Transcript Partiklar i utandningsluft

Partiklar i utandningsluft
– ny metod för att monitorera
inflammation i de små luftvägarna
ANNA-CARIN OLIN, Göteborgs universitet
S A MMA NFAT T N I NG
Inflammation i de små luftvägarna
förekommer vid alla typer av astma,
även mildare former, och är mycket
vanligare än man tidigare känt till.
Inflammation i de små luftvägarna är
också förenad med svårbehandlad
astma och ökad förekomst av försämringstillstånd. Vi vet fortfarande
inte hur vi skall förebygga att patienter
med astma utvecklar en icke-reversibel luftvägsobstruktion ochkunskapen
om sådan inflammation är mycket
begränsad.
På Arbets- och miljömedicin vid
Göteborgs universitet har vi utvecklat
en ny teknik som möjliggör analys av
vätskeskiktets sammansättning i de
små luftvägarna; insamling och analys
av partiklar i utandningsluft (Particles
in exhaled Air, PExA). Metoden bygger
på insamling och analys av de partiklar
(PEx) som bildas från detta vätskeskikt.
Här redovisas result från våra explorativa studier. Resultaten tyder på att
PExA metoden kan användas för att
kartlegga förändringar i sammansättning av fosfolipider och av surfaktant
protein A i de små luftvägarna vid olika
luftvägssjukdomar, vilket man inte
kunnat studera tidigare. På sikt hoppas
vi att metoden kan bidra till en bättre
karakterisering av olika typer av astma
till en mer individualiserad behandling
och nya behandlingsmöjligheter.
V
ården av patienter med astma
har förbättrats radikalt de
senaste 30 åren, mycket tack
vare effektivare behandling med
inhalationssteroider. Men fortfarande
är det en hel del patienter som har
symptom och vi vet fortfarande inte
hur vi skall förebygga att patienter
med astma utvecklar en icke-reversibel luftvägsobstruktion. Resultaten
från West Sweden Asthma Study,
en randomiserad befolkningsstudie,
visar att drygt 40 % av personer med
astma har delvis okontrollerad- och
ca 18 % har okontrollerad astma (1).
Orsakerna är förstås många, men
otillräcklig och felaktig behandling
är förmodligen viktiga orsaker.
Här skulle ett objektivt test för att
mäta sorten och graden av luftvägsinflammation vara till stor nytta.
Inflammation i de små luftvägarna
förekommer vid alla typer av astma,
även mildare former, och är mycket
vanligare än man tidigare känt till (2).
Inflammation i de små luftvägarna är
också förenad med svårbehandlad
astma och ökad förekomst av försäm-
ringstillstånd (3). Vid olika exponeringar, både i arbetsliv och i yttre miljö,
drabbas ofta också just de små luftvägarna (4). Men kunskapen om inflammation i de små luftvägarna är
mycket begränsad; man vet mycket
lite om hur luftvägsinflammation varierar över tid, vilka faktorer som leder
till att inflammationen läker ut eller
förvärras, eller dess betydelse för
prognos och effekt av behandling.
Att epitelet och det vätskeskikt
som täcker epitelet har viktiga funktioner för att skydda oss mot inandat
material och patogener står dock
helt klart (5).
Partiklar i utandningsluft
På Arbets- och miljömedicin vid
Sahlgrenska akademin i Göteborg har
vi utvecklat en ny teknik som möjliggör analys av vätskeskiktets sammansättning i de små luftvägarna;
insamling och analys av partiklar i
utandningsluft (Particles in exhaled
Air, PExA). Metoden bygger på att vi
samlar in och analyserar de partiklar
Anna-Carin Olin, adjungerad professor och
forskargruppledare.vid Arbets- och Miljömedicin, Sahlgrenska Akademin, Göteborgs
universitet
kontaktadress:
Anna-Carin Olin
Arbets- och miljömedicin
Sahlgrenska Akademin
Göteborgs universitet
Box 414
SE-405 30 Göteborg
[email protected]
34 ALLERGI I PRAKX SIS 4/2014
FIGUR 1. Lungblåsa
med surfaktant
På Arbets- och miljömedicin vid Sahlgrenska akademin har det utvecklats en ny teknik som möjliggör analys av vätskeskiktets
sammansättning i de små luftvägarna med hjälp av insamling av partiklar i utandningsluft (Particles in exhaled Air, PExA). Metoden kan
bidra till en bättre karakterisering av olika typer av astma och till en mer individualiserad behandling. FOTO. COLORUBOX.COM
(PEx) som bildas från detta vätskeskikt. När de allra minsta luftvägarna
stänger sig och sedan öppnar sig
igen, vid in- respektive utandning, så
spricker detta vätskeskikt upp och
små partiklar (vätskedroppar) bildas.
