Transcript fattori di crescita

ONCOGENI
I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi:
1.Fattori di trascrizione
2.Rimodellatori della cromatina
3.Fattori di crescita
4.Recettori dei fattori di crescita
5.Trasduttri del segnale
6.Regolatori dell’apoptosi
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FATTORI DI TRASCRIZIONE
I fattori di trascrizione (TF) sono spesso membri
di una famiglia multigenica che mostra dei
domini strutturali comuni e molti di questi fattori
per funzionare richiedono l’interazione con altre
proteine. Il TF regolano positivamente o
negativamente l’espressione di determinati geni,
legandosi a specifiche sequenze di DNA
(promoter, enhancer, silencer). Esempi di TF,
codificati anche da retrovirus sono c-myc, fos e jun.
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• c-myc
Il gene myc è conservato in tutte le specie animali e fu
inizialmente scoperto in diversi retrovirus responsabili
nell’induzione di sarcomi, carcinomi e leucemie mieloidi.
La proteina codificata da myc è un fattore trascrizionale
(p64myc) presente nelle cellule in attiva proliferazione
anche se myc svolge un ruolo importante anche
nell’indurre l’apoptosi. Myc è classificato tra i gene della
pronta risposta insieme a fos e jun, indotti da fattori di
crescita mitogenici, con il ruolo di indurre la progressione
dalla fase G0-G1 alla fase S del ciclo cellulare.
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• Myc e ciclo cellulare:
• cicline D, E e A
• geni che codificano per le CDK2 e CDK4
• gene dell’enzima ornitina-decarbossilasi (ODC), essenziale nel
metabolismo degli acidi nucleici
• reprime i geni delle CDKI (inibitori delle CDK)
• attiva i geni che codificano per E2F
• reprime il gene dell’inibitore delle CDK (p27KIP1).
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I LIVELLI ECCESSIVI DI MYC POSSONO INDURRE LA CELLULA
AD ATTIVARE IL PROCESSO DI APOPTOSI.
fos e jun
Il fattore di trascrizione fos (p55) dimerizza con il fattore di
trascrizione jun (p39) per formare il fattore di
trascrizione AP-1, il quale aumenta l’espressione di
diversi geni che controllano la divisione cellulare.
L’attività di AP-1 è indotta da fattori di crescita,
citochine, ormoni polipetidici, neurotrasmettitori,
interazione cellula-matrice, infezioni virali e batteriche e
da diversi stress fisici e chimici.
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AP-1 è un dimero composto da proteine della famiglia Jun (c-jun, JunB,
JunD),
Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2).
Riconosce sequenze del DNA TGAG/CTCA o CRE (TGACGTCA)
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AP-1 attivazione trascrizionale
Stimoli attivano la cascata delle MAPK
(mitogen activated protein kinase) che
inducono l’attività di AP-1 attraverso la
fosforilazione delle chinasi ERK
(extracellular-signal-regulated kinase), le
quali traslocano nel nucleo e fosforilano
fattori di trascrizione che attivano fos
che si lega al fattore
AP-1
jun, formando AP-1.
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FATTORI DI CRESCITA
I fattori di crescita (GF) sono proteine di piccole dimensioni che stimolano la
proliferazione, il differenziamento, la sopravvivenza e la motilità cellulare. La
maggior parte dei GF hanno effetto positivo su questi fenomeni, anche se alcuni
come il TGF-b (trasforming growth factor beta) agiscono come segnale inibitorio.
Nell ’ ambito delle patologie tumorali molti geni che codifica per GF, si
comportano da oncogeni, in quanto subiscono mutazioni tali da indurre la
cellula ad una sovra-produzione del GF con conseguente attivazione di uno
stimolo proliferativo autocrino o paracrino.
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WNT SIGNALING
Attivazione della trascrizione di geni bersaglio che inducono proliferazione
cellulare e disassociazione delle E-caderine con conseguente perdita dei legami
cellula/cellula e stimolo della mobilità cellulare.
