Transcript Bacheloroppgave med vedleggg_GIS

UNIVERSITETET I TROMSØ, INSTITUTT FOR MEDISINS BIOLOGI, BIOINGENIØRUTDANNINGEN Etablere analyse for påvisning av IDH mutasjoner i gliomer Optimalisering av analysens sensitivitet Bacheloroppgave, BIOIN-­‐112 Våren 2011 Kandidatnummer: 6, 9 og 11 03.06.2011 Universitetet i Tromsø Forord Bacheloppgaven er utført ved Molekylærpatologisk laboratorium, seksjon for spesialanalyser ved klinisk patologi, Universitetssykehuset Nord-­Norge. Oppgaven er rettet mot personer med bioingeniørfaglige bakgrunnskunnskaper. Hensikten med oppgaven er å etablere en analyse for påvisning av mutasjon i IDH1genet. Thomas Berg, faglig veileder, hadde ideen til oppgaven. Ved å ta utgangspunkt i vitenskaplige artikler, har vi etablert en ny PCR-­basert analyse med en bedre sensitivitet enn konvensjonell PCR for detektering av IDH1 mutasjon. I arbeidet med oppgaven ved Universitetssykehuset Nord-­Norge, hvor vi har fått god oppfølging Thomas Berg og andre ansatte ved laboratoriet. Det har vært lærerikt og spennende å få lov til å jobbe selvstendig, samt diskutere og velge løsninger. Det praktiske arbeidet med optimalisering av temperatur gav oss motivasjon til å jobbe med utprøving og optimalisering av analyse metoder. Bacheloroppgaven i bioingeniør har gitt oss en innsikt på hvordan yrkeslivet som bioingeniør innen forskning kan være. Vi vil rette en stor takk til Thomas Berg, forsker ved Molekylærpatologisk laboratorium, Universitetssykehuset Nord-­Norge, for hjelp og god veiledning under den praktiske, faglige og skriftlige delen av arbeidet. Vi vil også takke alle ansatte ved Molekylærpatologisk avdeling for hjelp og assistanse under den praktiske delen av arbeidet. Til slutt vil vi takke Universitetslektor i Medisinsk Biologi, Kirsti Hokland, Universitetet i Tromsø, for god veiledning med det skriftlige arbeidet. Universitetet i Tromsø Sammendrag Oppgaven beskriver arbeidet med å etablere en ny analyse ved Molekylærpatologisk laboratorium, Universitetssykehuset Nord-­Norge. Vi har etablert en analyse for påvisning av IDH mutasjon er ved PCR og DNA sekvensering. I tillegg har vi optimalisert PCR for å øke sensitiviteten til analysen. Mutasjonen i IDH1 og IDH2 oppstår sporadisk ved utvikling av gliomer, og finnes i hovedsakelig gliomer av grad II og III. Mutasjonsanalyse av IDH vil kunne være et viktig verktøy i gliom-­
diagnostikken. Metodene som ble brukt i prosjektet er ekstraksjon av DNA, spektrofotometri ved bruk av Nanodrop, PCR, elektroforese og DNA sekvensering. Totalt ble 11 biopsier undersøkt for IDH mutasjon er. Som forventet var de to primære glioblastomen (grad IV) negative, mens 5 av de resterende 9 prøver (grad II/III) var positive for IHD1 mutasjon. Ingen av prøvene var positive for IDH2 mutasjon. Ved å optimalisere PCR ved såkalt CO-­amplification at Lower Denaturation temperature, COLD-­PCR, økte vi sensitiviteten til analysen betydelig. COLD-­PCR er basert på at denatureringstemperaturen under PCR er lavere enn normalt. Dette vil kunne medføre at en anriker PCR-­produkt som inneholder mutasjon slik at de kan detekteres ved påfølgende DNA sekvensering, eventuelt andre deteksjonsmetoder for mutasjonsdeteksjon. Våre forsøk viste at nøye optimalisering av denatureringstemperaturen er kritisk og det er lite rom for avvik. Ved å benytte COLD-­PCR fant vi å kunne påvise mutasjon i prøver som innehold kun 5 % tumorceller, tilsvarende resultat for konvensjonell PCR var 25 %. Etablering av en sensitiv metode for mutasjonsdeteksjon vil være av stor betydning for diagnostikk av prøver som inneholder en lav andel tumorceller. Universitetet i Tromsø Innholdsfortegnelse 1 Introduksjon ...................................................................................................................................... 1 2 Teoretisk bakgrunn ........................................................................................................................... 2 2.1 Gliomer ....................................................................................................................................... 2 2.1.1 Bakgrunn .............................................................................................................................. 2 2.1.2 Hjernetumorer ...................................................................................................................... 2 2.1.3 Gliomer ................................................................................................................................ 3 2.3 IDH 1 og IDH 2 genene ............................................................................................................. 6 2.4 PCR ............................................................................................................................................ 7 2.4.1 Cold PCR ............................................................................................................................. 8 2.5 Elektroforese .............................................................................................................................. 9 2.6 Sekvensering ............................................................................................................................ 10 2 Materiale og metode........................................................................................................................ 11 2.1 Materiale ................................................................................................................................... 11 2.1.1 Prøvemateriale ................................................................................................................... 11 2.1.2 Reagenser ........................................................................................................................... 12 2.2 Metode ...................................................................................................................................... 13 2.2.1 Ekstraksjon av DNA .......................................................................................................... 13 2.2.2 Kvantitering og kvalitet av DNA ....................................................................................... 13 2.2.3 Q-­test .................................................................................................................................. 14 2.2.4 PCR .................................................................................................................................... 15 2.2.5 Elektroforese ...................................................................................................................... 16 2.2.6 Sekvensering ...................................................................................................................... 16 2.2.7 Sekvenseringsanalyse ........................................................................................................ 16 3 Resultat............................................................................................................................................ 