Vi har visat att dessa partiklar
framförallt innehåller surfaktant som
bildas i alveolerna (SE FIGUR 1), och dess
viktigaste uppgifter är att minska
ytspänningen och hålla luftvägarna
öppna men också att oskadliggöra
inandat material. Det sker ett kontinuerligt utbyte av material från epitelcellslagret i luftvägarna till detta
vätskeskikt och vid inflammation i
de små luftvägarna förändras dess
kemiska sammansättning. Analys
av partikelinnehållet kan därför bidra
till att öka kunskapen om och bättre
karakterisera inflammation i de små
luftvägarna. På sikt hoppas vi förstås
att metoden kan användas för att
bättre belysa vilken typ av inflammation som föreligger och hjälpa till att
optimera behandling och monitorering av astma.
Surfaktant
Surfaktant är första linjens försvar
mot allt inandat material och patogener (6) och innehåller bl a lungspecifika proteiner som har stor betydelse
för immunförsvaret, bl a för antigenpresentation, fagocytos och reglering
av lymfocytaktivering (7, 8). Dessa
utgör en länk mellan det ospecifika
och humorala immunförsvaret.
Surfaktant-protein A (SP-A) är det
vanligaste lungspecifika proteinet
(SE FIGUR 2 PÅ SIDAN 36), och har fram tills
nu främst studerats i bronkoalveolärt lavage (BAL). SP-A halterna har
visats sjunka vid många typer av
sjukdomar i luftvägarna (9). Detta kan
vara av stor betydelse då lägre halter
av Sp-A är förenat med sämre försvar
mot både virus- (10) och bakteriella
infektioner. Genetiska studier indikerar också Sp-A’s betydelse. Det
finns två funktionella gener för Sp-A;
Sp-A1 och Sp-A2 och de olika varianterna har troligen olika funktion
(11). Pettigrew et al har påvisat en
tre gånger ökad risk för «persistent
wheeze», dvs bestående pip i bröstet,
hos 220 barn med en polymorfi av
Sp-A1 genen (12). I en fall-kontroll
studie har man funnit en Sp-A1 allell
som associeras med 7.4 ggr högre
risk för KOL (13).
Vad innehåller de partiklar vi
samlar in i utandningsluften?
Med PExA metoden samlar vi in
oerhört små mängder material,
ca 120 ng, det är 0,000 000 120
gram, och det behövs därför oerhört
känsliga analyser. I de första studierna av partiklarna använde vi en
mycket känslig metod för ytanalys,
«Time-of-flight secondary ion mass
spectrometry (TOF-SIMS)», där provet
inte behöver bearbetas före analys.
Resultaten visade att partiklarna
framför allt består av fosfolipider
(ca 80 %), dvs fetter som är huvudbeståndsdelen i surfaktant men
också bygger upp alla cellmembran i
kroppen. Den vanligaste fosfolipiden
ALLERGI I PRAK X SIS 4/2014
35
➥
Bakterier och virus
SP-A molekyl
Alveol
FIGUR 2. Surfakant protein A; struktur
och funktion (Anpassad efter Palaniyar,
N (2001). Comparative Biochemistry
and Physiology and Molecular and
Integrative Physiology)
Globulära
domäner
SP-A binder till
bakterier och virus
&
inhiberar
tillväxt
Flexibla
regioner
SP-A fungerar
som opsonin:
ökar fagoctosen
Knick
SP-A förhindrar utmognaden av dendritiska celler
och bildningen av inflammatoriska mediatorer
är dipalmityolfosfatidylcholin (DPPC),
men vi hittade också fosfatidylglycerol, som hos människa endast
påträffas just i surfaktant (14).
Ungefär 20 % av partiklarna består
av proteiner. Vi har genomfört en
explorerande proteomikstudie för att
kartlägga proteininnehållet i PEx hos
friska (15). PEx från 100 liter utandningsluft innehåller ca 150 ng
material varav ca 33 ng är protein.
Vi identifierade 124 olika proteiner
varav majoriteten var extracellulära.
En relativ fördelning av de identifierade proteinerna framgår av figur 3.
80 % av dessa proteiner har tidigare
påvisats i bronko-alveolärt lavage.
Det är intressant att så mycket som
29 % av proteinerna utgörs av immunoglobuliner. Det vanligaste lungspecifika proteinet är Surfaktant Protein
A (SP-A).