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Insulin Growth Factor (IGF)
Fra i vari fattori di crescita che giocano un ruolo determinante nei vari processi che
inducono proliferazione cellulare, sopravvivenza cellulare e resistenza ai
chemioterapici e radioterapia c’è il sistema IGF (insulin growth factor). Il sistema
IGF consiste di due ligandi, IGF-I e IGF-II, tre recettori di membrana (IGF-IR, IGFIIR) e recettore dell’insulina (IR) e sei proteine di legame ad alta affinità (IGFBP 16). I recettori IGF-IR una volta tradotti vengono glicosilati, dimerizzano e processati
in due subunità a e b che attraverso ponti disolfuro vanno a formare il tetramero
funzionante (b-a-a-b) che viene trasportato in membrana. Attraverso la
subunità a che è extracellulare si ha il legame del IGF, con conseguente
trasduzione del segnale a livello intracellulare che consiste nella fosforilazione di
residui di tirosina in domini di tirosin chinasi.
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La cascata di attivazione comporta, principalmente, tre tipi si segnali:
1.attivazione del pathways del fosfatidilinositolo 3- chinasi (PI-3K), Akt, mTOR che
attiva la sintesi proteica e i meccanismi antiapoptotici mediante inattivazione
(fosforilazione) di Bad
2.attivazione del pathway di Ras/Raf1/MEK/ERK che induce proliferazione
cellulare
3.attivazione di altri meccanismi cellulari che inducono l’espressione di fattori di
crescita, citochine e integrine
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Inoltre il IGF-IR svolge un ruolo nel facilitare :
1.il passaggio dalle fase G0 a G1 mediante attivazione della p70 S6K,
che fosforila la proteina ribosomiale S6 che stimola l’insieme di proteine
ribosomiali necessarie a entrare nel ciclo cellulare.
2.Inoltre promuove anche il passaggio dalla fase G1 a S mediante
l’induzione dell’espressione della ciclina D1 e della CDK4, comportando
fosforilazione del fattore Rb.
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RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA
L ’ eccessiva stimolazione della proliferazione cellulare, nei tumori, dipende anche
dall’amplificazione o dalle mutazioni dei geni codificanti per i recettori dei fattori di
crescita, con conseguente aumento dell’espressione dei recettori o la sintesi di recettori
strutturalmente e funzionalmente modificati, con conseguente alterazione del segnale e
guadagno di funzione.
Tali recettori possono essere suddivisi in base ai residui presenti nella regione
citoplasmatica in: tirosinchinasici e serin/treoninchinasici
Nell’ambito dei tumori, i recettori tirosinchinasici (RTK) sono quelli maggiormente mutati
nei tumori e sono tra i geni codificati dagli oncogeni virali.
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I RTK si possono suddividere in:
tirosinchinasi citoplasmatiche
recettori con attività tirosinchinasica
I RTK sono suddivisi in diverse famiglie che si caratterizzano principalmente per la porzione
aminoacidica extracellulare in:
porzione ricca di cisteine come EGFR, IR, IGFR
domini simili a quelli delle Ig (Ig like motif), come PDGFR e FGFR
domini con sequenze di fibronectina combinate a sequenze Ig-like, come efrinaAR,
efrinaBR, angiotensina .1R
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domini che reagiscono con le caderine in presenza
Attivazione dei recettori
RTK: Il sito catalitico, in posizione C-terminale ha attività proteinchinasica, ed è
costituito da tre regioni: 1) legante ATP, 2) attività fosfotransferasica,
3) contenente una proteinchinasi attivata da fosforilazione dopo legame del
ligando al recettore. Gli RTK sono presenti in stato inattivo come monomeri e
dimerizzano dopo interazione con il ligando. La dimerizzazione induce un
cambiamento conformazionale che attiva il sito catalitico con attività
tirosinchinasica, che induce fosforilazione nei siti catalitici che in altri residui.
