Transcript METODE KULTUR JARINGAN HEWAN

PRINSIP DASAR & METODE
KULTUR JARINGAN HEWAN
Tim Biologi Unair
• Kultur jaringan hewan: budidaya jaringan dalam media
kultur sehingga mampu tumbuh dan membelah
• Kultur jaringan merupakan upaya memanfaatkan sifat
totipotensi sel secara in vitro
Media Kultur Jaringan Hewan
• Optimalisasi media: meliputi pH, tekanan, sumber energi
dan sumber karbon, asam amino, vitamin, mineral dan air.
• Media dasar tersusun: asam amino, asam lemak, glukosa,
ion, vitamin dan ko-faktor ,dll. Misalnya:
– Serum
– Aditif : antibiotik penisilin dan steptomycin , antifungi:
fungizone 0,5%, dan Mercapto Ethanol
– Sistem penyangga : sodium bikarbonat
• Berdasarkan asalnya, dibagi menjadi 2, yaitu:
– Media alami, yaitu media yang berasal dari cairan jaringan
embrio dan medium plasma darah
– Media sintetik, yaitu media yang dibuat secara kimia,
misalnya: MEM, RPMI
Media alami: Plasma darah
• Komponen terbesar (90%) dalam darah
• Plasma darah berfungsi untuk mengangkut sari
makanan ke sel-sel serta membawa sisa
pembakaran dari sel ke tempat pembuangan
• Bahan alami dikelompokkan dalam tiga kategori,
yaitu:
– Koagulat, misalnya koagulan plasma darah dan
kolagen.
– Cairan bologis, misalnya serum.
– Ekstrak jaringan, misalnya ekstrak embrio
Media sintesis
dibagi menjadi 3, yaitu:
1. Minimum essential medium (MEM), yaitu medium
dasar yang tersusun atas asam amino esensial dan
vitamin.
2. Medium pemelihara (maintenance medium/MM),
untuk memelihara sel dalam metabolisme rendah dan
jangka waktu agak lama. Medium ini terdiri dari MEM
& serum konsentrasi rendah (2 – 5 %).
3. Medium penumbuh (growth medium) yaitu, medium
yang diperkaya dengan nutrien untuk menumbuhkan
kultur sel secara cepat, medium ini ditambahkan
serum cukup banyak (10 – 20 %).
Eksplan Kultur Jaringan Hewan
• Berasal dari embrio dan jaringan dewasa.
• Jaringan embrionik yang digunakan harus steril.
• Jaringan embrionik dapat tumbuh dengan cepat,
tidak tergregasi dan bermigrasi dengan cepat.
• Mitosis pada jaringan embrionik segera terjadi
setelah dikultur.
• Jaringan dewasa yang tumbuh cepat adalah sel
epitel dan jaringan tumor.
Teknik Kultur Jaringan Hewan
• Dilakukan pada ukuran tertentu untuk
meminimalkan terjadinya kontaminasi.
• Harus diperhatikan (harus steril):
– Lingkungan di dalam kultur (media) dan di luar kultur
(udara, manusia, kondisi laboratorium)
– Selama kultur, faktor fisik seperti unsur hara dan hormon.
– Semua sumber kontaminasi (ruangan laboratorium,
laminer dan alat-alat bedah untuk kultur) harus ditiadakan.
Berdasarkan tempat untuk kultur jaringan hewan
terdapat 3 teknik kultur jaringan yaitu :
– Slide Culture, yaitu menumbuhkan kultur sel pada gelas
obyek cekung.
– Flask Culture, yaitu menumbuhkan kultur sel pada cawan
kultur.
– Test-tube Culture, yaitu menumbuhkan kultur sel pada
tabung reaksi, botol terutama untuk jenis sel yang tidak
melekat.
• Flask Culture memberikan keuntungan lebih jika
dibandingkan dengan slide culture. Karena
jaringan dapat dikultur sampai bertahun-tahun.
• Wadah yang baik untuk flask culture adalah
Carrel flask.
• Terdapat dua tipe Flask Culture, yaitu
– Thick Clot Culture, sangat baik untuk pertumbuhan
yang cepat dari suatu kultur jaringan
– Thin Clot Culture, sangat baik sebagai uji pengaruh
makanan pada medium terhadap kultur.
Mekanisme Kultur Sel Hewan
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Menyiapkan peralatan kultur .
Mencuci organ atau jaringan di dalam PBS
Organ dicincang sampai halus dengan gunting dan pinset .
