Transcript Planering av kemilaborationer för termin 1

Umeå Universitet
Institutionen för Klinisk Mikrobiologi
Biomedicinsk Laboratorievetenskap
Laborationer i
Grundläggande
laboratorievetenskap
BMA-11 Ht- 2011
2
LABORATIONER
Kursen Grundläggande laboratorievetenskap omfattar fem laborationer, enligt följande.
1.
Statistiska undersökningar och jämförelser mellan några volumetriska kärl
2.
Felanalys vid densitetsbestämning av magnesium
3.
Kvalitetskontroll av spektrofotometer
4.
Koncentrationsbestämning med hjälp av spädningsteknik och spektrofotometri
5.
pH - meter och buffertlaboration
Ni kommer att arbeta i laborationsgrupper om 2-3 personer/grupp. Redovisning av laboration 1
sker under statistik examinationen medan laboration 2 och 3 redovisas med laborationsrapport.
Laboration 4 och 5 redovisas enligt instruktioner i laborationshandledningen.
Generellt gäller för alla laborationer att de ska vara väl förberedda.
Närvaro samt redogörelser för laborationer är obligatoriska.
Laborationsrapporten bör vara inlämnad senast fem arbetsdagar efter laborationstillfället, gäller ej
för laboration 1. Se Anvisningar för arbetsböcker och laborationsrapporter.
OBS! Alla laborationsredogörelser/rapporter måste vara inlämnade och godkända vid laborationskursens slut för
att få denna kurs godkänd.
RISKINFORMATION
Det är nödvändigt att ALLA laboranter känner ansvar för sin egen och sina kamraters säkerhet.
Därför måste varje student ta del av dessa anvisningar.
Man bör känna till var säkerhetsanordningar, sjukvårdsmaterial, brandsläckningsutrustning mm
förvaras. Vid inträffande av en olycka bör man veta hur man handlar. Slarv vid laboratoriearbete
kan vålla svåra personliga och materiella skador.
Kemikalier kan vara giftiga, frätande, irriterande, brandfarliga eller explosiva. Behandla alla
kemikalier som om de är giftiga. Smaka aldrig på kemikalier och förtär aldrig något i
kemilokalerna. Ta inte i kemikalier med händerna, använd alltid spatel, sked eller dylikt.
Hantering av frätande vätskor kräver stor försiktighet. Det är obligatoriskt att använda
skyddsglasögon och gummihandskar vid arbete med starka syror eller baser. Syror som
svavelsyra, saltsyra, salpetersyra och koncentrerade organiska syror samt även baser tex natriumoch kaliumhydroxid lösningar kan ge svåra skador på kroppen (speciellt ögon) men även kläder.
Spill av frätande ämnen ska genast torkas upp. Vid utspädning av koncentrerade syror hälls syran
i fin stråle under omrörning i vattnet (ej tvärtom) för att undvika stänkning. SIV - syra i vatten.
3
Många organiska lösningsmedel är ytterst eldfarliga tex eter med flera. Deras lättflyktiga ångor ger
explosiva blandningar med luft. Ångorna är tyngre än luft och kan rinna vida omkring på ett bord
etc. Vid arbete med sådana ämnen får inga lågor finnas i närheten. Observera att gnistor
uppkomna genom friktion samt statisk elektricitet kan tända en explosiv gasblandning. Även
andra brandfarliga ämnen måste hanteras försiktigt (etanol mm). Var aktsam vid användande av
gaslåga. Lämna inte gaslågan utan uppsikt. Se till att du har stängt gasbrännaren ordentligt när du
använt lågan klart.
Sök reda på information om kemikaliers egenskaper före användandet av dem. Slå upp och läs
om kemikalien i den litteratur som finns i laborationssalen eller använd nätet.
AFS 1997:10
AFS 2000:4
Laboratoriearbete med kemikalier
Kemiska arbetsmiljörisker
www.av.se/regler/
www.kemi.se
RISKBEDÖMNING
Kontrollera vilka farliga egenskaper som den aktuella kemikalien har. Antingen används de
böcker som finns på laboratoriet, alternativt läs bifogat produktsäkerhetsblad från producenten
(detta kan fås fram via Internet) eller gå in på kemikalieinspektionens hemsida.
Ange om ämnet är farligt för inandning, hudkontakt, ögon, oralt intag etc, samt eventuella
problem vid kvittblivning (miljöfarligt avfall). Ange även hur man ska skydda sig vid laborationen
(handskar, skyddsglasögon, dragbänk, skyddsrock etc).
Beskriv även, om olyckan är framme, hur man gör första hjälpen vid akut behov.
Anteckna också eventuella restriktioner vid kvittblivning av kemikalien.
Riskbedömningen görs innan laborationen och bifogas till laborationsrapporten.
OM OLYCKAN ÄR FRAMME.
Här följer en kortfattad beskrivning av vad man bör göra vid olika typer av olyckor.
El-skador: Bryt omedelbart strömmen. Frigör först därefter (annars finns det risk att du får
ström i dig) den skadade. Om personen inte andas, ge konstgjord andning. Tillkalla ambulans.
Skärsår: Mindre skärsår får blöda en stund. Tvätta sen såret med tvål och vatten. Lägg på ett
snabbförband. Större skärsår bör förbindas och därefter är det bra om man uppsöker läkare.
Brännskador: Kyl brännskadan med kallt vatten. Spola länge, håll på tills smärtan avtar. Lägg på
förband men använd inte sårsalva. Vid svårare brännskador - tillkalla läkare.
Frätskador på hud: Skölj med stora mängder vatten. Tillkalla läkare.
Ögonskador: Om man har fått kemikalier i ögonen är det viktigt att handla snabbt. Skölj ögonen
noggrant med stora mängder vatten. Börja omedelbart och fortsätt under lång tid. Kom ihåg att
ögat måste vara öppet under sköljningen. Alla ögonskador ska snarast möjligt kontrolleras av
läkare. Fortsätt att skölja ögat på väg till läkaren under väntan på behandling.
Kontaktlinser är förbjudna att använda vid laboratoriearbete.
4
Tag reda på var Brandsläckare och Nödutgång finns!
Vid brand:
 RÄDDA
Se till att ingen person är i fara
 LARMA
Ring 112
 SLÄCK
Känner du till utrymningsplanen?
ORDNINGSREGLER VID LABORATIVT ARBETE

Allt laborativt arbete ska vara väl planerat och förberett.