Surfaktant protein A i PEx
Fosfolipider i PEx
Vi har anpassat och validerat en
ELISA metod för analys av SP-A i PEx
och visat en mycket god detekterbarhet och låg inom-individuell variation
(16). Vid två mättillfällen inom en
vecka varierade SP-A halterna inom
samma individ med <13 %. Koncentrationen av SP-A var starkt korrelerad
till antalet utandade partiklar. Även
totalmängden utandade partiklar
skiljde sig mycket mellan individer.
Preliminära data från våra första
studier visar att den relativa koncentrationen av SP-A i PEx sjunker vid
svårare former av astma och sänkta
halter är också förenade med mer
avstängda luftvägar. Däremot tycks
inte SP-A halterna påverkas vid mild
astma, ej heller under pollensäsong
hos personer med pollenastma.
För att undersöka om sammansättningen av fosfolipiderna i PEx
förändras vid astma har vi i en pilotstudie undersökt 15 rökfria personer
med astma (enl GINA) och 11 friska
kontrollpersoner (17). Patienter med
astma andades ut betydligt färre antal
partiklar än kontrollerna (p = 0,03),
vilket kan tyda på mer avstängda
luftvägar. Vi analyserade PEx-proverna med den tidigare nämnda
«Time-of-flight secondary ion mass
spectrometry (TOF-SIMS)» metoden.
Eftersom vi inte visste vilka förändringar vi kunde förvänta oss och
dessutom fick oerhört stora datamängder använde vi oss av multivariat statistisk analys och diskriminant-analys för att identifiera de
största skillnaderna i massspektra
mellan personer med astma och
friska kontroller. Personerna med
astma hade högre halter av dipalmityolfosfatidylcholine (DPPC)
och fosfatidylglycerol. Molekylära
joner av fosfolipider var också
vanligare i alla prover från patienter med astma jämfört med
friska, se figur 4. Förhållandet
mellan omättade och mättade
fosfolipider var signifikant lägre i
prover från patienter med astma
(0,25 vs. 0,35, p = 0,036).
Detta var en liten explorativ studie,
men den tyder trots allt på att PExA
metoden kan användas för att undersöka förändringar av fosfolipidsam-
FIGUR 3. Relativ proteinfördelning i PEx.
SpA (11.6%)
SpB (0.6%)
SpC (0.2%)
CC16 (3.5%)
Albumin (25%)
Transferrin (3.8%)
Alpha-1-antitrypsin (1.8%)
Immunglobulins (29%)
Others (24.5%)
36 ALLERGI I PRAKX SIS 4/2014
734.6
PC 32:0+H
0,025
m/z 650.4
PC fragment
0,020
m/z 756.6
PC 32:0+Na
m/z 772.6
PC 32:0+K
m/z 706.6
PC 30:0+H
0,015
0,010
Astma
0,005
0,000
-0,005
Friska
-0,010
610
620
630 640
650 660 670
680
690 700
710
720 730 740
750 760 770 780 790
800
810 820 830
m/z
FIGUR 4. Mass-spektra sorterade för att identifiera de viktigaste skillnaderna mellan friska och personer med astma. Ämnen (egentligen
den specifika massan) med peak uppåt är vanligare hos personer med astma, ämnen med peak neråt vanligare hos friska.
mansättning i de små luftvägarna
vid olika luftvägssjukdomar, vilket
man inte kunnat studera tidigare.
Hur bildas partiklarna och vad speglar antalet partiklar?
Huvudparten av de utandade partiklarna bildas vid luftvägsöppning,
dvs. då avstängda luftvägar öppnar
sig (18), och andelen partiklar som
bildas verkar vara ett mycket känsligt
mått på just luftvägsöppning. Variationen i mängden utandade partiklar
mellan olika individer, även friska, är
dock stor. Hos friska bildas alltså
partiklarna i de allra minsta luftvägarna, men man vet mycket lite om
luftvägsstängning och var den sker
vid astma, förmodligen kan luftvägstängningen då också ske lite mer
proximalt. Vi har sett att astmatiker
bildar färre partiklar under pollensäsong än utanför säsong, trots att det
inte fanns någon skillnad i spirometri.
Vi tolkar detta som att fler små luftvägar är avstängda under pollensäsong, men att detta inte reflekteras
av spirometriundersökning. I en pilotstudie på astmatiker har vi också
sett att antalet partiklar som bildas
minskar vid ojämn gasdistribution,
speciellt vid obstruktion av de allra
minsta s.k. acinära luftvägarna.