17 3.1 Konsentrasjon og renhet ........................................................................................................... 17 3.2 Q-­test ........................................................................................................................................ 18 3.3 Konvensjonell PCR, samtlige prøver ....................................................................................... 18 3.4 Sensitivitetsstudie, samt Cold PCR med 81oC ......................................................................... 19 3.5 Temperaturgradient .................................................................................................................. 22 3.6 Cold PCR, forsøk med lavere denatureringstemperatur ........................................................... 25 3.7 Cold PCR, temperaturforsøk rundt optimal denatureringstemperatur ..................................... 25 Universitetet i Tromsø 3.8 Cold PCR – valg av optimal temperatur: ................................................................................. 27 3.9 Resultater IDH2 ........................................................................................................................ 33 4 Diskusjon ........................................................................................................................................ 33 4.1 DNA konsentrasjon og renhet .................................................................................................. 33 4.2 Q-­test ........................................................................................................................................ 34 4.3 Mutasjonsanalyse ..................................................................................................................... 34 4.4 Optimalisering av Cold PCR .................................................................................................... 35 4.5 IDH2 ......................................................................................................................................... 37 4.6 Feilkilder .................................................................................................................................. 37 5 Avslutning ....................................................................................................................................... 38 6 Kilder .............................................................................................................................................. 39 Universitetet i Tromsø 1 Introduksjon IDH1 og IDH2 mutasjoner har vist seg å kunne være sentrale i utvikling av maligne gliomer i hjernen. Dette er en relativt nyoppdaget mutasjon som er spontan og ikke arvelig. Påvisning av disse mutasjonene kan være til god hjelp innen diagnostikken og god indikasjon på prognosen. I dag er det ikke etablert analyser for detektering av denne type mutasjon ved Universitetssykehuset Nord-­Norge. Klinisk patologi ved Universitetssykehuset Nord-­Norge ønsket å etablere en analyse som kan brukes til å påvise disse mutasjonene. Vi fikk i oppgave å teste ut analysen ved først å studere vitenskapelige artikler om emnet for å se hva andre hadde funnet tidligere. I artiklene beskrives analysene ved bruk av real-­time smeltepunktsanalyse. Vi skal prøve å optimalisere analysemetoden ved bruk av en modifisert konvensjonell PCR, etterfulgt av DNA sekvensering siden avdelingen ikke har tilgang på en real-­time PCR maskin. Vi undersøkte 11 biopsier, med funn av gliom grad II, III og VI som vi ekstraherte DNA fra og undersøkt med hensyn på mutasjon. Teoridelen inneholder bakgrunnsstoff om gliomer, mutasjoner i genene for IDH1 og IDH2, deres funksjon og konsekvenser av slike mutasjoner. Det blir presentert teori om metodene som er brukt, samt beskrivelse av reagensene og prøvematerialet. Under resultatet presenteres DNA kvaliteten til benyttet prøvematerialet og de ulike funnene vi har gjort. Arbeidet mot optimal temperatur er presentert under resultater og diskutert under diskusjon. Diskusjonen omfatter hvorfor vi fikk de resultatene vi fikk og konklusjonen viser løsningen på problemstillingen vår. Vi har avsluttet oppgaven med en kort oppsummering og evaluering av bachelorperioden. Målet med oppgaven: Etablere en analyse for å påvise IDH mutasjoner i tumorceller, samt øke analysens sensitivitet av IDH1 mutasjon ved bruk av Cold PCR. 1 Universitetet i Tromsø 2 Teoretisk bakgrunn 2.1 Gliomer 2.1.1 Bakgrunn Hvert år får rundt 200 norske pasienter over 15 år diagnosen høygradig gliom. Dette er maligne hjernetumorer med et aggressivt vekstmønster. Prognosene for denne kreftformen er dårlige og det finnes ingen kur. Median overlevelse 5 år etter diagnosen er stilt, er ca 6 %. Krefttypen gir ikke bare fysiske symptomer, men også pasientens emosjonelle og psykiske funksjonsnivå blir påvirket. Selv om det ikke finnes noen helbredende behandling, er behandlingen av denne type kreft forbedret de siste årene. En studie fra 2005 viste at en kombinasjonsbehandling av kirurgisk fjerning av tumor og postoperativ strålebehandling ga en forbedret effekt. Antall tilfeller har nesten doblet seg siden 1980. Hovedårsaken er økt levealder i befolkningen. Foreløpig er det bare medfødte genetiske tilstander og sterk stråling som er dokumenterte risikofaktorer for utvikling av hjernetumor, men andre risikofaktorer kan ikke utelukkes. [2] 2.1.2 Hjernetumorer Tumorer i sentralnervesystemet er relativt sjeldne, og er årsaken til 2 % av alle dødsfall forårsaket av kreft. Likevel er disse tumorene klinisk viktige av flere grunner. Hjernetumorer har høy dødelighet, grunnet den maligne naturen hjernetumorer har og deres lokalisasjon. En hver forstørret masse innenfor kraniet vil til slutt medføre død ved å presse på vitale sentre. De fleste tumorer er hos voksne er lokalisert i storehjernen, og den hyppigste svulsttypen er glioblastom. Tumorene hos barn er oftest lokalisert i lillehjernen og hjernestammen. Astrocytom og ependymom noen av de hyppigste tumorene. For barn utgjør hjernetumor 20 % av dødsårsakene ved maligne sykdommer. I aldersgruppen 20-­40 år, er hjernetumor fremdeles blant de vanligste kreftformene, og står for 10 % av dødsfall forårsaket av kreft i denne aldersgruppen. Forekomsten minker ikke med alderen, men blir overskygget av andre mer vanlige kreftformer. [3, 4] Omtrent 50 % av alle hjernetumorer er primære tumorer det vil si kreft fra hjerneceller. Resterende 50 % er metastaser der de vanligste kommer fra primære tumorer i lunge, mamma, tarm eller hud. Siden metastaser står for 50 % av hjernetumorene, må det undersøkes om pasienten har en malign tumor et annet sted i kroppen. [3] 2 Universitetet i Tromsø Intrakranielle tumorer kan histologisk klassifiseres som benigne eller maligne. Maligne tumorer har infiltrerende vekst, hvilket gjør dem vanskelig å fjerne ved hjelp av kirurgi. Benigne tumorer kan helbredes, men ubehandlet vil de forårsake død på grunn av deres plassering intrakranielt. Av den grunn vil histologiske benigne