Transcript Modelo de transmisión de Borrelia burgdorferi por Rhipicephalus

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIAS
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CONSEJO VETERINARIO DE SALUD PÚBLICA DE MEXICALI
BORRELIOSIS CANINA
EN MEXICALI, BAJA CALIFORNIA
Luis Tinoco Gracia
INTRODUCCION
BORRELIOSIS (ENFERMEDAD DE LYME):
Enfermedad inflamatoria multisistémica
Transmitida por garrapatas
Zoonótica
Distribución mundial
ETIOLOGÍA:
Complejo Borrelia burgdorferi sensu lato.
Norteamérica:
Europa:
Asia:
B. burgdorferi sensu stricto
(Johnson, 1984).
B. afzelli y B. garinii (Berglund, 1995; Derdáková, 2003).
B. japonica
(Kawabata, 1993).
BANCO DE GENES
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Ciclo biológico de I. scapularis relacionado con B. burgdorferi
Transmisión de borrelias
al huésped por garrapata
adulta
Huevos
Larvas
Transmisión de borrelias
al huésped por ninfas
Reservorio
Otros vectores: I. pacificus, A. americanum, D. variabilis
BORRELIOSIS: Enfermedad inflamatoria multisistémica
Depresión, emaciación
Claudicación
Garrapatas
PREVALENCIA EN PERROS
Monterrey, Nuevo León:
16% (136/850) a B. burgdorferi por IFA
(Salinas-Meléndez et al., 1999)
Mexicali, B. C.:
6.6% (2/30) a B. burgdorferi por ELISA
(Romano et al., 1998)
8.2% (95% I.C. 1.5-13.3%) a B. burgdorferi por ELISA
(Tinoco et al., 2007)
59.6% (56/94) a garrapatas (100% Rhipicephalus sanguineus)
(Tinoco et al., 2008)
PREVALENCIA EN HUMANOS
Estados Unidos:
Actualmente: 180,000 (CDC)
República Mexicana:
Por ELISA y Western blot
Distrito Federal:
3.4%
Noreste de la Rep. Mexicana: 6.2%
(Gordillo et al., 2003)
Por PCR y Secuenciación (Flagelina y OspA)
Distrito Federal:
4 pacientes (Gordillo et al., 2007)
OBJETIVOS
1.
Estimar la prevalencia de B. burgdorferi por ELISA y PCR en perros
atendidos en clínicas veterinarias y en perros capturados por los centros
de control animal; y demostrar evidencia molecular en garrapatas por
PCR, en Mexicali, Baja California, México.
2.
Evaluar factores de riesgo asociados a B. burgdorferi en perros de la
zona urbana de Mexicali, Baja California.
3.
Demostrar la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de la
garrapata adulta R. sanguineus en perros.
MATERIAL Y MÉTODOS
FASES DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
1.
2.
3.
Monitoreo de B. burgdorferi.
Aislamiento de B. burgdorferi.
Estudio experimental de la transmisión de B. burgdorferi
por R. sanguineus.
1. MONITOREO
MARCO MUESTRAL DEL AREA DE ESTUDIO
Establecimientos:
a) 39 clínicas veterinarias de la ciudad de Mexicali
b) 2 centros de control animal de Mexicali
Sujetos:
i) 384 Perros atendidos en clínicas veterinarias
ii) 384 Perros capturados por los centros de control animal
iii) Garrapatas recolectadas de los animales muestreados
Muestreo sanguíneo y de garrapatas
a)
b)
c)
Perros atendidos en clínicas veterinarias
Perros capturados por los centros de control animal
Garrapatas conservadas en tubos de 10 ml con tapón
DIAGNÓSTICO
1. PERROS
Serología: Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc.
PCR:
Coágulo sanguíneo y líquido sinovial
2. GARRAPATAS
PCR:
Iniciadores:
Glándula salival e intestino
Fragmentos de genes codificantes de B. burgdorferi sensu lato
a) Flagelina (FLA):
256 pb
b) Proteína A de la superficie externa (OspA):
345 pb
SEROLOGÍA DE Borrelia burgdorferi
PUNTO DE CORTE
Densidad öptica
> 1.6
Sensibilidad
Especificidad
Punto de corte
=
95.8%
=
94.7%
= 0.300 DO (Densidad óptica)
1.0 – 1.5
Positivo
0.5 – 1.0
0.3 – 0.5
Corte
0.2 – 0.3
Negativo
0.1 – 0.2
<0.1
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
1. Tamaño de muestra:
n

Z
d
=
=
=
=
 Z
n   ( 1  )  
 d 
2
tamaño de muestra, resultando 384 por cada grupo de estudio.
estimador de varianza máxima 50 %
valor de tablas = 1.96
precisión = 5 %
(Scheafer et al., 1987)
2. Se estimó la prevalencia y su intervalo de confianza mediante el estimador
Rogan-Gladen (Greiner y Gardner, 2000).
3. Para evaluar la asociación de los factores de riesgo con la seropositividad a
B. burgdorferi se utilizaron la razón de probabilidades (Odds ratio,
OR) y X2 de Mantel-Haenszel.
4. Todos los análisis estadísticos utilizando el paquete SAS (Statistical Analysis
System) para Windows ver 8.2 (Walker, 1997; SAS, 2004).
RESULTADOS
Seroprevalencia ajustada de Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc.