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Il primo segnale
dell’attivazione del recettore,
mediata dal ligando, e’ la
fosforilazione nel dominio
citoplasmatico del recettore
stesso, mediata dalla
dimerizzazione del recettore.
receptor-directed protein-tyrosine phosphatases (PTPs)
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Il legame ligando-recettore recluta proteine adattatrici
contenenti SH2 domain
L’autofosforilazione dei recettori genera siti
di fosforilazione i quali diventano siti
recettivi per proteine SH2 che includono
fosfolipasi C o GRB (growth factor receptor
bound). I domini SH3 agiscono poi come
domini di legame per domini ricchi in prolina
presenti in molecole effettrici che agiscono
come percorsi molecolari a valle.
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Trasduzione del segnale
La posizione specifica delle tirosine presenti nei RTK è quella che rende che
condiziona le interazioni con specifiche proteine citoplasmatiche da fosforilare.
In particolare i domini SH2 presenti su specifiche proteine (proteine con attività
enzimatica) vengono fosforilate dai TRK o mediante proteine adattatrici che
facilitano il contatto con le proteine che sono substrato delle proteinchinasi. I
residui carichi positivamente, presenti nelle regioni SH2 reagiscono con i gruppi
fosfato (carichi negativamente) presenti sulle TK e permettono la formazione di
un complesso che attiva la proteina contenente il dominio SH2. Altri domini
proteici che interagiscono con le tirosine fosforilate sono i SH3 e PTB
(phosphotyrosin binding).
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RAS
•RAS è un oncogene coinvolto nella proliferazione cellulare ed
è composto da tre membri (H, K, N)-RAS. Sono proteine legate
nel lato citoplasmatico della cellula ed il loro ruolo è quello di
legate, nello stato inattivo GDP.
•Mutazioni puntiformi del gene Ras sono l’anomalia singola
piu’comune di oncogeni trasmesse come carattere autosomico
dominante.
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Queste proteine sono attivate dai RTK e passano continuamente da una
forma inattiva legante il GDP ad una forma attiva legante il GTP.
Le proteine ras sono state scoperte nei virus oncogeni :
K-ras-A, K-ras.B : sarcoma murino, il proto oncogene umano nel
cromosoma 12
H-ras: sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 11
N-ras: neuroblastoma e carcinomi umani, presente nel cromosoma 1
Il prodotto di questi geni distinti è molto simile e viene denominato p21ras
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Mutazioni nei geni ras hanno come conseguenza quella di ridurre
l’attività GTPasica, con conseguente mantenimento del GTP e
quindi prodotto attivo o mutazioni che facilitano il distacco del
GDP e conseguentemente ras attivo. Il risultato finale è che ras
rimane piu’ a lungo o costitutivamente attivo, stimolando la
proliferazione cellulare delle cellule tumorali.
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MUTAZIONE DI KRAS
Mutant
KRAS
active
Inactive
KRAS
active
KRAS
GTP
GAP
Inactive
KRAS
GDP
GTP
GAP
+
+
GDP
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Downstream signal transduction cascade
mutazioni attivanti RAS
mutationi RAS si riscontrano nel 30% dei tumori
HRAS1
KRAS2
NRAS
R-RAS
Ras-mut = GAP- refractory GTPase
Un’alta incidenza di mutazioni di K-RAS si riscontrano
nei tumori al pancreas (70 –100%)
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Meccanismo di trasduzione di ras
Nel citoplasma delle cellule è presente una proteina denominato GRB-2 con
domini SH2/3 che gli permettono di formare un complesso con una proteina
denominata SOS (che è un fattore di scambio di nucleotidi guanidilici). Quando
la cellula riceve un segnale da un fattore di crescita che lega RTK, il complesso
GRB-2 SOS interagisce mediante i domini SH2/3 o PTB (phosphotyrosin
binding) ai residui fosforilati del RTK. Questo contatto permette il reclutamento
da parte di SOS della proteina ras (che lega il GDP), questo permette lo
scambio con il GTP e ras si attiva.