tumorer klassifiseres klinisk som maligne. Maligne tumorer i sentralnervesystemet skiller seg fra andre maligne sykdommer i kroppen ved at de ikke metastaserer. [3] Tumorer i sentralnervesystemer kan klassifiseres etter hvilke celler de oppstår fra. De viktigste tumorene er: [3] x Tumorer fra gliacellene (75 %) x Tumorer fra neurale celler (2 %) x Tumor fra hjernehinnen (15 %) x Tumorer i kranielle eller spinale nerver (5 %) 2.1.3 Gliomer Tumorer som oppstår fra gliaceller kalles gliomer og klassifiseres som astrocytomer, oligodendrogliomer eller ependymomer. Tumorer fra mikrogliacellene, kalles i dag cerebrale lymfomer. WHO klassifiserer de ulike typene ut fra antatt grad av malignitet, der grad I er lavest og grad IV er høyest. Gliomer av grad I, som oftest klassifiseres som benign, kan som regel fjernes kirurgisk og utvikler seg sjeldent til noen høyere grad. Gliomer av grad II og III er maligne og invasive. Disse kan utvikler seg videre til høyere grad og har et dårlig utfall. Gliomer av grad IV, glioblastomer, er meget aggressive og den mest invasive formen med dårligst prognose. Med histologiske funn som basis er det vanskelig å skille sekundere glioblastomer, en tumor som før er blitt definert som lavgradig gliom, fra primære glioblastomer. Astrocytiske gliomer står for ca 80 % av alle gliomer. Oligodendrogliomene og ependymomene er mer sjeldne, og står for ca 10-­20 % av alle gliomer. [3] Astrocytiske gliomer inndeles i to hovedgrupper;; astrocytomer som er lavgradige gliomer og glioblastom som er høygradig gliomer. Ved histologisk undersøkelse, vil astrocytomene ha veldifferensierte astrocytter. Disse tumorene som utvikler seg sakte, viser lav celledeling og ingen anaplastiske celler. Over tid kan de utvikle seg og bli mer maligne og til slutt forme en tumor som 3 Universitetet i Tromsø ikke skiller seg histologisk fra glioblastom. Glioblastom er den mest vanlige tumoren i sentralnervesystemet. Den oppstår hovedsakelig ved 65 års alderen, men også hos yngre mennesker. I det typiske bildet er tumoren irregulær i form og dårlig avgrenset fra vanlig hjernevev. Histologiske studier har vist at glioblastomene består av høyt anaplastiske astrocytter. Cellene har ofte blå kjerne og lite cytoplasma. De kan også bli forstørret og ha en uvanlig form eller være multinukleære med velutviklet cytoplasma. Tumoren er invasiv, hurtig i vekst og har ofte mange blodkar. [3] Oligodendrogliomer er sjeldne gliomer som oppstår hos middelaldrende voksne. Disse tumorene er ofte velavgrenset, blæreaktige og forkalket. Histologisk har tumorene veldifferensierte oligodendrocytter. De kan klassifiseres som lavgradig eller høygradige maligne tumorer, men relasjonen mellom histologiske funn og overlevelse er ikke alltid korrekt. Dette fordi 50 % av oligodendrogliomene består av astrocytter, som ikke nødvendigvisk kan sees i en biopsi. Siden astrocyttene deler seg raskere enn oligodendrocyttene, vil blandede tumorer ha en raskere utvikling enn rene oligodendrogliomer. Slike tumorer kan lettere utvikle seg til glioblastom. Rent differensierte oligodendrogliomer vokser saktere.[3] Ependymomer kommer fra ependymocytter som befinner seg i ventriklene og ryggmargen. Ventrikulære ependymomer er typisk hos barn. Hos voksne finnes ependymomene i ryggmargen. Ved histologiske undersøkelser vil disse ha runde eller elongerte kjerner. De får ofte rosettformer. [3] Ved mistanke om hjernetumor, vil legen først gjøre en psykisk og nevrologisk undersøkelse av pasienten. Diagnosen stilles ved hjelp av CT-­ eller MR-­undersøkelse. Etter lokalisasjon av tumoren, tas det vanligvis en biopsi. Det gjøres en mikroskopisk undersøkelse av biopsien, der diagnosen stilles på bakgrunn av det histologiske bilde. Enkelte ganger kan tumoren være såpass utilgjengelig at vanlig biopsi ikke er mulig. Det kan da gjøres en nålebiopsi med veiledende hjelp av CT eller MRI. [5] Prognosene til gliomer er avhengige av deres lokalisasjon, histologi, alder og tidspunkt for oppdagelse. Glioblastom er ofte fatal, uavhengig av lokalisasjon. Med moderne kirurgi og strålebehandling kan pasienter med denne formen leve opptil 5 år etter diagnosen er satt, men de 4 Universitetet i Tromsø fleste dør fordi tumoren ikke kan fjernes. Median overlevelse for glioblastom er 9,1 måneder og for astrocytom 18,4 måneder i følge kreftregistret for perioden 2000 til 2007 [2]. Oligodendrogliomer og ependymomer har noe bedre prognose, men disse har også høy dødelighet. [3] 2.2 Mutasjon En mutasjon er en permanent forandring i en DNA sekvens. Ved mutasjon i et gen, endres base rekkefølgen til DNAet. Det kan skje ved at basepar byttes, en eller flere baser legges til, eller baser kan forsvinne. Forandringer til et gen vil ofte medføre forandring i aminosyrerekkefølgen til proteinet som genet koder for, enten ved at en aminosyre blir erstattet med en annen eller at en aminosyre forsvinner eller legges til. Proteinet kan som resultat ved en mutasjon få en unormal struktur, og gir igjen endret funksjon, eller et ufunksjonelt protein. Mutasjoner i DNA forekommer kontinuerlig i cellene, men de fleste av dem blir rettet opp av reparasjonsenzymer. Selv om noen av mutasjonene ikke blir rettet opp, trenger de ikke føre til endring i proteinfunksjon. Mutasjoner kan forekomme både i kjønnsceller og somatiske celler. Mutasjoner kan klassifiseres i fire forskjellige hovedtyper;; substitusjon, insersjon, delesjon og translokasjon. En substitusjonsmutasjon er når et basepar blir byttet ut med et annet. Når det gir endring i aminosyren kalles det en missens mutasjon. Fører mutasjonen til et stoppkodon kalles det en nonsense mutasjon. Syntesen av proteinet stopper da opp for tidlig og en får et ufunksjonelt protein. Ved en insersjonsmutasjon vil en få et eller flere ekstra basepar til DNA tråden. Denne type mutasjon kan føre til en endring i leserammen og dermed kan ha store konsekvenser for proteinet. Den siste typen genmutasjon er delesjon, der et eller flere basepar blir borte. Dette har samme konsekvens som insersjonsmutasjon. En translokasjonsmutasjon er en kromosomsmutasjon. Her byttes en del av kromosomet ut med en del av et annet kromosom. En får da et kromosom bestående av deler fra to forskjellige kromosomer. [6] 5 Universitetet i Tromsø 2.3 IDH 1 og IDH 2 genene Den relativt nyoppdagede mutasjon i genet som koder for isocitrat dehydrogenase, IDH1 og IDH2, har vist seg å ha en sammenheng med gliomer. Disse metabolske enzymene er knyttet til den cellulære respirasjonen. I flere studier er det påvist IDH1 og IDH2 mutasjoner i en stor andel gliomer av grad II, grad III og i sekundære glioblastomer. Det er også funnet IDH1 mutasjon ved annen type kreft, som for eksempel akutt myelogen leukemi. [7] Genet som koder for isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1) ligger på kromosom 2q33.3 og har 10 exoner. Enzymet isocitrat dehydrogenase 1 finnes i cellenes cytoplasma og fungerer som et NADP-­