Perros atendidos en clínicas veterinarias:
24/384
6.8% (95% CI 3.5-8.9)
Perros capturados por los centro de control animal: 42/384 12.0% (95% CI 7.5-14.3)
Ambos grupos:
66/768
9.3% (95% CI 6.3-10.6)
FACTORES DE RIESGO
Perros de las clínicas veterinarias
Parámetro
Edad
Falta de programa preventivo
X2
5.2724
7.8519
P
0.02
0.005
OR
(95% IC )
4.7
4.9
(1.1-20.6)
(1.4 -16.8)
FACTORES DE RIESGO
Perros de clínicas veterinarias y control animal
Parámetro
Edad
X2
P
OR
(95% IC )
6.6251
0.01
2.7
(1.2 - 6.1)
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 26 de septiembre de 2007
PCR de FLA en coágulos sanguíneos de perros seropositivos
1
2
21 22
3
4
5
6
23 24 25 26
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17
18 19 20
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
41 42 43 44 45 46 47 48 49
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 29 de septiembre de 2007
PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 30 de septiembre de 2007
PCR de OspA en tejidos, coágulos sanguíneos y
garrapatas de perros seropositivos
1
2
1. Marcador
2. C+ N40
3. 506
Coágulos sanguíneos Sero+
4. 2032 Coágulos sanguíneos Sero+
5. 675
Coágulos sanguíneos Sero+
6. 1312 Coágulos sanguíneos Sero+
7. 1272 M, sinovial
Sero+ FLA+
8. 1326 M, sinovial
Sero+ FLA+
9. ENS1 M, sinovial Sero+ FLA+
10. 39 CA M, sinovial Sero+ FLA+
11. 1165 Garrapatas
Sero+ FLA+
12. 1346 Garrapatas
Sero+ FLA+
13. C-
3
FLA+
FLA+
FLA+
FLA+
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Mexicali, B.C., 22 de octubre de 2007
PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos
M
1
2
3
4
5
6
7
P
N
M
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Mexicali, B.C., 19 de marzo de 2008
PCR de FLA en tejidos y garrapatas de perros seropositivos
M.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
P.
N.
M.
Marcador BioLadder 100
889 Coágulos sanguíneos
2063 Coágulos sanguíneos
1272 Coágulos sanguíneos
1368 Garrapatas
1368 Garrapatas
1368 Garrapatas
1368 Garrapatas
1272 Vejiga
1272 Vejiga
1272 Vejiga
1272 Vejiga
Positivo
Negativo
Marcador BioLadder 100
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 P N M
EVIDENCIA DE Borrelia burgdorferi - Secuenciación
Manhattan, Kansas, 17 de octubre de 2007
Perro #1312
Muestra: Coágulo sanguíneo
100% de identidad con OspA de Borrelia burgdorferi
TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA
CACTAGTATCaaaaaaaGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CACTAGTATCAAAAAAAGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG
AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA
CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG
AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC
||||||||||||||||||||||||||||
AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC
2. AISLAMIENTO
Medio de cultivo:
BSK-H® SIGMA
Fuente:
Vejiga, membrana y líquido sinovial.
Temperatura:
34°C
Comprobación de crecimiento:
Microscopia de campo obscuro
Criopreservación :
-20°C (CryoCare Bacterial Preservers® Key Scientific Products)
Secuenciación: 99% Borrelia burgdorferi sensu stricto
3. TRANSMISION EXPERIMENTAL
3 perros sanos de 8 meses de edad, de talla mediana, pelaje corto.
a) Grupo A: 2 perros expuestos a R. sanguineus con B. burgdorferi.
b) Grupo B: 1 perro expuesto a R. sanguineus no infectadas.
Incubación y desarrollo de R. sanguineus
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Recolección de hembras adultas repletas recién alimentadas.
Preovoposición:
4 d.
Ovoposición:
5 d.
Incubación de huevos:
11 d.
Ayuno:
3 d.
Colocación de larvas en perros:
3 d.
Muda de larvas a ninfas:
7 d.
Ayuno:
3 d.
Colocación de ninfas en perros:
4 d.
Muda de ninfas a adultas:
11 d.
Ayuno:
2 d.
Inoculación de borrelias en hembras adultas:
1 d.
Colocación de garrapatas adultas en perros:
7 d.
Total del ciclo:
61 d.
Incubación: 30°C con 80% de humedad.
HUEVOS
LARVAS
NINFAS
ADULTAS
Inoculación de B. burgdorferi en R. sanguineus
5 hembras adultas inoculadas/perro.
El inóculo fue por capilaridad con medio BSK-H y Borrelia burgdorferi.
Concentración: 1×108 espiroquetas/ml de BSK-H.
En cámara húmedad a 34°C durante 24 horas.
Exposición experimental en perros a R. sanguineus
infectadas con B. burgdorferi
Colocación de 5 machos y 5 hembras adultas/perro.
Duración: 7 días.
Perra 1: Se colectó sólo una hembra viva y los 5 machos vivos.
Perra 2: Se colectaron vivos sólo los 5 machos, las 5 hembras murieron.
Perro 3 (control): Se colectaron vivos las 5 hembras y los 5 machos.
No hubo evidencia serológica, ni molecular, de B burgdorferi en ningún perro.
CONCLUSIONES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Seroprevalencia de 6.8% (95% IC 3.5-8.9%) a B. burgdorferi en
perros atendidos en clínicas veterinarias de Mexicali.
Seroprevalencia de 12% (95% IC 7.5-14.3%) en perros capturados
por los centros de control animal de Mexicali.
Perros ≥ 1 año de edad: OR= 2.7 (95% IC 1.2-6.1).
Perros que no tuvieron acceso a un programa preventivo: OR= 4.9
(95% IC 1.4-16.8).
Evidencias serológicas y moleculares confirman la existencia de B.
burgdorferi en perros y garrapatas en Mexicali, donde sólo se han
registrado R. sanguineus.
Aún no se ha demostrado la transmisión de B. burgdorferi por
garrapatas R. sanguineus en perros. Se utilizó el protocolo para
Ixodes scapularis. Falta probar otros protocolos.
GRACIAS