Kontaktlinser får inte användas vid laborativt arbete

Använd skyddsglasögon vid alla riskmoment. Ögonen är mycket utsatta och ömtåliga

Du får ALDRIG äta, dricka, snusa eller röka på ett laboratorium

Använd labrock. Inga ytterkläder förvaras på lab - utnyttja omklädningsrum

Håll ordning på din arbetsplats - rent och snyggt

Använd tuschpenna/etiketter för att märka vad som finns i kärl, flaskor etc. Det får inte
finnas ett enda kärl vars innehåll du är osäker på. Märk även med datum om det ska sparas

Meddela om du har slagit sönder något - kasta glaskross i särskild avfallskartong

Meddela om en kemikalie håller på att ta slut

Se till att vågarna är rena. Blås ej bort pulver utan använd borste. Var och en rengör efter sin
vägning

Häll inte tillbaka kemikalier och lösningar i sina ursprungliga burkar eller flaskor

Häll inte olämpliga kemikalier i slasken tex hydrofoba och lättantändliga vätskor som eter.
Använd särskilda avfallskärl

Håll ordning i kemikalieförrådet

Ta hand om egen och gemensam disk. Plocka in ren lab utrustning på dess plats

Efter avslutat arbete lämnas arbetsplatsen i sådant skick att en annan person utan risk ska
kunna arbeta där.
Stressa inte!!
5
Laboration 1
Statistiska undersökningar och jämförelser mellan några
volumetriska kärl
Syfte
 Bestämma riktighet/noggrannhet (validitet) och precision (reliabilitet) hos några olika
volumetriska kärl; Konstruera histogram och kontrolldiagram; Avgöra om extrema mätvärden kan
strykas; Ange resultat med största antal säkra (gällande) siffror; Tolka resultaten; Identifiera och
bedöma felkällor.
Mål
 Kunna göra tabeller med tabelltext enligt anvisning
 Kunna tillverka olika typer av diagram/figurer med figurtext
 Kunna utföra olika typer av statistiska beräkningar – både inom beskrivande statistik och enklare
statistisk inferens/analys
 Kunna tolka de beräknade värdena, dvs. kunna skapa information ur mätdata
 Kunna bestämma och analysera viktiga felkällor
6
Bakgrund
Validitet och reliabilitet är två begrepp som är tillämpbara på alla typer av verksamhet där man utför
mätningar, både kvantitativa men också kvalitativa. Överfört till kvantitativa mätningar kan man beskriva
validitet som en metods eller ett mätinstruments förmåga att mäta det man vill mäta. I volymetriska
sammanhang innebär en hög validitet att volymgraderingen stämmer med verkligheten, dvs. om man ska
mäta upp 50 mL så är graderingen på 50 mL riktig. Låg validitet kan innebära att graderingen 50 mL
kanske innebär 48,5 mL.
Realiabilitetsbegreppet är i volymetriska sammanhang kopplat till hur nära ett upprepat antal mätningar av
en viss volym sammanfaller med varandra. Ju mindre spridning av värdena, desto större är reliabiliteten.
Som verktyg för att bestämma de olika mätinstrumentens validitet och reliabilitet används statistiska
metoder. Dessa statistiska metoder utgör viktiga verktyg vid bedömning av olika mätinstruments och
mätmetoders kvalitet, dvs. de är kvalitetssäkringsverktyg.
Denna laboration är i första hand en bedömning av olika volymetriska kärls validitet och reliabilitet.
Material
(Arbetsbok – ska föras till alla laborationer)
Mätglas 25 mL
Pasteur-(dropp-)pipett
Mätpipett 10 mL
Vollpipett 10 mL
Mikropipett för uppmätning av 500 L
Mikropipettspetsar
Bägare storlek 10 mL, ≈ 150 mL, ≈ 500 mL
Pipettfyllare
Våg med tre decimaler
Våg med fyra decimaler
Rumstempererat vatten
Termometer
Metod
Rumstempererat vatten används vid uppmätning av de olika volymerna. Samtliga uppmätningar görs med
optimal noggrannhet. Den största bägaren används som förrådskärl för rumstempererat vatten, de mindre
placeras på vågskålarna för vägning av uppmätta volymer. För graderade mätkärl (mätglas, mätpipett och
vollpipett) gäller att när underdelen av menisken (dvs. den linsformade delen av vattenpelarens yta)
tangerar den önskade volymens gradering är uppmätningen klar och vattnet kan tömmas i bägaren på
vågskålen. Vid uppsugning av vätska i pipett används aldrig mun utan pipettfyllare (Peleusboll etc). För
användning av mikropipetter, se avsnittet ”Användning av mikropipetter” nedan!
Innan du fyller vatten i bägaren på vågskålen, ska vågen tareras (nollställas). Töm det uppmätta vattnet i
bägaren och avläs därefter vattnets massa. För in det avlästa värdena i tabell i arbetsboken.
7
Uppmätning av 10 mL
Använd våg med tre decimaler (g). (Mätserie 1 – 3 nedan.)
Användning av mikropipetter
De tekniker som ska användas för uppsugning med mikropipett är antingen forward-teknik eller reverseteknik. Vid nedanstående mätserier används våg med fyra decimaler (g). (Mätserie 4 – 6 nedan.) Innan du
avläser massan stänger du sidoluckor och topplucka runt vågskålen för att minska avdunstningen. För att
ytterligare minska risken för snabb avdunstning ska en bägare med rumstempererat vatten vara placerad i
vågrummet för att luften ska vara mättad med vattenånga.
Manuella mikropipetter har ofta en tryckknapp med tre lägen. Vi kan kalla läget för tryckknappen 0 (noll)
när den inte är intryckt. Avståndet till läge 1 beror på vilken volym mikropipetten är inställd på. En
mekanisk display visar den inställda volymen. Det innersta läget är 2. (En del pipetter har ytterligare ett
läge, men det är för att lossa spetsen.) Använd rätt pipettspets!
Tillvägagångssätt för forwardteknik:
a) Efter att ha fäst en spets på pipetten, för tryckknappen (med tummen) till läge 1.
b) Sätt pipettspetsen under ytan på den vätska som ska sugas upp. Släpp långsamt upp tryckknappen till
läge 0. Nu innehåller spetsen den inställda volymen vätska.
c) Lyft upp spetsen ur vätskan och torka försiktigt av eventuell droppe på spetsens utsida utan att vidröra
spetsöppningen, i vilket fall vätska kan sugas ut ur spetsen.
d) Töm ur spetsen i det kärl vätskan ska överföras till genom att pressa ner tryckknappen till läge 2.
Tillvägagångssätt för reverseteknik:
a) Efter att ha fäst en spets på pipetten, för tryckknappen (med tummen) till läge 2.