avhengig protein som katalyserer dekarboksylasjonen av isositrat til Į-­ketoglutarat, figur 1Figur 1. Dette er en tostegsprosess der isocitrat først oksideres til et keton. Ketonet får spaltet av CO 2 , slik at det blir til Į-­ketoglutarat. Under reaksjonen produseres NADPH, som er med på å beskytte cellene fra oksidativ skade. Mutasjonen oppstår i exon 4som ligger på kodon 132, hvor den vanligste endringen er CGT Æ CAT. Resultatet er endring av aminosyren arginin til histin (R132H). Ved mutasjon har enzymet evnen WLOnNDWDO\VHUHĮ-­ketoglutarat vidre til onkometabolitten 2-­
hydroxyglutarat (2-­HG). Metabolitten 2HG har tidligere vært knyttet til hjernetumor. Ved mutasjon kan 2HG mengden øke opptil hundre ganger mer enn normalt. [8] [9] [10] [11] Figur 1 viser mutert IDH1 og IDH2s HYQHWLOnNRQYHUWHUHĮ-­KG til 2HG. [11] 6 Universitetet i Tromsø Genet som koder for isocitrat dehydrogenase 2 (IDH2) ligger på kromosom 15q26.1 og inneholder 11 exon. Dette er det eneste enzymet som har lik funksjon som IDH1. IDH2 er lokalisert til mitokondriene, der det spiller en viktig rolle i kontroll av den mitokondriske redoksbalansen, og sørger for samme beskyttelse som IDH1 gjør. Det har vist seg at majoriteten av grad II og III gliomer har IDH1-­mutasjon, mens primære glioblastomer og lavgradige gliomer i veldig lav grad har IDH1-­mutasjoner. Videre analyser viste at noen av gliomene som manglet IDH1 mutasjon, hadde IDH2 mutasjon. [8] Både IDH1 og IDH2 mutasjonene er missens mutasjoner, hvor det skjer en forandring i henholdsvis kodon 132 i IDH1-­genet, og 172 i IDH2-­genet. Dette skjer i en viktig del av det isocitratbindene setet. Mutasjonen minker enzymaktiviteten, noe som kan føre til oksidativt stress og skade på cellene. Biokjemiske studier har vist at mutasjon i IDH1 og IDH2 har negativ effekt på enzymets kapasitet til å binde isocitrat og konvertere det til Į-­ketoglutarat. Dermed blir det dannet mindre CO 2 og NADPH. Siden NADH senkes, kan det gjøre cellene mer sensitive for stråling og cytostatika behandling. IDH-­muterte gliomer oppstår oftest hos yngre pasienter og er forbundet med signifikant bedre prognose enn tumorer uten mutasjon. Pasienter med denne mutasjonen har en overlevelse på 36 mnd i forhold til pasienter som har sine IDH-­gener intakt, der median overlevelse er 13,5 mnd. [10] [8] IDH1 og IDH2 er onkogener og mutasjoner finnes hetrozygot, det vil si at bare et av allelene er mutert. Ved mutasjoner fra tumor supressorgener, må begge allelene være mutert for at kreft skal utvikles. Alle funksjonene til IDH1 og IDH2 er enda ikke klarlagt. Derfor er det enda usikkerheter rundt konsekvensene av mutasjonene. [12] 2.4 PCR Polymerase chain reaction, PCR, brukes til å amplifisere DNA. Dette blir gjort for å kunne gjøre videre undersøkelser på DNA. Til reaksjonen lages en mastermix, DNA, polymerase, forward og revers primer og nukleotider. Syntetiseringen av DNA foregår i tre trinn, denaturering, annealing og elongering. [13] Under denaturering varmes reaksjonsblandingen med DNA-­templatet i opp til rundt 95oC. Dette gjør at dsDNA(double-­stranded DNA) smelter fra hverandre og vi får ssDNA (singel-­stranded 7 Universitetet i Tromsø DNA). Polymerasen kan bare syntetisere ssDNA. Vi skal i denne oppgaven endre temperaturen i dette første trinnet, som vanligvis er konstant. Temperaturen manipulere vi for å se om sensitiviteten til PCR reaksjonen kan bli bedre. I annelingstrinnet senkes temperaturen til ca 60oC og primerne binder seg til ssDNA. Primersekvensene vi bruker til IDH1 genet er 20 basepar(bp) lange. Ved optimalisering av PCR betingelser bruker en å variere denne temperaturen. Dette er fordi primere kan trenge forskjellige temperaturer for å feste seg til DNA. Temperaturene i de andre trinnene er mer eller mindre konstant i alle laboratorier. [6] Det siste trinnet i PCR reaksjonen er elongering, her økes temperaturen til ca 72oC. Ved denne temperaturen har polymerasen sitt temperaturoptimum. Når polymerasen har festet seg til primerne og DNA-­templatet begynner den å syntetisere DNA tråden. Denaturering, annealing og elongering gjøres i flere sykluser, vanligvis i 30-­40. Ved real time er det mulig å følge dannelsen av PCR produkt i sanntid. Ved å koble fluoriserende prober kan en følge med på amplifiseringen av DNA under reaksjonen. Dette kan videre utnyttes til å detektere mutasjoner allerede under PCR reaksjonen. Real time PCR forkorter prøvebehandlingstiden betydelig. En slipper da å gå videre med prøvene til sekvensering. Vi har hentet mye informasjon om Cold PCR fra diverse artikler. I disse artiklene er det benyttet LightCycler fra Roche, som er en real time PCR maskin med mulighet for smeltepunktsanalyse. Da vi ikke har tilgang til en slik er det benyttet varmeblokker som ved vanlig PCR, etterfulgt av DNA sekvensering. [14] 2.4.1 Cold PCR Prinsippet for Cold PCR, (CO-­amplification at Lower Denaturation temperature PCR), er det samme som for konvensjonell PCR. Forskjellen ligger i denatureringstemperaturen. Ved Cold PCR benyttes en lavere temperatur enn ved konvensjonell PCR. Tanken bak er at DNA får laver smeltetemperatur dersom det er en mutasjon tilstede. Bakgrunnen for dette er at den vanligste mutasjonen går fra basene CGT til CAT, det blir tre til to hydrogenbininger, som har lettere for å smelte fra hverandre. En annen grunn til at smeltetemperaturen senkes, er at under PCR vil det dannes DNA tråder som inneholder både villtype og mutert DNA, slik at det blir mismatch mellom 8 Universitetet i Tromsø det bestemte baseparet. DNA tråden vil da få lavere smeltepunkt siden baseparene ikke danner en binding. Effekten skjer først etter noen vanlige runder med PCR, der en har fått syntetisert noen nye DNA tråder. Etter denaturering, når temperaturen senkes, vil DNA trådene igjen dannet par. Dersom en sekvens med mutasjon og en sekvens uten mutasjon (villtype) har dannet et par, vil en mismatch oppstår. Ved å benytte lavere denatureringstemperatur enn vanlig, ønsker en at bare DNA sekvensene som har dannet en mismatch smelter fra hverandre, slik at det kun er disse som syntetiseres. På denne måten vil en få mange kopier av det muterte genet, mens antallet av de normale genene vil holde seg lav. [15] Teknikken er spesielt nyttig når en ser etter mutasjoner som ikke er nedarvet. Arvelige mutasjoner vil finnes i alle typer celler, mens mutasjoner i kreftsvulster vil bare befinne seg i kreftcellene. Biposier fra kreftprøver er ofte heterogene, dvs. at der er både normale celler og tumorceller i prøven. Ved konvensjonell PCR/sekvensering kan sensitiviteten være for dårlig slik at det muterte DNAet ikke blir detektert. Ved bruk av Cold PCR er målet å anrike det muterte DNA. 2.5 Elektroforese Elektroforese er en metode som brukes mye innen biokjemi. Ved hjelp av et elektrisk felt kan en separere molekyler på grunnlag av elektrisk ladning og størrelse. Positivt ladde molekyler vil vandre mot negativt ladet pol, mens negativt ladde molekyler vil vandre til positivt ladet pol. Gitt at den elektriske spenningen i feltet molekylene beveger seg i er konstant, vil hvert molekyl bevege seg med en konstant hastighet. Lengden de vandrer avhenger av deres form, størrelse og ladning. Også feltstyrken og løsningens viskositet er viktig for vandringslengden. Siden DNA er negativ ladet, på grunn av fosfatgrupper, vil DNA molekylet vandre mot positiv pol. Antall basepar i DNA-­