Slutsatser
PexA-metoden ger en unik möjlighet
att samla in outspätt material från
de allra minsta luftvägarna och
har därför stor potential för att öka
kunskapen om luftvägsinflammation
speciellt i de små luftvägarna. Innehållet i de utandade partiklarna
överensstämmer i stort med surfaktant, och vi har visat att sammansättningen av fosfolipider i PEx
förändras vid astma. På sikt hoppas
vi att metoden kan bidra till en bättre
karakterisering av olika typer av
astma och kan bidra till en mer
individualiserad behandling och
förhoppningsvis även nya behandlingsmöjligheter. Vi hoppas också
genom förenklad insamlingsmetod
och utveckling av sensormetodik,
möjliggöra enkel tillämpning av
metoden i kliniska och epidemiologiska sammanhang.
REFERENSER
1. Mincheva, R., et al., Frequent cough
in unsatisfactory controlled asthma –
results from the population-based West
Sweden Asthma study. Respir Res, 2014.
15: p. 79.
2. Usmani, O.S., Small airways dysfunction
in asthma: evaluation and management to
improve asthma control. Allergy Asthma
Immunol Res, 2014. 6(5): p. 376–88.
3. van den Berge, M., et al., Treatment of
the bronchial tree from beginning to end:
targeting small airway inflammation in
asthma. Allergy, 2013. 68(1): p. 16-26.
4. de Jong, K., et al., Occupational exposure to
vapors, gases, dusts, and fumes is associated
with small airways obstruction. Am J Respir
Crit Care Med, 2014. 189(4): p. 487–90.
5. Holgate, S.T., The airway epithelium is central
to the pathogenesis of asthma. Allergology
international : official journal of the Japanese
Society of Allergology, 2008. 57(1): p. 1–10.
6. Griese, M., Pulmonary surfactant in health
and human lung diseases: state of the art.
Eur Respir J, 1999. 13(6): p. 1455–76.
  7. Hohlfeld, J.M., V.J. Erpenbeck, and N.
Krug, Surfactant proteins SP-A and SP-D
as modulators of the allergic inflammation
in asthma. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology,
2002. 70(5): p. 287–92.
  8. Enhorning, G., Surfactant in airway disease.
Chest, 2008. 133(4): p. 975-80.
  9. Poynter, S.E. and A.M. LeVine, Surfactant
biology and clinical application. Crit Care
Clin, 2003. 19(3): p. 459–72.
10. Barreira, E.R., A.R. Precioso, and A. Bousso,
Pulmonary surfactant in respiratory
syncytial virus bronchiolitis: The role in
pathogenesis and clinical implications.
Pediatric pulmonology, 2010.
11. Huang, W., et al., Human SP-A genetic
variants and bleomycin-induced cytokine
production by THP-1 cells: effect of ozoneinduced SP-A oxidation. Am J Physiol
Lung Cell Mol Physiol, 2004. 286(3):
p. L546–53.
12. Pettigrew, M.M., et al., Respiratory
symptoms among infants at risk for asthma:
association with surfactant protein A
haplotypes. BMC medical genetics, 2007.
8: p. 15.
13. Guo, X., et al., Surfactant protein gene
A, B, and D marker alleles in chronic
obstructive pulmonary disease of a Mexican
population. The European respiratory
journal: official journal of the European
Society for Clinical Respiratory Physiology,
2001. 18(3): p. 482–90.
14. Almstrand, A.C., et al., Airway monitoring by
collection and mass spectrometric analysis
of exhaled particles. Anal Chem, 2009. 81(2):
p. 662–8.
15. Bredberg, A., et al., Exhaled endogenous
particles contain lung proteins. Clinical
chemistry, 2012. 58(2): p. 431–40.
16. Larsson, P., et al., Surfactant protein
A and albumin in particles in exhaled
air. Respiratory medicine, 2012. 106(2):
p. 197–204.
17. Almstrand, A.C., et al., TOF-SIMS analysis of
exhaled particles from patients with asthma
and healthy controls. European Respiratory
Journal 2011. In Press.
18. Almstrand, A.C., et al., Effect of airway
opening on production of exhaled particles.
Journal of applied physiology, 2010. 108(3):
p. 584–8.
◗◗
ALLERGI I PRAK X SIS 4/2014
37
Mätning av kväveoxid (NO) i utandningsluften som mått på
luftvägsinflammation
LEIF BJERMER, Skånes universitetssjukhus, Lund
S A MMA NFAT T N I NG
Exhalert NO (FeNO) används som
komplettering till andra metoder vid
diagnostik och bedömning av astma.
Man rekommenderar också att FeNO
används som instrument för att
monitorera astmaaktiviteten, framförallt i situationer där patienter är
okontrollerade trots insatt inhalationssteroidbehandling (ICS).