b) Se forwardteknik!
c) Se forwardteknik!
d) Töm ur spetsen i det kärl vätskan ska överföras till genom att pressa ner tryckknappen till läge 1.
Utförande
Mätserie 1: mätglas 25 mL
Mät upp 10 mL vatten i mätglaset genom att först hälla försiktigt från förrådskärlet och därefter finjustera
nivån med hjälp av pasteurpipett. Häll över vattnet i bägaren på vågskålen och avläs. Gör en mätserie på
10 mätningar.
Mätserie 2: mätpipett 10 mL
Mät upp 10 mL vatten i pipetten. Töm pipetten i bägare på vågskål. Väg vattnet! Gör en mätserie på 10
mätningar.
Mätserie 3: vollpipett 10 mL
Mät upp 10 mL vatten i pipetten. Töm pipetten i bägare på vågskål. Väg vattnet! Gör en mätserie på 10
mätningar.
Mätserie 4: mikropipett för uppmätning av 500 L
Gör en serie på 20 mätningar av vatten med forwardteknik.
Mätserie 5: mikropipett för uppmätning av 10 L
Gör en serie på 20 mätningar av vatten med forwardteknik.
Mätserie 6: mikropipett för uppmätning av 10 L
Gör en serie på 20 mätningar av vatten med reverseteknik.
8
Laborationsrapport
För laborationsrapporten gäller:
Med undantag för rådatakolumn ska mätdata vara omvandlade till volym (mL eller L).
Ta reda på vattnets densitet i ”HANDBOOK of CHEMISTRY and PHYSICS” för vattnets aktuella
temperatur.
Kommentera de beräkningar du gjort och tolka resultaten.
Rapporten skickas in som attachment. Detta sker efter det att teorimomenten i statistik och
kvalitetssäkring som behövs för redovisning är genomgångna.
OBS 1! Vid presentation av uppmätta och beräknade värden, använd alltid det maximala antal
gällande siffror som mätningarna medger. Ofta presenteras uppmätta men framför allt beräknade värden
med för många siffror, vilket betyder att det eller de sista siffrorna med största sannolikhet är helt
felaktiga. Detta kallas för falsk noggrannhet. Detta ska i princip göras vid alla laborativa mätningar!
OBS 2! För att inte bli misstänkt för plagiering, ha alltid med källhänvisningar om andra källor
använts i redogörelsen.
Innehåll
Försättsblad
Tabeller
 Tabell med rådatakolumner för massa (g) och volym (mL) för mätglas, mätpipett och vollpipett.
 Tabell med beräknade Q-test samt beräknade medelvärden, standardavvikelser och
variationskoefficienter för mätglas, mätpipett och vollpipett (i enheten mL)
 Tabell med rådatakolumner för massa (mg) och volym (L) för mikropipett 500 L och
mikropipett 10 L forward- och reverseteknik.
 Tabell med beräknade Q-test samt beräknade medelvärden, standardavvikelser och
variationskoefficienter för de tre mätserierna med mikropipetter (i enheten μL)
Figurer
 Histogram för mätserien på 500 L.
 Kontrolldiagram för de två mätserierna på 10 L (forward och reverse).
Diskussion
 De viktigaste felkällorna
 Tolkning av hypotestesten
 Tolkning av jämförelser mellan medelvärden, standardavvikelser och variationskoefficienter dels
mellan mätglas, mätpipett och vollpipett, dels mellan forward och reverse 10 μL mikropipett
 Kommentar och tolkning av kontrolldiagrammen
 Slutsats
Litteratur
Statistik för hälsovetenskaperna; Ejlertsson, G., Studentlitteratur, 2003.
Chemistry – A Molecular Approach; 2nd ed. Nivaldo J. Tro; Pearson; 2011
9
Laboration 2
Felanalys vid densitetsbestämning av magnesium
Syfte
 Att densitetsbestämma magnesium och att identifiera och bedöma mätosäkerhetens påverkan på
resultatet
Mål
 Inse varför exakta mätningar av kvantitativa kontinuerliga variabler inte är möjliga
 Förstå principen för och kunna utföra, där så är möjligt maximalfelsskattningar
 Förstå den grundläggande skillnaden mellan maximalfelsskattningsintervall (   ) och
konfidensintervall.
10
Bakgrund
Vid mätning avläses olika typer av skalor. De fel som kan uppstå har både slumpmässig och systematisk
karaktär. Till de slumpmässiga felen hör avläsningsfel beroende på skalors osäkerhet eller ögats oförmåga
att bestämma t.ex. när en vätskemenisks nedre kant tangerar en gradering. Denna osäkerhet är
ofrånkomlig. Vid bestämning av ett värde som beror på flera oberoende mätningar kan i värsta fall varje
mätning ge ett maximalt fel som fortplantas och förstärks. Detta är bakgrunden till den s.k.
maximalfelsskattningen som bygger på en matematisk metod kallad logaritmisk differentiering (logarithmic
differentiation). I denna maximalfelsskattning adderar man samtliga fel.
Genom att mäta ett magnesiumbands längd, bredd och tjocklek samt genom vägning av dess massa kan
magnesium densitetsbestämmas med hjälp av formeln
(1)   m / V  m /(l  b  t )
där m = massa; V = volym; l = längd; b = bredd; t = tjocklek och densiteten som beräknas har
beteckningen  (rho).
Beteckningen på de maximala fel som kan uppstå vid avläsning av dessa är l (delta l), b, t och m. De
beräknade medelvärdena betecknas l , b , t , m och för densiteten är det uträknade medelvärdet  .
Maximalfelsskattningen (Δ) beräknas med hjälp av formeln
(2)    (m / m  l / l  b / b  t / t )
Med hjälp av denna kan man göra en skattning av gränserna för det intervall inom vilket det sanna värdet
bör ligga med hjälp av formeln
(3)   
11
Material
1. Linjal
2. Skjutmått
Där linjen på Nonie-skalan sammanfaller med en linje på skalan avläser man skjutmåttet. I detta fall visar
skjutmåttet 2,3 mm.
3. Mikrometerskruv
På skalan kan man avläsa
antal hela och halva
millimetrar, i detta fall 1,5
mm.
På cylinder kan man avläsa antal
hundradels mm. I detta fall 26
hundradelar.
Uppmätt tjocklek:
(1,5 +0,26) mm =
1,76 mm.
4. Våg
5. Magnesiumband
12
Utförande
20 magnesiumbands längd, bredd och tjocklek mäts med största möjliga noggrannhet med hjälp av linjal,
skjutmått och mikrometerskruv. Banden vägs också på våg som visar minst tre decimaler (g).
Laborationsrapport
Innehåll
Försättsblad
Tabeller
 En tabell över längd, bredd, tjocklek, volym, massa och densitet för de undersökta
magnesiumbanden
 Tabell med medelvärde, median, standardavvikelse, kvartilavstånd och ett 95 %-igt
konfidensintervall för magnesiums densitet (under antagande att de beräknade densiteterna är
normalfördelade)