molekylet vil bestemme hvor langt det vandrer når spenningen er konstant med bestemt styrke og løsningens viskositet. Dermed kan en separere forskjellige DNA-­molekyler etter hvor lange de er. [16] 9 Universitetet i Tromsø 2.6 Sekvensering Ved en PCR reaksjon har en fått kopiert kun den delen av DNAet en er ute etter å undersøke. For å kunne bestemme DNA sekvensen må PCR produktet sekvenseres. For å forstå prinsippet til sekvensering må en først se på hvordan et nukleotid er bygget opp. Et nukleotid består av et sukkermolekyl, en fosfatgruppe og en av fire nitrogenholdige baser, adenin (A), tymin (T), cytosin (C) og guanin (G). En kan forkorte nukleotidene til dATP, dTTP, dCTP og dGTP. Nukleotidene med ulike baser settes sammen til en DNA tråd. [6] Figur 2 viser oppbygning av et nukleotid. [1] Ved sekvensering tilsettes DNA i en mastermix med polymerase og nukleotider. I tillegg tilsettes det dideoksynukleotider (ddATP, ddGTP, ddTTP og ddCTP). Dette er nukleotider hvor OH-­gruppen er fjernet fra sukkermolekylet. Endringen av nukleotidet gjør at polymerasen ikke kan fortsette å syntetisere DNA tråden. Mastermixsen deles i to, der den ene tilsettes revers primer og den andre tilsettes forward primer. Når DNA tilsettes vil polymerasen syntetisere DNA tråden fra primerne og utover med vanlige nukleotider. På et tidspunkt vil et dideoksynukleotid bli koblet inn på tråden. Dette gjør at syntetiseringen stopper opp fordi et nytt nukleotid ikke kan bindes til et dideoksynokleotid. I reaksjonsblandingen vil det da, ved syntetisering av DNA, oppstå fragmenter med forskjellige størrelser alt etter hvor i syntesen et dideoksynukleotid blir koblet på DNA tråden. Etter et gitt antall sykluser vil polymerasen ha syntetisert fragmenter fra et basepar til det antallet basepar den gitte DNA sekvensen er på. [6] Til slutt analyseres prøven med kapillærelektroforese. Hvert av dideoksynukleotidene har et flouriserende fargestoff festet på seg. Ved sekvenseringsanalyse fremstår ddATP som grønt, ddTTP som rødt, ddGTP som sort og ddCTP som blått. I stede for at prøven blir applisert på en gel, som ved gelelektroforese, blir prøven applisert i et tynt kapillær. I kapillæret blir DNA sekvensene trukket mot positiv pol grunnet det elektriske feltet. Små sekvenser vil gå raskt gjennom kapillæret, mens lengre sekvenser vil bruke lengre tid. Underveis blir sekvensene detektert på grunn av det fluoriserende lyset som den siste basen i baserekkefølgen sender ut. På bakgrunn av dette, er det mulig å finne baserekkefølgen i DNA sekvensen. 10 Universitetet i Tromsø 2 Materiale og metode 2.1 Materiale 2.1.1 Prøvemateriale En patolog valgte ut 11 biopsier vi kunne bruke. Disse ble valgt ut på bakgrunn av histologisk cellebilde og mengde tumor i biopsien. Ti av prøvene er fra 2010, mens en prøve er fra 2011. Biopsiene er diagnostisert til gliomer av grad II, III og noen få er av grad IV. Patologen markerte området på snittene hvor materialet skulle tas fra. Materialet ble stanset ut av blokkene med kanyle. Figur 3 viser bilde av snitt fra prøve 1. Til venstre vises området som patolog hadde markert som aktuelt område for uttak av prøvemateriale. Til høyre vises utsnitt av aktuelt område. Prøven er diagnostisert til oligodendrogliom II-­III. Etter ekstraksjon av DNA ble alle prøver med en DNA konsentrasjon på over 20 QJȝOIRUW\QQHWWLO
20 QJȝO DNA. Til utprøvning av Cold PCR laget vi fortynninger av prøve 1,2 og 4 som inneholdt mutasjon. Prøvene ble fortynnet med DNA fra en tumor uten mutasjon slik at vi fikk fortynninger som inneholdt henholdsvis 2 %, 5 % og 25 % tumorceller. Prøvene ble fortynnet mot prøve 10, da denne var glioblastom uten mutasjon. 11 Universitetet i Tromsø 2.1.2 Reagenser Tabell 1 viser oversikt over primerne. Primernavn DNA sekvens (5’ – 3’) IDH1 F1 CGGTCTTCAGAGAAGCCATT IDH1 R1 IDH 1 RM13R (ny sekvenseringsprimer) CACATACAAGTTGGAAATTTCTGG CACATACAAGTTGGAAATTTCTGGGCCATGAAAAAAAAAA
C IDH2 F1 TTCTGGTTGAAAGATGGCG IDH2 R1 CAGGTCAGTGGATCCCCTC Revers IDH1 primer kun til sekvensering ble byttet ut med en ny, da den gamle band seg etter en lang rekke med T nukleotider. Dette gjorde at reverstråden ble dårlig, siden polymerasen kan ha problemer med slike sekvenser. Den nye primeren binder seg over dette området, slik at rekken med T nukleotider ikke blir med i sekvenseringsreaksjonen. Tabell 2 viser oversikt over reagensene som er brukt. Reagens Leverandør QIAamp DNA mini kit Ekstraksjon av DNA Qiagen Etanol 96 % Sentrallager MH JumpStart Taq DNA polymerase Polymerase og nukleotider Sigma-­Aldrich 10x primermix BIOMED Primere til Q-­test InVivoScribe Technologies Agarose Gel til elektroforese MedPRobe TBE-­buffer Elektroforesebuffer Mol.Pat GelRed Farging av gel Biotium TrackIt 100 bp Ladder Standard for basepar størrelser Invitrogen 10x primermix Primere til IDH1/IDH2 Eurofin BigDye v. 3.1 Polymerase og nukleotider til sekvensering Applied biosystems 5x buffer til BigDye v. 3.1 Buffer til DNA sekvensering Applied biosystems ExoSap-­IT Fjerner nukleotider og primere USB Virkning/innhold 12 Universitetet i Tromsø 2.2 Metode 2.2.1 Ekstraksjon av DNA Før en kan begynne med analysen må DNA ekstraheres fra prøvematerialet, som i dette tilfelle er hjernetumorer. Dette ble gjort med QIAamp DNA mini kit (Vedlegg 1). En bit av biopsien ble avparafinert med xylen og alkohol. Deretter ble den behandlet med proteinase K over natt, som bryter ned vevet og frigjør DNA. Når DNA er frigjort overfører en løsningen til en kolonne som binder det negativt ladde DNA molekylet. Innholdet i kolonnen blir vasket slik at det til slutt bare er DNA i kolonnen. Etter vaskingen elueres DNA ut fra kolonnen ved å endre betingelsene i kolonnen slik at DNA løsner. 2.2.2 Kvantitering og kvalitet av DNA Etter ekstraksjon av DNA, må konsentrasjonen og renheten til DNAet sjekkes. Dette gjøres på NanoDrop spektrofotometer som kan måle konsentrasjonen av DNA i en prøve (Vedlegg 2). Til dette instrumentet trenger en lite prøvemateriale, 1-­ȝO'HWWHHUHQIRUGHOIRUGLHQRIWHKDUOLWH
prøvemateriale å jobbe med. Når prøven appliseres på instrumentet, måles OD (renhet og konsentrasjon) spektrofotometrisk. Renheten beregnes med en ratio der 260/280 og 260/230 er de som brukes. Ved 260 nm har nukleotidene (som i DNA) maksimum absorbans. Ved OD 280 nm har protein, fenol og andre kontaminasjoner absorbans. 260/280-­ratio skal være tilnærmet 1,8. Ratio 260/230 brukes som sekundær måling av renhet. Denne verdien skal være 2,0-­2,2. Lavere verdier viser kontaminasjon med stoffer som absorberer ved 230 nm. 13 Universitetet i Tromsø 2.2.3 Q-­test En Q-­test kan gjøres for å kvalitets teste ekstrahert DNA. Vi benyttet Q-­testen fra BIOMED2 (Vedlegg 3). Usikkerhet rundt kvaliteten på DNA fra parafininnstøpt vev er en av grunnene til at en slik test gjøres. DNA blir ofte degradert i parafininnstøpt vev. Kvaliteten på DNA testes med en multiplex PCR. Dette innebærer en reaksjonsblanding med primerpar til fem forskjellige målgener. Målgenene har forskjellige Tabell 3 viser PCR program ved Q-­test. fragmetstørrelser;; 100, 200, 300, 400 og PCR program Denaturering 95 °C 07:00 600 basepar lange. Ved å gjøre en PCR Denaturering 95 °C 00:45 med disse fem primerparene vil en, ved Annealing 60 °C 00:45 35 sykluser god kvalitet på DNAet, få fem fragmenter Elongering 72 °C 01:30 Final elongering 72 °C 15 °C 10:00 ’ i forskjellige størrelser. Dersom DNA er degradert vil kun de mindre DNA fragmentene amplifiseres. For å standardisere analysen ble prøvene fortynnet WLOQJȝO DNAȝOSU¡YHRJȝO
