Histokemi och histologiska prov

Pertti Panula Institutionen för biomedicin 2013

Alberts 5; s580 Skala: makroanatomi, mikroanatomi eller histologi, Öga (glasögon) Lupp cellbiologi, molekylär biologi, kemi, Ljusmikroskop (atomfysik) (partikelfysik) EM-skop EM-skop Biokemi Ljusmikroskop EM-skop Kemi

Ljusmikroskopisk histologisk analys: fortfarande patologens viktigaste verktyg

Levervävnad immunohistokemi,

in situ

hybridisering, elektronimikroskopi kompletterar diagnostik

Typer av prov:

Traditionell vävnadsbiopsi Nålbiopsi Endoskopiska prov Bestrykningspreparat Leikataan irti pala kudosta Barretin ruokatorvi (metaplasia) Papa-prov

Odlad cell i ljusmikroskop

Celler utan färgning

Ingen färgning Lähde: Alberts Svårt att se detaljer av cellen Enbart några korn syns Ingen färgning Samma cell i faskontrastmikros kop Cellen och kärnans gränser syns, mera detaljer Ingen färgning Samma cell i inter ferensmikroskop (Nomarski) Samma detaljer, men 3D bild Organ eller vävnad kan inte mikroskoperas som sådan; celllager projiseras på varandra Lösning: tunna snitt färgas.

Växtrotens tvärsnitt

Jämförelse av ljus- och elektronmikroskop Ljus mikro skop

silmä

Fluoresc.

skiva Elektroni mikroskop (uppochner) Okular Gartner and Hiat: Color Textbook of Histology Saunders Projektions lins

silmä

Snitt ”färjas” med tungmetallsalt: - Osmiumtetroksid, - Uranylacetat - Blycitrat Ljuskälla Objektiv Prov Kon den sor Anod Katod Tungmetalllager strittas elektroner  Mörk punkt

Framställing av histologiska prov

• Fixering • -oftast med formalin -fixerar viktiga komponenter, förbereder för behandling Förberedning av snittning • -stärckning av vävnaden med paraffin, matrix -frysning med torris eller flytande kväve Snittning -kryostat, mikrotom, vibratom

Färgning av vävnadsnitt

• • • • Deparaffinering med xylen Rehydrering till vattenfas Färgning i vatten eller buffertlösning eller annan lösning som alkohol (tex. hematoxylin eosin) Täckning av snitt (med plast, glycerol)

Vävnadsbehandlingsapparat

Kuva: Karppinen

Mikrotom för paraffinprov

Kuva: Karppinen

Prov i paraffin

Kuva: Karppinen

Snittning

Kuva: Karppinen

Snitt, ännu skrynkligt

Kuva: Karppinen

Paraffin- eller fryssnitt?

• Paraffinsnitt är bäst för rutinbruk och stora mängder prov i rumstemperatur -passar oftast men inte alltid för immunfärgning • • Fryssnitt snabba och lämpliga för prov under operationen fryssnitt kräver mera teknik och torris eller flytande kväve -fryssnitt riktigt lämpliga för immunfärgning Paraffinsnitt har ofta bättre struktur än ofixerade fryssnitt

Färgning

Manuell (sidan) eller automatisk (under). Paraffin tas bort med xylen först Kuva: http://www.ucl.ac.uk/~rmkdhjh/autostnr.htm

Hematoxylin-eosin

Enbart hematoxylin Enbart eosin H E Ross et Pawlina: Histology. A Text and Atlas. 5 p 2006 LWW

H i st o l o g i sk färgning

( H E ) 1) Hematoxylin är ett blått färgämne. I lösning inoiseras det till en positiv ion (kation)

Väri

+

Väri

+

Väri

+

Väri

+

Väri

+ 2) I vävnaden är DNA och RNA negativt laddade efter att ha donerat H+

Väri Väri Väri DNA RNA Väri Väri Väri Väri Väri

+

Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri

3) Positivt laddade hematoxylin-ioner binder till vävnadens negativt laddade element 4) I vävnaden färgas DNA och RNA med hematoxylin , alkalisk färgämne 

basofilt

Kärnorna är färgade basofilt Kerr: Atlas of Functional Histology.

1st edition, 1999 Mosby

Nucleolus Är mörk

Kärnans strukturer

H = Hetero kromatin är mörkt E = Eukromatin är ljust Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby TEM bild

Nissl korn Ribosomala ansamlingar syns i ljusmikroskop som basofiliska Nissl korn Neuronen har ett väl utvecklat RER, med mycket ribosomer Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lähde: J.F.Kerr, Atlas of Functional Histology

Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

Hematoxylin färgar kärnans DNA och cytoplasmiskt RNA

H E Ross et Pawlina: Histology. A Text and Atlas. 5 p 2006 LWW

H i st o l o g i sk färgning

1) Eosin är ett rött färgämne.