 Maximalfelsskattning av magnesiums densitet och maximalfelsintervall av densiteten
 En diskussion vid jämförelse mellan maximalfelsintervall och 95 %-igt konfidensintervallet för
magnesiums densitet. Förklara skillnaderna i bredd på de två intervalltyperna.
 Kontrolldiagram över de beräknade densiteterna
Diskussion
 Jämförelse och tolkning/slutsats mellan det beräknade 95 %-iga konfidensintervallet för
o
magnesium och magnesiums sanna densitet vid 20 C
 Förklaring till storleken på skattningarna av l, b, t och m
 Diskussion om olika mätfelens relativa påverkan på säkerheten vid bestämning av magnesiums
densitet
 Kontrolldiagram
 Diskussion av begreppen slumpmässiga och systematiska fel, dessa begrepps koppling till
begreppen validitet och reliabilitet samt begreppet bias.
Litteratur
Statistik för hälsovetenskaperna; Ejlertsson, G., Studentlitteratur, 2003.
Analysteknik, Instrument och metoder (Kap. 1 – 5); Simonsen, F., Studentlitteratur, 2005.
13
Laboration 3
Kvalitetskontroll av spektrofotometer
Syfte
 Att undersöka absorbansens linearitet mot koncentration absorberande ämne för en
spektrofotometer samt bestämma andelen ströljus.
Mål
 Kunna bestämma lineariteten hos en spektrofotometer
 Kunna bestämma ströljus för en spektrofotometer
 Förstå linearitetens och ströljusets inverkan på en spektrofotometers kvalitet
14
Bakgrund
Orbitalbundna elektroner, dvs. elektroner i atomer, molekyler och joner har förmåga att absorbera
elektromagnetisk strålning av olika frekvenser. Inom det synliga och ultravioletta våglängdsområdet
absorberar dessa elektroner den elektromagnetiska strålningen varvid elektronerna exciteras, alltså får en
högre potentiell (läges-) energi. (I fortsättningen används ljus som synonym till elektromagnetisk
strålning.) Olika ämnen absorberar inom olika våglängdsområden. Vattenlösningar av ämnen som
absorberar inom det synliga området är färgade, lösningar av ämnen som enbart absorberar inom det
ultravioletta området är färglösa.
Lösningar med höga koncentrationer uppnår ”skuggningseffekt”, dvs. koncentrationen är så hög att de
lösta partiklarna skymmer varandra. Detta medför att lösta partiklar som har förmåga att absorbera ljus
inte gör det därför att de är avskärmade från ljus av andra partiklar. För lösningar med höga
partikelkoncentrationer finns inget linjärt förhållande mellan koncentration lösta partiklar och mängd
strålning som passerar lösningen.
Lösningar, vilkas koncentrationer inte uppnår skuggningseffekt följer Bouguer–Lambert–Beers lag, vilken
matematiskt uttrycks enligt
(1) A =  * c * l
där A är absorbansen,  (epsilon) är absorptionskoefficienteneller molära absorptiviteten som är
våglängds- och ämnesberoende, c är det absorberade ämnets koncentration och l är den längd ljuset går
genom lösningen som ju bestäms av kyvettens dimensioner. Av Bouguer–Lambert–Beers lag framgår att
absorbansen är proportionell mot koncentrationen när  är konstant, dvs. vid konstant våglängd. Ett annat
sätt att uttrycka absorbansen matematiskt är
(2) A = lg(1/T)
där T är transmittansen eller den andel av ljuset som passerar genom kyvetten. Denna kan också uttryckas
som
(3) T = I/I0
där I0 är intensiteten hos det ljus som går in i kyvetten och I är intensiteten hos det ljus som lämnar
kyvetten. Sätts (3) in i (2) fås
(4) A = lg(I0/I)
Om inget ljus absorberas så är I = I0 vilket ger T = 1 (alltså 100 % transmittans) och A = lg1, alltså A = 0.
Om däremot inget ljus passerar genom kyvetten är I = 0 vilket ger T = 0, alltså ingen transmittans. Detta
ger A = lg(1/0) eller A = lg(∞), dvs. A = ∞ . Uttryckt med ord, om inget av det ljus som går in i kyvetten
lämnar kyvetten så är absorbansen oändligt stor.
Generellt når alltid en viss andel ljus en spektrofotometers detektor, dvs. den del som registrerar ljus som
passerar genom kyvetten. En anledning till det är att i kyvetthuset, dvs. det utrymme i spektrofotometern
där kyvetthållare för prov och referenser finns, finns också s.k. ströljus. Ströljus är det ljus som inte har
gått genom kyvetten men som når detektorn på annan väg. Detta ströljus kan uppstå genom att
spektrofotometerlampans ljus sprids av dammpartiklar, reflekteras i kyvett osv. Hur påverkar detta ströljus
värdet på absorbansen? Antag att förutom I0 som går in i kyvetthuset så tillkommer 0,1 ‰ ströljus. Det
innebär att det ljus som går in i kyvetthuset har intensiteten 1,0001 I0. Vad händer om 60,00 % av det ljus
som går in i kyvetten passerar genom kyvetten? Den intensitet ljus som når detektorn blir 0,6000 I0 +
0,0001 I0. Absorbansen blir A = lg(I0/0,6001 I0). A = lg1,666 eller A = 0,222. Vad blir absorbansen man
inte tar med ströljus i beräkningen?
A = (I0/0,6000I0); A = lg1,667. A = 0,222. Med andra ord märks inte ströljuset i avläsning av absorbans.
Antag att inget ljus passerar genom kyvetten. Vad kommer spektrofotometern att visa för absorbans?
Ströljuset som ju når detektorn har intensiteten 0,0001 I0. Den absorbans som kommer att avläsas blir A =
lg(I0/0,0001 I0) eller A = lg10000,
15
dvs. A = 4. Detta innebär att det finns ett ”tak” för den högsta absorbans som kan visas. I exemplet ovan
är den högsta absorbansen 4 när ströljuset är 0,0001 I0.
Material
Spektrofotometer
Kyvetter (UV)
Kaliumdikromatlösningar (K2Cr2O7 i 0,005 M H2SO4) av olika koncentrationer
Utförande
Först görs en riskbedömning av kaliumdikromat och svavelsyra. (Se sid. 2 och 3; Riskinformation
och Riskbedömning.) Meddela därefter vilka försiktighetsåtgärder ni har tänkt vidta för att minimera
olycksfallsrisk. Detta ska göras och redovisas innan laborationen påbörjas!
Absorbansen ska mätas vid 350 nm på sex olika koncentrationer av kaliumdikromat, K2Cr2O7 vilka lösts i
0,005 M H2SO4. Koncentrationerna är 25 mg/l; 50 mg/l; 75 mg/l; 100 mg/l; 150 mg/l samt 200 mg/l.
Som referens används 0,005 M H2SO4.
Matcha först kyvetterna genom att i både referenskyvett och provkyvett ha 0,005 M H2SO4. Nivån i