mastermix pipetteres over i PCR rør og settes i PCR blokk med betingelsene i tabell 3. Etter PCR blir prøvene applisert på en gel for å utføre en elektroforese. En ladder benyttes slik at båndene til prøvene kan sammenlignes med de kjente båndene i ladderen. Elektroforesen ble utført med 1,5 % agarosegel ved 90 V i ca en time. 14 Universitetet i Tromsø 2.2.4 PCR Temperaturene og tidene til den konvensjonelle PCR som til vanlig blir brukt ved Molekylærpatologisk avdeling ved Tabell 4 viser oversikt over konvensjonell PCR betingelser Universitetssykehuset i Nord-­Norge vises i PCR program Denaturering 95 °C 07:00 Denaturering 95 °C 00:45 35 Annealing 60 °C 00:45 Reagensene blandes sammen i en sykluser Elongering 72 °C 01:30 PDVWHUPL[ȝODYPDVWHUmixen ble Final elongering 72 °C 10:00 tilsatt 2,5 ȝO prøvemateriale i PCR-­rør. I 4 °C ’ tillegg benyttes positiv og negativ kontroll. Rørene blir satt i PCR-­blokk med konvensjonelle PCR tabell 4 og vedlegg 4. betingelser. 2.2.4.1 Cold PCR Til oppsettene med Cold PCR brukes først Tabell 5 viser oversikt over Cold PCR betingelser det konvensjonelle oppsettet i 20 sykluser. Cold PCR program Denaturering 95 °C Cold PCR. Her endres Denaturering 95 °C 60 °C denatureringstemperaturen mens annealing-­ Annealing Elongering 72 °C og elongeringstemperaturene holdes slik Denaturering Varierende som ved konvensjonell PCR. Antall sykluser Annealing 60 °C i Cold PCR oppsettet er basert på tidligere Elongering 72 °C studier. [17] Final elongering 72 °C Etter disse syklusene er det 30 sykluser med ’ 4 °C 07:00 00:45 00:45 20 sykluser 01:30 00:45 00:45 30 sykluser 01:30 10:00 15 Universitetet i Tromsø 2.2.5 Elektroforese Ved elektroforese WLOVHWWHVȝO ladder som inneholder DNA-­fragmenter av kjente lengder. Dette er den samme som brukes ved Q-­test. Gelmateriale som brukes er agarose, som er et polysakkarid isolert fra alger. Vi benyttet 2 % agarose, som er vanlig ved DNA fragmenter på 100 til 2000 bp. Denne ble benyttet siden størrelsen på fragmentete er 176 bp. Gelen legges i et kar og bufferløsning helles over slik at den dekkes. 9 µl prøve ble deretter tilsatt i brønnene i kronologisk rekkefølge. Gelen kobles så til en strømkilde, 90 V i 45 min. DNA er usynlig for det blotte øye og farges derfor med GelRed. Fargen vil binde seg til dsDNA og kan detekteres ved hjelp av UV-­lys. Agarosegelen ble satt opp med alle PCR-­prøvene for å sjekke at det ble dannet produkt. 2.2.6 Sekvensering PCR produktet renses før sekvensering. Det vil si at Tabell 6 viser EXoSap-­IT program nukleotider og primere må fjernes. Det gjøres ved ExoSap-­IT. ExoSap-­IT program ExoSap-­IT kan tilsettes direkte, men må holdes kjølig hele 37 °C 00:15 1 syklus tiden og lagres fryst for å holde det inaktivert. Det er aktivt i de 80 °C 00:15 fleste PCR-­buffere, så utbytting av buffer er ikke nødvendig. 4 °C ’ Ved rensing brukes 2 ul ExoSap-­IT + 5 ul PCR produkt. Prøvene settes i PCR maskinen med program som vises i tabell 6. [18] Før prøvene kan sendes til sekvensering, må de gjennom en sekvenseringsreaksjon (se vedlegg 5). Tabell 7 viser sekvenseringsprogram Sekvenseringsprogram 96 °C 00:10 Prøvene ble fortynnet 1:5 før de ble fordelt slik at hver og en 50 °C 00:05 prøve fikk tilsatt IDH1-­1F og IDH1-­1R i forskjellige rør. Det 60 °C 04:00 ble utført forward og reverse sekvensering. Totalt volum i 4 °C 25 sykluser ’ U¡UHQHYDUȝOReaksjon ble kjørt med de betingelsene som vises i tabell 7. 2.2.7 Sekvenseringsanalyse Dataprogrammene Chromas Lite og SeqScape ble benyttet til sekvenseringsanalyse av sekvensene. 16 Universitetet i Tromsø 3 Resultat 3.1 Konsentrasjon og renhet Etter ekstraksjon av DNA ble det gjort OD måling for å kontrollere kvaliteten til DNA samt mengde ekstrahert DNA fra parafinblokk. Tabell 8 viser oversikt over diagnose, samt ratio og OD måling. En forventer ikke å finne mutasjon i nummer 10 og 11 da disse er av grad fire. Diagnosen og utvalgte snitt er kvalitetssikret av Kristin Smistad, patolog ved klinisk patologi, Universitetssykehuset i Nord-­Norge. Prøve nummer Diagnose Ratio 260/280 Ratio 260/230 DNA QJȝO 1 2 3 4 5 Oligodendrogliom II-­III Oligodendrogliom III (IV) Oligodendrogliom III (lite materiale) Blandet oligodendrogliom og astrocytom II (III) Astrocytom III (IV) 1,87 1,87 2,67 2,03 1,92 1,53 1,88 0,5 1,59 1,4 20,4 48,4 3,5 35,6 35,7 6 7 8 9 10 Astrocytom III (IV) Astrocytom III (lite materiale) Astrocytom II Astrocytom II (lite materiale) Glioblastom IV -­23,2 4,73 3,89 19,08 1,99 0,56 0,81 0,42 0,74 1,78 3,7 4,7 3,1 5,5 62,4 11 Glioblastom IV 2,16 1,56 29,6 OD målingen i tabellen viser at det er en sammenheng mellom prøvene som patolog merket lite materiale og resultat av OD måling og renhet. 17 Universitetet i Tromsø 3.2 Q-­test Q-­test ble benyttet for å sjekke kvaliteten til DNA som var ekstrahert fra parafinblokk. Primært er lange fragmenter ønskelig, da dette indikerer god DNA kvalitet. Figur 4 viser bilde av gel elektroforese for Q-­test. Nummerering av prøvene er samme som nummerering i tabell 8Tabell 8. Det er satt inn nummerering til venstre for ladder som viser lengden på de ulike fragmentene. Ut fra gelbildet ser det ut til at DNA kvaliteten er god. Ved de fleste prøver lot det seg gjøre å amplifisere fragmenter på 600 bp. Vannkontrollen (13) er ren, bakgrunnsstøy som kommer fram for basepar kortere enn 100 sees også i vannkontrollen. Dette er primere som er tilsatt til reaksjonen. 3.3 Konvensjonell PCR, samtlige prøver Innledningsvis valgte vi og benytte konvensjonelle PCR betingelser for å se hvilke resultater disse ville gi. Det ble satt opp et oppsett med konvensjonell PCR betingelse på samtlige prøver. Prøver over QJȝO'1$ble fortynnet til 20ng/µl DNA før PCR. En forventet å finne mutasjonen ved bruk av konvensjonell PCR, men var usikker på sensitiviteten til de ulike PCR betingelsene. Produktet etter PCR reaksjonen vil etter elektroforese på gel vises ved 176bp 18 Universitetet i Tromsø Figur 5 viser gelbilde etter elektroforese av PCR produkt, samtlige prøver konvensjonell PCR. Prøvene har vandret litt lengre enn 200bp i forhold til ladder, hvilket indikerer at ønsket produkt vises ved ca 176bp. For å danne et utgangspunkt ble alle prøvene sendt til sekvensering for å se om vi kunne påvise mutasjon. Resultat av sekvensering er presentert i tabell 11. 3.4 Sensitivitetsstudie, samt Cold PCR med 81oC Med utgangspunk i litteratur om Cold PCR ønsket vi å undersøke hvordan senkning av denatureringstemperatur påvirket resultatet[17]. I tillegg ønsket vi å teste sensitiviteten til konvensjonell PCR. Til dette ble det laget to oppsett med tre utvalgte prøver. I begge oppsettene ble prøvene fortynnet til 2 %, 5 % og 25 % i DNA fra normale celler fra samme type vev. Oppsettene ble behandlet helt likt, men Cold PCR oppsettet fikk en annen denatureringstemperatur enn konvensjonell PCR oppsettet. Prøvene som ble valgt ut hadde vist mutasjon ved konvensjonell PCR 20ng/µl. Prøvene som ble benyttet var prøve 1, 2 og 4. 19 Universitetet i Tromsø o