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Questa attivazione comporta la fosforilazione della serina/treonina chinasi raf-1 che a sua
volta fosforila una MAPKK (MEK) (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase) che a sua volta
fosforila una MAPK (ERK1/2) che trasloca nel nucleo, fosforila fattori di trascrizione, come cfos, myc e attiva la proteina ribosomiale S6, che attivano la trascrizione di geni coinvolti
nell’indurre la proliferazione cellulare o contribuiscono alla crescita cellulare. Quando ras
lega il GTP assume un cambiamento conformazionale che comporta anche il reclutamento
delle GTP-asi activating protein (GAPs) come la p120GAP e la neurofibromina1 (NF1) che
riportano ras nella forma legante il GDP.
NF-1
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PI3-K pathways
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I pathways RAS, PI(3)K e mTOR formano una rete biochimica
intersecata che, quando mutata, guida la crescita cellulare in
maniera indipendente dall’ambiente circostante. Questi pathways
guidano la tumorigenesi attraverso la fosforilazione coordinata di
proteine che attivano la progressione del ciclo cellulare, la
regolazione della sintesi di proteine e di fattori trascrizionali che
regolano l’espressione di geni coinvolti in questi processi.
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Il pathway PI(3)-chinasi.
PI(3)K è attivato sia da RAS che da RTK e di seguito attiva diversi
pathways a valle attraverso la generazione del secondo messaggero
lipidico fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P3. In particolare la
famiglia di chinasi serina-treonina AKT è considerata come il principale
bersaglio di PI(3)K nei tumori.
Esistono tre classi di PI(3)Ks, ma sembra che solo il sottogruppo IA-PI(3)K
sia coinvolto nei tumori. IA-PI(3)K sono eterodimeri composti da una
famiglia di subunità regolatorie (p85) e di subunità catalitiche (p110).
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Sono capaci di fosforilate l’anello inositolico del lipide di membrana fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato per generare il secondo messaggero PtdIns(3, 4, 5)P3.
Inoltre le subunità p85 contengono dei domini che legano specifici residui nella
regione citoplasmatica dei RTKs, questo legame permette di generare un pool
locale di PtdIns(3, 4, 5)P3. Le subunità p110 possono legarsi direttamente ed
attivare RAS.
Una delle famiglie maggiormente attivate da PtdIns(3, 4, 5)P3 sono le
serine/treonine chinasi AKT. AKT controlla il ciclo cellulare, la sopravvivenza e la
crescita cellulare attraverso la fosforilazione di diversi substrati.
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Regolazione del pathway PI3K
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Per i tumori con lesioni genetiche definite,
l ’ abilità
di
superare
un
dato
bersaglio
terapeutico è data dalla capacità di acquisire
altre mutazioni che superano l ’ effetto del
farmaco o effettori biochimici del pathway mutato
o di up-regolare il pathway disregolato.
a) l ’ attivazione del fattore IF4E e HIF,
inizialmente determinato dal pathway Ras/Akt e
bloccata con Rapamicina risulta inefficiente
causa attivazione di pathways alternativi.
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b) In tumori con lesioni iniziali in PI(3)K o altri regolatori di mTOR non hanno vie
alternative per attivare IF4E and HIF. Questi tumori rispondono a Rapamicina
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c) In tumori che esprimono EGFR e ERBB3 inibitori dell’eterodimero
bloccano la via delle IP3K.
d) Nei tumori dove ERBB3 non è espresso la via IP3K è regolata da altre vie
e gli inibitori non funzionano
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PTEN è una fosfatasi che lega e distrugge PIP3
convertendolo in PI(4,5)P2 o PI(3,4)P2
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mutazioni
PTEN
Prostatic carcinomas – PTEN mutato negli stadi avanzati.