kyvetten ska vara ca 2/3 av fylld kyvett. Använd pasteurpipett. OBS! Repa inte kyvett med spets på
pasteurpipettspets!
När matchningen är klar byts lösningen i provkyvetten ut mot kaliumdikromatlösningar. Börja med lägsta
koncentration och gå mot högre koncentrationer. Töm kaliumdikromatlösningarna i provkyvetten i en
speciell kaliumdikromatslask! När absorbansen vid samtliga koncentrationer är uppmätt blockeras ljuset
genom kyvetthållaren för att bestämma ströljus.
Laborationsrapport
Innehåll
Försättsblad
Resultat
 Tabell med kolumner för koncentration, absorbans före matchning och absorbans efter
matchning
 Punktdiagram i vilket linjeanpassning är gjord både för alla mätpunkter och för de mätpunkter
som ger bäst linjeanpassning (minst tre). För båda linjeanpassningarna anges
derminationskoefficient (r2) och linjeekvation
 Uppmätt absorbans vid T = 0 och beräknad andel på ströljus i förhållande till I0
Diskussion (Om spektrofotometerns kvalitet)
Riskbedömning Kaliumdikromat och svavelsyra
Litteratur
Statistik för hälsovetenskaperna; Ejlertsson, G., Studentlitteratur, 2003.
Analysteknik, Instrument och metoder (Kap. 1 – 5); Simonsen, F., Studentlitteratur, 2005.
Chemistry – A Molecular Approach; 2nd ed. Nivaldo J. Tro; Pearson; 2011
16
Laboration 4
Koncentrationsbestämning med hjälp av spädningsteknik och
spektrofotometri
Syfte
 Att bestämma koncentrationen av en KMnO4 lösning med hjälp av spädningsteknik,
spektrofotometrisk avläsning och beräkning av koncentration med linjär regression mot
en standardkurva.
Mål
 Vara väl förtrogen med de spädningstekniker som används
 Kunna använda och förstå principen för en spektrofotometer anpassad för mikroplattor
 Bestämma koncentrationen av en KMnO4 lösning med hjälp av en spektrofotometer och
en känd standardlösning.
Material
Spektrofotometer (Multiscan plus, Labsystems, Helsinki, Finland)
Mikroplatta med 96 brunnar, flat botten
KMnO4 standardlösning med känd koncentration 10 mM
KMnO4 lösning med okänd koncentration
Använd inte mer KMnO4 lösning än behövligt
Pipett för 40-200 µl inklusive passande spetsar
Utförande
1. Gör en riskbedömning för KMnO4.
2. Titta i manualen för spektrofotometern (Multiscan plus) och läs igenom det stycke som
beskriver hur man använder instrumentet (operation). Absorbansen för dina mätningar
bör ligga mellan 0,100 -1,000 för bäst tillförlitlighet.
3. Gör en seriespädning (se rutan) på standardlösningen (känd koncentration, 10 mM) direkt
i mikroplattan (7 brunnar) och avläs absorbansen vid 540 nm.
4. Identifiera det koncentrationsintervall som lämpar sig för att använda i en
standardkurva.(Jämför dina absorbansvärden och avgör vilka koncentrationer som blir
bäst att använda till en standardkurva). I detta intervall ska ett diagram där koncentration
ritas mot lösningens absorbans bilda en rät linje.
5. Gör om standardspädningen och konstruera en standardkurva, välj fem lämpliga
koncentrationer (se resultatet från punkt 3). Pipettera seriespädning av standarden som
triplikat (trippelprover) i mikroplattan. Seriespäd den okända KMnO4 lösningen till minst
3 brunnar, gör även det som triplikat.
17
6. Bestäm den okända lösningens koncentration med hjälp av standardkurvan. Lämplig
koncentration är när den okända lösningens koncentration sammanfaller med det linjära
koncentrationsintervallet på standardkurvan.
Seriespädning:
Du tillsätter 100 µl avjoniserat H2O i ett antal brunnar (ex 6 brunnar) i en
mikroplatta. Du tar sedan 100 µl av den lösning du skall späda och tillsätter till
första brunnen med H2O och blandar upp och ned 3 x med pipetten. Sug sedan
upp 100 µl av lösningen och flytta över till nästa brunn och upprepa proceduren.
I sista provspädningen suger du upp 100 µl som du kastar. Om du som i detta fall
startar med en 10 mM lösning så kommer koncentrationen att halveras för varje
spädning. Använd den bifogade mallen över mikroplattan för att beskriva hur du
späder dina standarder och prover.
Gör först en provspädning med enkelprover av lösningen med känd koncentration
och avläs absorbanse, se punkt 3. Gör sedan en standardkurva med triplikat och
beräkna med hjälp av kurvan det okända provets koncentration.
Mall för 96-brunnars mikroplatta
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Beräkningar i Excel
1. Gör en tabell och skriv in alla mätvärden för standardlösningen med känd koncentration. En
kolumn för koncentration och 3 parallella kolumner för de avlästa absorbansvärdena för
respektive koncentration.
2. Beräkna medelvärde för absorbansvärdena i ytterligare en kolumn och gör ett punktdiagram
där koncentration (x-axel) plottas mot medelvärdet för absorbansen (y-axel).
3. Infoga en linjär trendlinje (högerklicka på ”punktserien” i diagrammet).
18
4. Formatera trendlinje och infoga ekvation (högerklicka på trendlinjen och gå till fliken
(alternativ)).
5. Beräkna koncentrationen från absorbansvärdena för varje mätning av det okända provet.
Använd formeln i diagrammet och beräkna sedan medelvärde och standardavvikelse för
koncentrationen av det okända provet. Glöm ej multiplicera med spädningsfaktorn.
1,2
y = 0,3x - 0,2
Absorbans 540 nm
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
1
2
3
KMnO4 (mM)
4
5
Figur 1. Exempel på hur en standarkurva med linjär trendlinje och ekvation kan se ut i Excel
Att redovisa
Skriv en rapport enligt ”Anvisningarna” där följande delar ingår
Försättsblad
Introduktion Kom ihåg syftet i slutet av stycket
Material och metod
Resultat Absorbansvärden och beräkningar i tabellform och diagram. Kom ihåg tabell- och
figurtexter. Beskrivande statistik (medelvärde och standardavvikelse)
Diskussion Kortfattad där ni kommenterar era resultat
Bilaga Riskbedömning KMnO4
19
Laboration 5
pH-meter och buffertlaboration
Syfte
 Du ska lära dig att hantera och kalibrera en pH-meter, kunna tillverka en fosfatbuffet med
visst pH samt få förståelse för hur en buffert verkar. Du ska även lära dig syra-bas
titrering samt presentera erhållna resultat.
Mål