Figur 6 viser gelbilde av elektroforese av tre prøver, konvensjonell PCR betingelser og Cold PCR 81 C betingelser. Øverste rad viser tre prøver kjørt med konvensjonell PCR betingelser. Både konvensjonell og Cold PCR 81oC viste produkt ved de tre fortynningene. Øverste rad, figur 6, viser tre prøver kjørt med konvensjonell PCR betingelser. Nederste rad viser tre prøver utført med Cold PCR og 81oC denatureringstemperatur. Begge oppsettene ble sendt til sekvensering for å se om vi kunne påvise mutasjon ved endret sensitivitet samt endret denatureringstemperatur. 20 Universitetet i Tromsø Figur 7 viser sekvensering av tre prøver, fortynnet til 25 %, Cold PCR 81oC. Økt sensitivitet ved 81oC er beskrevet i litteraturen. Ved bruk av 81oC til denatureringstemperatur klarte vi ikke å påvise annet en villtype sekvenser. 21 Universitetet i Tromsø 3.5 Temperaturgradient Med utgangspunkt i temperatur benyttet i vitenskapelig artikkel, arbeidet vi videre med at temperaturen ville ligge i området rundt 81oC [17]. For å minske prøvemengden ved utprøvning av ulike temperaturer testet vi kun tre prøver ved de ulike temperaturene. Prøvene var fortynnet til 25 %. Det ble laget et nytt Cold PCR oppsett hvor det ble benyttet en PCR maskin med temperaturgradienter. Totalt seks temperaturer, fra 79,0 til 81,5oC, hver halve grad, ble testet i det nye Cold PCR oppsettet. Tabell 9 viser oversikt over prøveoppsett, tre prøver, seks temperaturer. Nummereringen som er benyttet i tabellen er identisk med nummereringen i figur 8. Nr Prøve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 4 Pos kontroll (DNA biomed) Negativ kontroll (NTC) Prøve 1 Prøve 2 Prøve 4 Pos kontroll (DNA biomed) Negativ kontroll (NTC) Prøve 1 Prøve 2 Prøve 4 Pos kontroll (DNA biomed) Negativ kontroll (NTC) Temp 79 79,5 80 Nr Prøve 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 4 Pos kontroll (DNA biomed) Negativ kontroll (NTC) Prøve 1 Prøve 2 Prøve 4 Pos kontroll (DNA biomed) Negativ kontroll (NTC) Prøve 1 Prøve 2 Prøve 4 Pos kontroll (DNA biomed) Negativ kontroll (NTC) Temp 80,5 81 81,5 22 Universitetet i Tromsø Figur 8 viser gel elektroforese av PCR produkt, tre prøve, seks temperaturer. Nummereringen av prøvene er knyttet til nummereringen i tabell 9. Det ble påvist produkt ved alle temperaturer. En ser tydelig at styrken på båndene ved 176bp avtar ved stigende temperatur ved at båndene er mye tydeligere ved 79,0oC enn ved 81,5oC. For å minske prøvemengden til sekvensering valgte vi kun en prøve til sekvensering. Prøve 1 med alle temperaturer ble valgt. 23 Universitetet i Tromsø o
Figur 9 viser sekvensering av prøve 1 ved seks temperaturer. Det er påvist mutasjon ved 79 C i revers tråd (CGT Æ CAT). Forward tråd 79,0oC er ikke med i denne figuren da denne hadde for dårlig kvalitet. 24 Universitetet i Tromsø Forsøkene med Cold PCR startet med utgangspunkt i 81,0oC. Sekvenseringen i figur 9 viser tydelig at temperaturen ligger lavere enn hva vi i utgangspunktet hadde forventet. Ved videre arbeid med optimal temperatur ville det derfor være naturlig å forsøke temperaturer rundt 79oC. 3.6 Cold PCR, forsøk med lavere denatureringstemperatur Med utgangspunkt i påvist mutasjon ved 79,0oC, 25 % fortynnet, ønsket vi å teste lavere temperaturer for å sikre at vi ikke overså mulig optimal temperatur. For å minske prøvemengden ble det bestemt at vi kun skulle teste en prøve ved temperaturer fra 73,0 – 78oC, hele grader. Prøve 1 ble valgt. Gelbilde av PCR produkt viste antydning til produkt ved 78oC. Siden det ikke ble produkt ved de andre temperaturene gikk vi ikke videre med sekvensering av disse PCR produktene. Vi valgte istedet å konsentrere oss om temperaturer rundt 79oC hvor vi tidligere hadde påvist mutasjon. 3.7 Cold PCR, temperaturforsøk rundt optimal denatureringstemperatur Da det ikke ble påvist noe produkt ved temperaturer under 78oC ønsket vi å teste temperaturer som lå nærmere 79oC. I tillegg ble sensitiviteten sjekket ved at prøven ble fortynnet til 2 %, 5 % og 25 %. Prøve 1 ble valgt. Prøven ble testet ved temperaturer fra 76,5 – 79,0oC, hver halve grad. 25 Universitetet i Tromsø o
Figur 10 viser gelbilde etter elektroforese av PCR produkt, prøve 1, Cold PCR (76,5 – 79,0 C). Det er ikke mulig å se produkt ved temperaturer under 78,0oC. Båndene er noe utydelig fra 78,0oC til 78,5oC. Båndene ved disse temperaturene er mer synelig på skjerm som ble benyttet til foto av gelbilde, enn foto av gelbildet. Med utgangspunkt i gelbilde, figur 10, valgte vi å se bort fra temperaturer lavere enn 78,0oC ved sekvensering av PCR produkt. Sekvensering ble utført ved følgende temperaturer: 78,0, 78,5 og 79,0oC. Sekvensering ble gjort på alle tre fortynninger. 26 Universitetet i Tromsø Tabell 10 viser resultat etter sekvensering av prøve 1. Temperatur 78,0oC er ikke med i tabellen da det ikke lot seg gjøre å sekvensere denne temperaturen. Resultatene som er merket dårlig sekvens hadde for dårlige sekvenser til å avgjøre om det var villtype eller mutasjon. Temp 78,5 79 Fortynning 2 % 2 % 5 % 5 % 25 % 25 % 2 % 2 % 5 % 5 % 25 % 25 % Sekvenserings primer IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 IDH1 Resultat F R F R F R F R F R F R Dårlig sekvensering Mutasjon, CAT Dårlig sekvensering Dårlig sekvensering Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT Mutasjon, CAT 3.8 Cold PCR – valg av optimal temperatur: Med utgangspunkt i sekvensering av PCR produkt for denatureringstemperaturene 78,0 -­ 79,0oC valgte vi den temperaturen som ser ut til å gi best mulig sekvens. tabell 10 viste tydelig at 79,0oC gav flere gode sekvenser enn 78,5oC. 79,0oC ble derfor valgt som optimal temperatur da denne gav tydelige sekvenser og ser ut til å ha høy sensitivitet. For å teste sensitiviteten til mulig optimal temperatur ble det laget et oppsett med DNA fortynningene 2 %, 5 % og 25 %, for prøve 1.2 og 4. I tillegg ble samtlige prøver testet på nytt med denatureringstemperatur på 79oC. I dette oppsettet var prøvene fortynnet til 20ng/µl DNA, for å sjekke om vi kunne finne flere muterte prøver enn vi fant ved bruk av konvensjonell PCR. 27 Universitetet i Tromsø Figur 11 viser gelbilde av Cold PCR oppsett. Oppsett 1 inneholder samtlige prøver fortynnet til opptil 20ng/µl DNA. Nummereringen av prøvene i oppsett 1 er identiske med nummerering i tabell 8Tabell 8. En ser tydelig produkt for alle prøver. Oppsett 2 viser tre prøver med tre fortynninger. Det er tydelig produkt ved samtlige fortynninger. Siden begge oppsettene gav tydelige produkt ble prøver i oppsett 1 og oppsett 2 sekvensert. 