Mängd eosinofiler i blod har visat sig
vara en värdefull markör på eosinofil
inflammation, och studier har visat
stark association mellan mängd eosinofiler i sputum och koncentration av NO
i utandad luft. Mätning av FeNO skulle
sålunda kunna vara ett alternativ till
inducerat sputum för att estimera
typ av och grad av underliggande
inflammation vid astma.
FeNO återspeglar i huvudsak en
TH2-driven inflammation, oftast
kopplad till aktivering och rekrytering
av eosinofila granulocyter till
vävnaden. Det flesta med allergisk
astma eller med underliggande atopi
har en TH2-driven inflammation.
Denna del av den astmatiska
inflammationen svarar som regel bra
på inhalerade steroider. Hos patienter
med kvarvarande symptom kan ett
förhöjt FeNO indikera underbehandling, bristande miljökontroll och
bristande följsamhet. Lika viktigt är
det att undvika överbehandling och att
styra ICS-behandlingen dit den har
effekt.
Leif Bjermer Professor, Överläkare
Lung- och Allergikliniken Skånes
Universitetssjukhus, Lund
kontaktadresse:
Leif Bjermer
Lung-och Allergikliniken
Skånes Universitetssjukhus
SE-22185 Lund
[email protected]
38 ALLERGI I PRAKX SIS 4/2014
A
stma definieras som en nedre
luftvägsinflammation associ erad till ett tillstånd av ökad
känslighet i luftvägarna med variabel
lungfunktion. Denna variabla lungfunktion karakteriseras av bronkospasm som leder till luftvägsobstruktion som kan uppkomma
spontant eller efter provokation.
Det kliniska uttrycket är attacker av
dyspné eller hosta, med eller utan
pipande andning. De flesta som
hanterar astma i sin dagliga praxis
är idag eniga om värdet av att kunna
mäta lungfunktion både för att fastställa nivå och för att verifiera
eventuell reversibilitet. Traditionellt
baserar vi också vår bedömning på
symptom samt lungfunktion. Betydligt
färre är det som regelbundet försöker
estimera typ av och grad av underliggande inflammation, trots att det är
denna som driver både sjukdomens
aktivitet och karaktär. Inducerat
sputum, gärna i kombination med
mätning av mängd eosinofiler i blod
har i forskningssammanhang visat sig
vara en värdefull markör på eosinofil
inflammation. I en studie av Green
styrdes behandlingen av grad av
eosinofilökning i sputum där > 3 %
indikerade behov av ökad steroidbehandling och där < 1 % tillät sänkning
av dosen. I en parallell grupp styrdes
behandlingen av patienternas rapporterade symptom samt lungfunktion.
I gruppen som styrdes utifrån sputumeosinofiler kunde man inte bara
reducera steroidbehandlingen hos
flertalet patienter. Man minskade
också risken för exacerbation med
68 % (1). På motsvarande sätt har
eosinofiler i blod visat sig vara
värdefulla som biomarkör för eosinofil
inflammation hos patienter med svår
astma. I en nyligen avslutad studie
med användandet av mepolizumab,
(anti-IL5), fann man en signifikant
behandlingseffekt enbart i gruppen
med blodeosinofiler mer än 150
celler/µl, och det förefaller som att
högre nivåer stärker utsikten till
positiv behandlingsrespons (2).
Nackdelen med inducerat sputum
är att det är en tids- och resurskrävande process. Dessutom får man
inte fram representativa prover hos
mer än c:a 8 av 10 patienter. Blodeosinofilbestämning är enklare att ta.
Nackdelen är att svaret oftast inte
erhålls direkt när patienten är på
mottagningen samt att provet
återspeglar en systemisk inflammation som inte alltid behöver reflektera
vad som sker i luftvägarna.
Utandat kväveoxid (FeNO)
Exhalerat NO (FeNO) skulle kunna
vara ett alternativ till inducerat
sputum och studier har visat på en
stark association mellan mängd
eosinofiler i sputum och koncentration av NO i utandad luft (3). Nyare
data talar för att association mellan
FeNO och eosinofili är indirekt och
inte direkt relaterad till den eosinofila
granulocyten. I en studie med anti-IL5
(mepolizumab) ser man en uttalad
effekt med sjunkande eosinofiler i
blod och sputum medan FeNO-nivåerna förblir oförändrat höga (2).
Motsvarande ser man i en annan
studie med anti IL-13 behandling
(Lebrikizumab), att FENO sjunker
drastiskt medan antalet eosinofiler i