativa, è utile poterla confontare alle
sequenze note nei database perche’ possano essere formulate delle ipotesi
sulla sue relazioni evolutive con sequenze simili o sulla sua funzione.
• Metodi di ricerca di similarità in banca dati: programmi che permettono di fare
lo “screening” di una banca dati usando una sequenza “sonda”/”esca” (detta
query) come input ( le sequenze nel DB sono chiamate subject)
• Devono essere veloci, selettivi e sensibili
• Si basano su metodi euristici
• Utilizzano allineamenti locali per confrontare
le sequenze
Algoritmo “Euristico” = in matematica e informatica un particolare tipo di
algoritmo la cui soluzione non è la soluzione ottima per quel dato problema ma
una soluzione approssimativamente molto vicina a quella ottima con tempi di
calcolo ragionevoli.
Ricerche di similarità in banche dati
Valutazione significatività dei match identificati
Quanto il match (query vs seq x del DB) identificato dagli allineamenti locali di BLAST è
significativo?
Tanto più il loro allineamento è diverso da uno generato casualmente tra sequenze di
lunghezza paragonabile
Sequenze che danno un allineamento casuale:
–Sequenze rimescolate(“shuffled”)
–Sequenze generate casualmente
N.B. Blast permette di mascherare le regioni di sequenza a bassa complessitè
E-value
E-value= expectation value, numero atteso di sequenze che danno per caso il
punteggio opt
Indica quanto e’ probabile che si trovi il punteggio S per caso in una distribuzione di
Poisson con valore medio Mcasuale
NB IN BLAST il punteggio OPT puo’ essere convertito in scala logaritmica al punteggio
cosidetto BIT
Indicazioni: opt/bit elevati, Evalue prossimo a 0
BLAST
blastp cerca in database di sequenze proteiche usando come query sequenze
proteiche
blastn cerca in un database di sequenze nucleotidiche usando come query sequenze
nucleotidiche
blastx cerca in un database di sequenze proteiche partendo da una sequenza query
nucleotidica che viene tradotta in tutti i frame
tblastn cerca in un database di sequenze nucleotidiche partendo da una sequenza
query proteica – le seq subject del database sono tradotte in sequenze proteiche in
tutti i frame
PSI-Blast ricerca iterativa con PSI-Blast usando ad ogni iterazione una sequenza
consenso derivata dall’allineamento tra la seq query le le subject dell’interazione
precedente
Le proteine ed i domini proteici che appartengono ad una particolare
famiglia generalmente condividono attributi funzionali e derivano da un
“antenato” comune.
Dallo studio di sequenze risulta evidente che alcune regioni si conservano
meglio di altre nel corso dell’evoluzione. Queste regioni in genere sono
importanti per il mantenimento della struttura tridimensionale o per la
funzione di una proteina.
Analizzando le proprietà che vengono mantenute costanti e quelle che
invece variano è possibile ottenere una “signature” per ogni famiglia
proteica o dominio che consente di distinguere i suoi membri dalle altre
proteine non correlate.
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Ricerca di pattern e motivi funzionali
Uno dei primi scopi della biologia computazionale consiste nel rispondere alla
domanda: data una nuova sequenza, cosa si può dire sulla funzione (o funzioni)
in essa codificata?
Se la ricerca per similarità non fornisce risposte si devono usare altri strumenti: la
ricerca di pattern e motivi funzionali
La pattern recognition è un’area di ricerca dell’informatica e della fisica applicata
con ricadute in campi quali l’intelligenza artificiale, la linguistica computazionale,
le scienze cognitive, la statistica matematica, ecc.
Studia l’organizzazione e il disegno di sistemi che riconoscano motivi e regolarità
nei dati a disposizione
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Un motivo (pattern) è un insieme di caratteri (nucleotidi o aminoacidi), non
necessariamente contigui, associati spesso ad una precisa struttura o funzione
La loro esistenza dipende dal fatto che l’evoluzione ha prodotto pochi modi per
realizzare una determinata funzione
Motivo ideale  può essere sempre ed univocamente associato ad una precisa
struttura o funzione
Motivo reale  si trova in sequenze che non presentano la funzione (falsi positivi) o
è assente in sequenze funzionalmente correlate al motivo (falsi negativi)
I motivi possono essere codificati in diversi modi
BANCHE DATI DI MOTIVI
• All’interno di un singolo motivo l’informazione
può essere ridotta a una SEQUENZA CONSENSO
che non deve essere necessariamente stringente:
PATTERN;
• Se ci si riferisce a un gruppo di motivi conservati
non contigui nella sequenza: FINGERPRINT
oppure BLOCCHI;
• Se invece non si identificano regioni locali di
similarità tra proteine di una stessa famiglia ma
l’informazione viene dal considerare la similarità
lungo l’intero allineamento si ha un PROFILO
MOTIVI…E MOTIVI
PATTERN
FINGERPRINT O
BLOCCHI
XXXXhhhhXXXbbxxaaxxNGG(X)5-8SWXX…
PROFILO : possibilità
di ricavare una
sequenza consenso
per tutto
l’allineamento
Ricerca di pattern e motivi funzionali in sequenze
proteiche
Dallo studio di allineamenti multipli di sequenze appartenenti ad una stessa
famiglia di proteine, appare evidente che alcune regioni sono più conservate 
regioni importanti per la funzione o la struttura
Le regioni più conservate sono in genere quelle più importanti per la funzione
Dalle regioni costanti e variabili di un multi-allineamento di proteine
omologhe derivare un pattern che serva a distinguerle, cioè si può
identificare un motivo che possa servire alla caratterizzazione funzionale delle
proteine che lo contengono.
Esistono diversi programmi per l’individuazione di motivi:
PROSITE (patterns, profili e patterns a alta probabilita’ di
accadimento) classificazione funzionale della proteina e
predizione putative modifiche post-traduzionali
PFAM (profili) classificazione di domini strutturali