Kunna hantera och kalibrera en pH-meter
Känna till principen för en pH elektrod
Kunna tillverka en buffert och göra spädningar
Förstå vad som menas med buffertkapacitet
Kunna utföra en syra-bas titrering
Kunna presentera resultat i tabell och diagram
Bakgrund
Kroppens livsprocesser är i stor grad beroende av pH i kroppsvätskorna. Många biologiska
molekyler innehåller svagt sura och basiska grupper. Ett förändrat pH påverkar laddningarna på
sådana grupper, vilket ofta har stor effekt på deras funktion. Exempelvis är ett enzyms aktivitet
helt beroende av pH. Det är därför viktigt att man i biokemiska experiment har rätt pH-värde
och att detta hålls konstant, vilket kan göras med hjälp av buffertar.
Många kroppsvätskor har ett pH omkring 7 med undantag av magsaften vars pH~2. Blodets pH
är normalt ca 7,4. Om blodets pH sjunker under pH 6,8 eller stiger över pH 7,8 riskerar vi att dö.
Det finns flera buffertsystem som verkar i kroppen tex karbonat/bikarbonatsystemet och fosfatsystemet.
pH är lika med exponenten med ombytt tecken, när vätejonkoncentrationen skrivs som
tiopotens.
 H3O+ = 1 10-pH M
Exempel:  H3O+ = 1 10-8 M ger pH 8
pH är den negativa 10-logaritmen för en lösnings koncentration av vätejoner, H+ (egentligen
H3O+, oxoniumjoner). Dvs en lösning med pH 1,0 har en vätejonkoncentration på 0,1 M och en
lösning med pH 3,0 en vätejonkoncentration på 0,001M (1 mM).
pH-elektroden och pH-metern
En lösnings pH mäts med en pH-elektrod kopplad till en pH-meter. pH-metern är i princip
en voltmeter, som mäter potentialdifferensen mellan två elektroder, glaselektroden (känslig
mot H+-joner) och en yttre referenselektrod. Den vanliga pH-elektroden sk kombinationselektrod
innehåller både en glas- och en referenselektrod. När en kombinationselektrod sänks ner i en
provlösning fås en elektrisk förbindelse mellan elektroderna genom en liten glasfilterskiva
20
(keramisk plugg). Därför är det viktigt att elektroden sänks ner så mycket att keramikpluggen
täcks av provlösningen. Glaselektroden ändrar sin potential efter lösningens H+-koncentration,
medan referenselektroden alltid uppvisar samma potential. Potentialskillnaden i glaselektroden är
proportionell mot H+ koncentrationen (och därmed lösningens pH) och är ca 59.1 mV / pH-enhet
vid 25˚ C.
Glaselektroden består av ett rör av isolerande glas på vilket det nedtill finns ett tunt (0,1mm),
kulformat glasmembran, som har en mycket speciell kemisk sammansättning. Glasmembranet är
mycket känsligt och ska hanteras varsamt. Glaskulan är fylld med en viss buffert med ett konstant
pH, beroende på modell. Ned i denna lösning sticker en sk innerelektrod (inre referenselektrod),
som utgörs av en klorerad silvertråd, som sedan via en platinatråd och kabel är ansluten till
voltmetern (pH-metern).
När glaselektroden doppas ned i en provlösning, fås över glasmembranet en potentialskillnad
som är direkt proportionell mot skillnaden i pH mellan de båda sidorna om glasmembranet, d v s
provlösningens pH respektive pH i lösningen inuti glaskulan.
Vid pH 7.0 uppvisar de flesta pH-metrar det sk iso-pH't, vilket innebär att potentialskillnaden
mellan glas- och referenselektroden är 0. Vid pH över iso-pH visar pH-metern negativ potential
och vid pH under iso-pH visar pH-metern positiv potential.
Provlösningen är vanligen baserad på vatten, som med salter bildar en elektrolyt med förmåga att
leda ström. Om joner saknas, kan inte lösningen leda ström och man kan då heller inte mäta pH.
Detta gör det vanskligt att mäta pH i organiska lösningar eller vattenlösningar med låg jonstyrka.
Man får otillförlitliga resultat. Till lösningar med låg jonstyrka, t ex dricksvatten, brukar man
tillsätta sk hjälpelektrolyt i form av KCl-lösning. Denna brukar endast marginellt påverka det
erhållna pH-värdet.
Temperaturberoende
Elektrodens potential är beroende av temperaturen och måste därför kalibreras vid samma
temperatur som den skall användas vid. Detta medför att lösningen man skall mäta pH i bör ha
samma temperatur som de lösningar som man kalibrerat pH elektroden med.
Observera att även pH på referenslösningarna, som används vid kalibreringen, kan varierar med
temperaturen, se flaskornas etikett.
Skötsel av pH-elektroden
En pH-elektrod bör skötas varsamt för att man skall kunna lita på sina mätvärden.
o Var rädd om glaskulan och glasmembranet - det är ömtåligt! Låt därför aldrig kulan