Det är syrligt och ioniseras till en Negativt laddad ion (anion) ( H E )

Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini -

2) Vävnadsproteinernas aminogrupper laddas positivt i vattenlösnig

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

H i st o l o g i sk färgning

( H E ) 1) Eosin är ett rött färgämne. Det är syrligt och ioniserad till anioni

Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini -

2) Proteinernas aminogrupper är Positivt laddade i vattenlösning 3) Negativt laddadt

Eosiini Eosiini + Eosiini + Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini + Eosiini Eosiini +

eosin binder till positivt laddade strukturer

Eosiini Eosiini Eosiini +

(särskilt proteiner) - Kollagen och cellens stödproteiner, mm 4) I snitten färgas proteinerna eosinofilt (=acidofilt) Muslekcellernas proteiner färgas röda med eosin, Kärnorna blåa med hematoxylin

Proteinhaltig cytoplasma färgas i allmänhet eosinofilt Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Svettkörtelcellens cytoplasma färgas starkt eosinofilt Magepitelcellernas och körtelcellernas cytoplasma färgas starkt eosinofilt

HE-färgade glattmuskelceller

Proteinirik cytoplasma färgas rött, kärnorna i periferin blått Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

Också extracellulära proteiner, här kollagen, färgas med eosin Föreg. bild Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby fibroblasternas kärnor mellan kollagenfibrer är basofilt färgade

Slät endoplasmatiskt retikel och mitokondrier (EM)

Viktiga särskilt för lipidernas och steroidernas metaboli Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Heikki Hervonen HY, BLL, 2004

Slät endoplasmatisk retikel och mitokondrier i steroidproducerande celler M = Mitokondrier innehåller mycket proteiner  eosino/acidofila färgningsegenskaper  Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby SER innehåller mindre proteiner och färgas inte lika starkt  på kanterna

En exokrin cell i bukspottkörteln Hur färgas cellen med H E ?

Kornen innehåller proteiner – dvs färgas …………….?

Omkring kärnan rikligt med RER Basdelen färgas………….?

Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

En exokrin cell i bokspottkörteln

Kornen har mycket protein och Färgas eosinofilt Omkring kärnan mycket RER:a, bsdelen färgas basofilt

Körtelstruktur in exokrin pancreas

Basofilt grovt endoplasmatiskt retikel (RER, ribosomer!) och eosinofila korn (proteiner)

Fettdropparna har lösts från ett vanligt prov

Fettcellens cytoplasma syns som en tunn ram Fett kan färgas med specifika metoder Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby N = fettcellens kärna Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby = triglyserider

Specialfärgning för elastin

Skiljer elastin från kollagen och intracellulära proteiner Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Elastinet är mörkt S = glattmuskelcell C = kollagen

Histokemi och enzymhistokemi

• Histokemiska färgningar: – PAS-färgning för kolhydrerad, – – Alcian-Blue för sura mukopolysakkarider, Silversaltbaserade färgningar för retikulinfibrer och nerver • Enzymhistokemi utnyttjar cellernas egna enzym som kan åskådligsgöras – som substrat används metallsalt, som enzymet reagerar på och produkten är precipitat som kan visualiseras i mikroskop

Silverfärgning visar tunna retikulinfibrer

Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby I levern på sinusoiodväggarna Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lynfnodernas stödvävnad

Kolhydraterna syns inte med hematoxylin-eosin

Bägarcellernas sekret (kolhydrater) syns som det ofärgade området i epitelet Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

PAS-färgning för kolhydrater

PAS-färgning färgar bägarecellernas Kålhydrater grannrött PAS-färgning färgar Också glycocalyx Och basalmembran glycoproteiner PAS = PeriodicAcid Schiff dvs perjodsyra-Schiff Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

Immunohistokemi

Bild: Minna Takkunen: Epithelial mesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells. Avhandling

Immunohistokemi

• • • • • Immunohistokemi utnyttjar kroppens egna antikroppar, dvs. humoral immunrespons Djuret immuniseras (vaccineras) med (makro)molekylen ( antigen/immunogen ). Denna stimulerar lymfocyter till produktion av

specifika antikroppar och

ja minnesceller.

Upprepade immuniceringar leder till förstärkt respons Efter 2-4 immuniseringarkan man dra serum med antikroppar, som på ett specifikt sätt binder till antigenen Monoklonala antikroppar produceras i cellkultur

Antikroppens

Antigen bindande del

struktur

Varierande del • Två identiska tunga kädjor och två identiska lätta kädjor, Y-form •Y-formade delens varierande område binder immunogen kevyt ketju raskas ketju F c -frag ment amino termin al F ab -frag ment karboxyter minal

Ross & Pawlina

: Histology.

A Text and Atlas, LWW 2011

Indirekt immunohistokemi

Antigenens struktur A Primära antikroppar kaninen mot antigen A : producerade in I får producerade sekundära antikroppar, som har markör Alberts et al.: Molecular Biology of The Cell 5.ed, 2008 Garland Science 1. Sk. polyklonal kaninantikropp mot antigen A 2. I fåren producerad antikropp mot kaninens antikroppens Fc del,som är markerad Markören kan vara •fluorokrom, tex fluoreskein •enzymmolekyl •guldpartikel (EM)

Vimentinfibrer (intermediära filament)

Fibroblast

Immunfärgning i diagnostik: i Lupus-nefrit (njursjukdom) samlas protein i glomerulus Virtanen 2009

in situ

hybridisering

• Enkel RNA tai DNA kädja (probe, sond) binder specifikt till motsvarande sekvens (DNA, mRNA) • Reaktionen kan ske i lösning, gel eller vävnad (

in situ

) • Reaktionen identifierar kända sekvenser och kan lokalisera dem i kromosomer/celler/vävnader • Med hjälp av olika fluorokromer kan man identifiera flera sekvenser

In situ hybridisering

a. grundelement: DNA-sonden och målsekvensen b. Sonden kan märkas direkt med fluorokromen c. Sonden och mål-DNA denatureras för att åstadkomma enkelsträngad (single stranded) DNA d. Enkelsträngade DNA-kedjor binder på varandra e. Fluorokrom -markerad sond syns under mikroskop