Le cellule PTEN-negative cells diventano andrigeni resistenti
E tendono a metastiizzare
carcinoma mammario: inattivato 15-30%
GLIOMA: mutazioni di PTEN sono indice di aggressività
Carcinoma follicolare della tiroide (25%),
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EGF RECEPTOR
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EGF-R
EGF-R ha un ruolo importante nell’ambito di diverse patologie tumorali in quanto
la sua attivazione costitutiva lo rende responsabile dell’attivazione di meccanismi
di proliferazione cellulare. L’omologo del protoncogene EGF-R è stato scoperto
nel virus dell’eritroblastosi aviaria e denominato v-erb. L’analisi della sequenza
aminoacidica di v-erb ha dimostrato che questo oncogene virale codifica per una
proteina (gp65) che è simile ad una parte del EGFR, quindi è un recettore
troncato della porzione extracellulare responsabile del legame a EGF, ma
contenente la porzione citoplasmatica con attività tirosinchinasica che è
costitutivamente attiva. I pathways principalmente attivati dall’attivazione di
EGF-R sono quello di Ras/MAPchinasi e PI3 chinasi/AKT, che agiscono entrambi
nella mitogenesi e sopravvivenza cellulare.
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ATTIVAZIONE DEI SEGNALI INTRACELLULARI EGFR-DIPENDENTI
1)Legame del ligando specifico nella porzione extracellulare del EGFR
2)Formazione dell’omodimero o eterodimero che causa la fosforilazione
ATP-dipendente di specifici residui di tirosina nel dominio intracellulare di
EGFR
3)Attivazione dei pathways intracellulari:
1) Ras-Raf-MEK-MAPK che controllano la progressione della fase
G1/S
2) PI3K-Akt che attiva una cascata antiapoptotica e di sopravvivenza
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EGFR è un recettore appartenente ad una famiglia di quattro recettori.
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Tre diverse strategie terapeutiche per interagire con tale sistema e inibire la trasduzione dei
segnali proliferativi :
•Uso di anticorpi monoclonali antirecettore che si legano alla porzione extracellulare della
molecola recettoriale e impediscono il legame con il ligando
•Uso di farmaci inibitori selettivi della tirosinchinasi associata al recettore
•Uso di farmaci che agiscono sulle fasi piu’ avanzata della cascata della trasduzione del
segnale come i farmaci che interagiscono con le proteine della famiglia RAS (inibitori della
farnesiltrasferasi)
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Meccanismo d’azione dei farmaci Anti-EGFR
Le conseguenze sono:
- Arresto delle cellule in fase G1 con incremento di p27 (inibizione delle CDK)
-Inibizione dell’angiogenesi tramite il blocco della sintesi di TGFa, VEGF, IL-8,
FGF.
-inibizione dell’invasività e delle metastasi
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Meccanismo dei Anti-EGFR Monoclonal Antibodies.
L’anti-EGFR cetuximab, che è una immunoglobulina IgG1 induce immunorisposta
anticorpo dipendente, citotossicità cellulo-mediata (Panello A). Inoltre gli anticorpi
anti-EGFR inducono internalizzazione del recettore e down-regolazione
incrementando la sua degradazione (Panello B).
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Nella FISH il centromero del cromosoma 17 e' marcato con un segnale
fluorescente verde e il gene HER-2 con un segnale fluorescente arancio. In
breve si contano circa 60 nuclei cellulari e in ognuno di essi si fa il rapporto tra
segnale verde e segnale arancio.Il tumore e'definito "positivo" per l'amplificazione
genica quando il rapporto gene/cromosoma e'>2
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Percentuali di tumori EGFR+
Tipo di Neoplasia
% espressione EGFR
Vescica
31-48%
Mammella
14-91%
Utero
90%
Colon
25-77%
Esofago
43-88%
Stomaco
4-33%
Glioma
40-63%
Testa-collo
80-100%
Ovaio
35-70%
Pancreas
30-89%
Prostata
40-85%
Rene
50-90%
Polmone
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40-80%