Dicuci kembali dengan PBS
Dipindahkan dalam botol steril
Penambahan senyawa Tripsin untuk menghancurkan organ
Cairan dipindah dalam botol steril
Organ yang belum hancur di tripsinasi ulang dan cairan yang
terkumpul disaring, di sentrifugasi .
9. Supernatan dibuang, diganti MEM, diinkubasi .
10. Setelah 2-3 hari, biakan sel yang sudah monolayer dapat
diperbanyak dengan cara pasase .
Pembuatan Kultur Jaringan Hewan
dengan Menggunakan Media Alami
1. Mensterilkan Laminar Air Flow dan ruangan dengan sinar UV, 2 jam.
2. Menyiapkan alat yang telah disterilkan (spet; membran milipore; botol
kaca ; aluminium foil; pembakar spiritus)
3. Menyiapkan bahan (darah ayam segar yang diberi amonium oksalat
sebagai antikoagulan; alkohol 70%; spirtus)
4. Mensentrifuge darah (plasma darah (bag atas) dan sel darah (bag bawah).
5. Menempelkan membran milipore pada mulut botol dengan bantuan spet
secara aseptik.
6. Menyaring plasma darah ke dalam botol melalui membran milipore.
7. Setelah semua plasma darah tersaring ke dalam botol, lalu mengambil
membran milipore dan menutup botol dengan penutupnya. Kemudian
ditutup lagi dengan aluminium foil.
Kultur Mesenchymal Stem Cells (MSCs) dari 3 macam jaringan
(amandel, adiposa, sumsum tulang) menjadi banyak macam sel
(otot polos, osteosit, kondrosit, saraf, dan lemak)
Kultur jaringan epitel usus embrio ayam
Pengaturan pelepasan growth factor untuk
regenerasi jaringan
• Pelepasan GF diperlukan untuk pembentukan jaringan baru, misal
jaringan pembuluh darah dari miokardium
• GF untuk pembuluh darah : basic fibroblast growth factor (bFGF)
Kultur jaringan tulang
• Pertumbuhan dan
diferensiasi osteoblast
dari mesenkim stem cell
akan distimuli oleh kontak
interseluler, faktor media
(microenvironment) ,
stimulasi fisik, dan bentuk
permukaan sel/jaringan
• Bentuk permukaan sel/jaringan tulang
tergantung pada komposisi senyawa penyusun
matriks ekstraseluler (protein, polisakarida,
growth hormone)
• Pertumbuhan sel terjadi karena adanya
interaksi antara kontak reseptor dengan
matrik ekstraseluler
• Implantasi : strategi potensial untuk memfasilitasi regenerasi
jaringan tulang yang rusak karena penyakit, trauma
• Cetakan pengganti tulang terbuat dari biokeramik polimer,
bahan logam, dan komposit tulang
• Keberhasilan regenerasi dan sistem vaskularisasi jaringan
tulang ditentukan oleh kesesuaian dng catakannya
• Deteksi stem cell (sel induk) yang
ditransplantasikan ke jaringan lain
menggunakan metode pencitraan (magnetic
resonance imaging , MRI)
Metode kultur jaringan kulit
Kultur jaringan
kulit
• Digunakan untuk transplantasi kulit babi ke kulit luka bakar
• Alternatif lain menggunakan bahan kolagen sapi, kolagen
tulang rawan ikan hiu
Manfaat teknik kultur jaringan kulit dalam operasi
plastik, cream anti-aging, dll
• Jaringan kulit
diambil dari
pasien dan
dikulturkan dalam
cawan petri
Kelebihan Penelitian menggunakan Kultur Sel Hewan
• Mudah dikontrol fisikokimia lingkungannya (pH, suhu, tekanan
oksigen, dan CO2)
• Pengambilan kesimpulan relatif lebih mudah dengan menggunakan
populasi sel yang homogen .
• Kultur sel primer tetap memiliki integritas morfologi dan biokimiawi
dalam jangka waktu lama, dengan demikian memungkinkan
melakukan penelitian ulang (reproducible) dan terkontrol .
• Ekonomis, tidak perlu memakai banyak hewan coba .
Kekurangan Kultur Sel Hewan
• Memerlukan keahlian, selalu menjaga aseptis, tertib dan sabar .
• Gambaran histologis sudah tidak nampak .
• Dalam kasus kultur sel telah mengalami perubahan sifat aslinya,
maka hasil pengamatan yang diperoleh akan menyimpang .
• Tidak ada pengaruh sistemik dan kerjasama antar-sel yang berbeda
dalam suatu jaringan yang kemungkinan memegang peran penting
dalam aktivitas fisiologis .