komma i kontakt med kärlens väggar eller botten. Om du använder magnetomrörare så se
till att magnetloppan inte hoppar omkring i lösningen eller på annat sätt kan komma i
kontakt med membranet.
o Se till att det finns ordentligt med elektrodlösning (tex 3M KCl-lösning, beroende på typ
av elektrod) i referenselektroden. Denna lösning kan bytas ut.
o Se till att elektroden när den inte används står i förvaringslösning (tex 3M KCl). Förvara
inte elektroden i dest. vatten, kranvatten eller pH referensbuffert.
o Se till att det inte finns luftblåsor i den inre lösningen i kombinationselektroden.
Den viktigaste mätningen är kalibreringen av pH-elektroden
Vid mätning av pH måste först mätsystemet kalibreras. Eftersom ytan på glasmembranet
påverkas både av att elektroden står oanvänd men även när den används så måste glaselektroden
kalibreras. Kalibreringen leder till ett mer tillförlitligt samband mellan mV och pH.
Kalibreringen görs mot buffertlösningar med kända pH värden. Ofta görs tvåpunktskalibrering
dvs mot två lösningar pH 7 och pH 4 alternativt pH 10 beroende om man skall mäta pH på sura
21
eller basiska lösningar. Välj inte kalibreringsbuffertar som ligger mer än 3 pH-enheter från
varandra. Använd alltid fräscha buffertar (spara inte från en dag till nästa).
De flesta elektroder är byggda så att 0 mV mellan glaselektrod och referenselektrod motsvarar
pH 7. Börja därför alltid med pH 7 för att nollställa instrumentet och för att justera för avvikelser
i elektroden. Kalibrera vid samma temperatur som den temperatur provet ska mätas vid.
Inställning av pH-metern – två punktskalibrering
Skölj elektroden med avjonat eller destillerat vatten. Låt den sista vattendroppen, som vanligen
hänger kvar på elektroden, sugas upp av mjukt papper (Kleenex).
Sätt ned elektroden i referenslösningen med pH 7.0. Mät temperaturen och ställ in rätt
temperatur på pH-metern. Följ pH-meterns manual för att genomföra kalibreringen. I och med
denna 2-punkts kalibrering ändras lutningen ("slope") på linjen mellan faktiskt pH-värde och
skalutslag (eg mV). pH-metern mäter en potentialdifferens mellan glas- och referenselektroden.
Buffert och buffertkapacitet
En buffertlösning är en lösning vars pH är relativt konstant då en liten mängd syra eller bas
tillsätts. Buffertlösningen består av två komponenter. De ena komponenten ska kunna
neutralisera en liten mängd bas och den andra komponenten ska kunna neutralisera en liten
mängd syra. De två komponenterna får inte neutralisera varandra (tex stark syra och stark bas).
En svag syra och dess konjugerande bas kan användas som buffertlösning (t.ex. ättiksyra och
natriumacetat).
H2O + HA  H3O+ + AJämviktskonstanten för den svaga syran kan uttryckas som:
Ka= H30+]A- /[HA]
Logaritmering ger:
pH= pKa + log [ A-]/ [HA
Om [HA  = [A-] är pH = pKa
En buffertlösning påverkas obetydligt av:
o Utspädning
o Måttlig tillsats av syra
o Måttlig tillsats av bas
När man blandar en buffert finns i praktiken två alternativ.
o Tillsätt de två olika buffertkomponenterna enligt tabell 1, sida 15.
o Beräkna den massa som behövs av den svaga syra alternativt den svaga basen. Lös upp
kemikalien i vatten och ställ pH med en bas alternativt en syra tills man får rätt pH.
Buffertkapaciteten definieras som buffertens förmåga att motstå pH-förändringar vid tillsats av
syra eller bas. Vid den punkt där pH =pKa har bufferten den största buffertkapaciteten.
Förberedelse
Teorigenomgång gällande pH-elektrod och tillverkning av buffert kommer att ges före
laborationen. Gör de beräkningar som behövs för att kunna bereda lösningarna, se moment 2
innan laborationen. Molmassan för de kemkalier ni kommer använda vid laborationen är för
Na2HPO4 ∙ 12 H2O: 358,14 g/mol och för NaH2PO4 ∙ 2 H2O: 156,01 g/mol. Skriv en
riskbedömning.
22
Utförande
Laborationen genomförs i stationssystem. Stationerna omfattar fyra olika moment och alla
grupper ska göra alla moment men i vilken ordning skiftar.
Moment 1: pH-metern
Läs manualen till Mettler-Toledo MP220, så ni kan hantera pH-metern. Gör en två-punkts
kalibrering - följ instruktionsmanualen.
Mät därefter pH på lösningarna; 0.3 M HAc och 0.1 M Na-acetat (finns färdigberedda).
Beräkna det teoretiska pH-värdet på lösningarna och jämför med det uppmätta pH-värdet.
Förklara i rapporten principen för pH-metern och kalibrering.
Moment 2: Lösningsberedning
Tillverka 100 ml 0.2 M Na2HPO4 och 100 ml 0.2 M NaH2PO4
Gör 0.1 M fosfatbuffert pH 7.2 enligt tabell 1.
Moment 3: Jämförelse av pH-förändringar i en buffertlösning i förhållande
till vatten.
Material: 0.1 M fosfatbuffert pH 7.2 (se moment 2) avjoniserat vatten samt indikatorer.
Överför 25 ml fosfatbuffert till en bägare, tillsätt någon droppe av indikatorn bromfenolblått.
Droppa från en byrett 0.1 M HCl till färgomslag. Ange antalet milliliter som åtgår.
Överför 25 ml fosfatbuffert till en bägare, tillsätt någon droppe av indikatorn fenolftalein.
Droppa från en byrett 0.1 M NaOH till färgomslag. Ange antalet milliliter som åtgår.
Upprepa samma procedur men med vatten i stället för buffert.
Sammanfatta era resultat och besvara frågorna (skrivs som bilaga).
Frågor:
1. Vad menas med en buffert?
2. Vad är en indikator och inom vilka pH intervall ändrar bromfenolblått och fenolftalein, färg?
3. Ange vätejonkoncentration i blod vilkens pH är 7,4?
Moment 4: Bestämma molekylmassan hos en syra med hjälp av titrering
Uppgift: Två syrors (en en-protonig och en två-protonig) molekylmassor ska bestämmas
genom titrering med NaOH-lösning av känd koncentration (ni blir tilldelade en av syrorna).
Redogör kortfattat hur man gör en titrering.
23
OBS!
 Hantera syrorna och NaOH försiktigt.
 Använd skyddsglasögon och handskar.
De okända syrorna finns utspädda som färdiga lösningar i flaskor märkt A resp C.
Utförande: Till en E-kolv av lämplig storlek sätts 10,00 ml av den utspädda, okända syran
(titrand) och dessutom 2-3 droppar av indikatorn fenolftalein. Från en 25 ml byrett tillsätts
0,100 M NaOH (titratorn) till ekvivalenspunkten är nådd. Upprepa titreringen och gör
3-4 titreringar per syra. Från de erhållna volymerna beräknas molekylmassorna och därefter
anger ni vilken av de föreslagna syrorna ni anser ni har.
För att beräkna molekylmassan utgå från en reaktionsformel och titta på ekvivalensförhållandena.
HA + OH-
Ex:
A- + H2O (en-protonig syra)
Information om de två syrorna A och C
Enprotonig syra:
Syra A
Vätska med densiteten 0.993 g/ml
För beredning av 1 liter syra A har 15 ml koncentrerad syra A använts.
Tvåprotonig syra:
Syra C
Fast ämne. Båda de "sura" protonerna har avgetts när indikatorn ändrar färg.
Varje syra C - molekyl binder två vattenmolekyler.
För beredning av 1 liter syra C har 11,1 g syra C använts.
Diskutera och jämför era värden med tabellvärdet för några av de nedan angivna syrorna.
Enprotoniga syror
o
o
o
o
Myrsyra
Smörsyra
Ättikssyra
Propionsyra
Tvåprotoninga syror
o
o
o
o
Bärnstenssyra
Oxalsyra
Malonsyra
Adipinsyra
Att redovisa
Skriv en rapport enligt ”Anvisningar för arbetsböcker och laborationsrapporter”
Försättsblad
Introduktion där syftet skrivs i slutet
Material och metod (kortfattat)
Resultat med tabeller och figurer ev uträkningar visas i bilaga
Diskussion kommentera era resultat
Bilaga Riskbedömning
24
Tabell 1. Buffertlösningars sammansättning för olika pH (vid 23°C)
1. Glycin-HCl: 0,1 M; pH 1,2-3,2
x ml 0,1 M HCl+0,1 M glycin till 100 ml
pH 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2
x 85,4 71,1 62,0 54,7 48,1 42,4 36,4 30,4 24,0 17,9 12,0
2. Citrat-HCl, 0,1 M; pH 1,2-4,8
x ml 0,1 M HCl+0,1 M Na-citrat till 100 ml
pH
x
pH
x
1,2
88,9
3,4
54,6
1,4
80,7
3,6
51,6
1,6
75,4
3,8
48,1
1,8
71,8
4,0
44,0
2,0
69,4
4,2
38,9
2,2
67,4
4,4
32,1
2,4
65,5
4,6
21,1
2,6
63,6
4,8
12,0
2,8 3,0 3,2
61,7 59,7 57,3
3. Acetat, 0,1M; pH 3,6-5,6
x ml 0,2 M ättiksyra + 0,2 M Na-acetat till 100 ml+ 100 rnl vatten
pH
x
3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6
92,6 88,0 82,0 73,6 61,0 51,0 40,0 29,6 21,0 17,6 9,6
4. Succinat, 0,05 M; pH 4,0-6,0
25 ml 0,2 M bärnstenssyra + x ml 0,2 M NaOH+ vatten till 100 ml
pH
x
4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0
10,0 13,3 16,7 20,0 23,5 26,7 30,3 34,2 37,5 40,7 43,5
5. Fosfat, 0,1 M; pH 5,7–8,0
x ml 0,2 M Na2HPO4 + 0,2 M NaH2PO4 till 100 ml + 100 ml vatten
pH
x
pH
x
5,7
6,5
6,9
55,0
5,8
8,0
7,0
61,0
5,9
10,0
7,1
67,0
6,0
12,3
7,2
72,0
6,1
15,0
7,3
77,0
6,2
18,5
7,4
81,0
6,3
22,5
7,5
84,0
6,4
26,5
7,6
87,0
6,5
31,5
7,7
90,5
6,6
37,5
7,8
91,5
6,7
43,5
7,9
93,0
6,8
49,0
8,0
94,7
6. Veronal-HCl, 0,1 M; pH 7,0-8,4
x ml 0,1 M HC1+0,1 M veronal-Na till 100 ml
pH
x
7,0
46,4
7,2
44,6
7,4
41,8
7,6
38,4
7,8
33,8
8,0
28,4
8,2
23,1
8,4
17,9
7. Tris, 0,05 M; pH 7,2-9,0
50 ml 0,2 M tris(hydroximetyl)aminometan + x ml 0,2 M HCl + vatten till 200 ml
pH
x
7,2
44,2
7,4
41,4
7,6
38,4
7,8
32,5
8,0
26,8
8,2
21,9
8,4
16,5
8,6
12,2
8,8
8,1
9,0
5,0
25