28 Universitetet i Tromsø Tabell 11 viser resultat etter sekvensering av samtlige prøver, Cold PCR 79oC, samt resultater fra konvensjonell PCR. Prøvenummer Sekvenserings primer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Resultat Cold PCR 79oC Resultat konvensjonell PCR IDH1 F Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT IDH1 R IDH1 F IDH1 R IDH1 F IDH1 R IDH1 F IDH1 R Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Dårlig kvalitet Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT IDH1 F IDH1 R Villtype Villtype Villtype Villtype IDH1 F IDH1 R IDH1 F Villtype Villtype Villtype Dårlig sekvens Villtype Villtype IDH1 R IDH1 F IDH1 R IDH1 F Villtype Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Villtype Villtype Mutasjon – CGT Æ CAT Mutasjon – CGT Æ CAT Villtype IDH1 R IDH1 F IDH1 R IDH1 F IDH1 R Villtype Villtype Villtype Villtype Villtype Villtype Villtype Villtype Villtype Villtype Det ble ikke funnet flere muterte prøver ved bruk av Cold PCR sammenlignet med konvensjonell PCR. 29 Universitetet i Tromsø Sekvensering, med test av sensitivitet, prøve 1 Figur 12 viser resultat etter sekvensering av prøve 1. 2 %, 5 % og 25 % over sort strek viser sekvensering av Cold PCR, 79oC. Sekvensering under sort strek er for konvensjonell PCR betingelse. Det er påvist mutasjon ved samtlige fortynninger for Cold PCR 79oC. Ved 2 %, Cold PCR 79oC sees en blanding av villtype og mutasjon. Det er ikke påvist mutasjon ved 25 % konvensjonell PCR. F = forward sekvensering og R = revers sekvensering. 30 Universitetet i Tromsø Sekvensering, med test av sensitivitet, prøve 2 Figur 13 viser resultat etter sekvensering av prøve 2. 2 %, 5 % og 25 % over sort strek viser sekvensering av Cold PCR, 79oC. Sekvensering under sort strek er for konvensjonell PCR betingelse. Det er påvist mutasjon ved 5 % R, og 25 % F og R, Cold PCR 79oC. Det er ikke påvist mutasjon ved 2 % Cold PCR 79oC og ved 25 % konvensjonell PCR. 31 Universitetet i Tromsø Sekvensering, med test av sensitivitet, prøve 4 Figur 14 viser resultat etter sekvensering av prøve 4. 2 %, 5 % og 25 % over sort strek viser sekvensering av Cold PCR, 79oC. Sekvensering under sort strek er for konvensjonell PCR betingelse. Det er påvist mutasjon ved samtlige fortynninger for Cold PCR. 32 Universitetet i Tromsø 3.9 Resultater IDH2 Figur 15 viser gelbilde etter PCR ved bruk av IDH2 primermix. Det er påvist produkt i samtlige prøver. Nummerering av prøver stemmer overens med nummerering i tabell 8. Sekvensering av IDH2 ved bruk av konvensjonell PCR viste ingen IDH2 mutasjoner i de utvalgte biopsiene. 4 Diskusjon 4.1 DNA konsentrasjon og renhet DNA konsentrasjon og renhet ble gjort på NanoDrop. Ingen av prøvene merket lite materiale hadde DNA konsentrasjon høyere enn 5,5ng/µL. Med utgangspunkt i OD målingen ble det underveis i forsøket valgt tre hovedprøver som ble testet ved ulike temperaturer. Disse prøvene ble valgt fordi de hadde høyere DNA konsentrasjon enn 20 ng/µl. Ved konsentrasjoner over 15-­20 ng/µl DNA kan en stole på konsentrasjon og renheten. Som tidligere beskrevet tyder høy 260/280 ratio på høyt innhold av urenheter som absorberer ved 260nm, spesielt protein. Prøvematerialet besto av en vevsbit innfiltrert med parafin innstøpt i blokk. Parafin absorberer ved 230 nm, noe som kan påvirke renheten, hvilket gir utslag på ratioen. Innholdet i DNA påvirker også ratio målingen. Høyt innhold av adenin vi føre til forhøyet ratio, da adenin har høy absorbsjon ved 260 nm. 260/230 ratio blir brukt som sekundær måling av renhet. Denne verdien skulle være 2,0 – 2,2 for optimalt resultat. Alle prøver med høy ratio har lav DNA konsentrasjon. Ved lave DNA konsentrasjoner vil det være mye bakgrunnsstøy i OD målingen. 33 Universitetet i Tromsø Dette vil også gi utslag i ratiomålingen. Lav DNA konsentrasjon viste seg ikke å ha avgjørende betydning for PCR. Prøve 6 har 3,7QJȝ/'1$3røver lavere enn 10-­QJȝO gir lite informativ OD ratio, hvilket kommer tydelig frem for prøve 6 som har en ratio på -­23,2, noe som ikke er mulig. 4.2 Q-­test Gelbilde av Q-­test, figur 4, viser en sammenheng mellom tidligere OD måling og Q-­test. Prøve nr 3, 6, 7 og 8 hadde en OD måling lavere enn 5,0ng/µl. De fire prøvene, spesielt prøve 8, har svakt eller ingen bånd ved 600bp, hvilket indikerer at kvaliteten ikke er helt optimal (degradert DNA). I tabell 8Tabell 8 ser en at OD målingen for prøve 8 viser et resultat lik 3,1ng/µl, som henger sammen med de svake båndene i figur 4. To av de tre prøvene som ble valgt som hovedprøver, 1 og 4, hadde bånd fra 100-­600bp. Prøve 2, figur 4, hadde noe dårligere kvalitet på DNA da vi ikke kunne påvise 600bp, men 500bp. De fleste prøvene som ble benyttet var av relativt god kvalitet. Dette indikerer at ekstraksjonen av DNA fra parafinblokk var vellykket, og DNA var lite degradert. 4.3 Mutasjonsanalyse Vi forventet at to av de 11 prøvene i tabell 8, prøve 10 og 11, skulle være av villtype da disse var diagnostisert av patolog til gliom grad IV. Begge prøvene viste kun villtype etter sekvensering. Av de resterende ni prøvene ble det påvist mutasjon i fem prøver. Av disse ni hadde patolog diagnostisert prøve 2, 5 og 6 til gliom grad III, med mulighet for grad IV. Av disse tre fant vi mutasjon i prøve 2. Prøve 5 var villtype, prøve 6 hadde for dårlige sekvens til å avgjøre om det var mutasjon eller villtype. I prøve 6 ble det senere funnet villtype ved bruk av Cold PCR med 79oC. 34 Universitetet i Tromsø 4.4 Optimalisering av Cold PCR Valg av temperatur til det første forsøket med Cold PCR tok utgangspunk i temperatur beskrevet i en vitenskapelig artikkel[17]. I dette studiet er det benyttet LightCycler, metoden er derfor ikke direkte overførbar til vår oppgave. Vi valgte i første omgang 81oC da denne temperaturen hadde gitt gode resultater ved bruk av LightCycler. Gelbildet, figur 6, viste at både fortynnede prøver behandlet med konvensjonell PCR og fortynnede prøver behandlet med Cold PCR 81oC hadde klare bånd ved 176bp. Vannkontroll var ren. Etter DNA sekvensering kunne vi ikke påvise mutasjon i prøver fra konvensjonell PCR oppsettet eller prøver fra Cold PCR med 81oC oppsettet. Hvis en sammenligner konvensjonell PCR fortynnet 25 %, med konvensjonell PCR ufortynnet (20ng/µL DNA), er det tydelig at konvensjonell PCR har for dårlig sensitivitet da vi ikke kunne påvise mutasjon i prøvene fortynnet til 25 %. Sammenligning av konvensjonell PCR med Cold PCR med 81oC viser at vi ikke har truffet rett denatureringstemperatur da det ikke er noen forskjell mellom resultatene fra disse to oppsettene. Som tidligere lest i litteraturen var ikke denatureringstemperaturen direkte overførbar til vårt PCR utstyr. Vi var ikke sikre på at vårt forsøk med annen denatureringstemperatur ville gi bedre sensitivitet, men ut fra litteraturen skulle det være mulig å finne en optimal temperatur for vårt utstyr. Etter et negativt resultat på 81oC, gikk vi videre for å prøve ut noen andre denatureringstemperaturer. Vi benyttet da en PCR maskin med temperaturgradient slik at vi kunne teste seks temperaturer samtidig. Temperaturene som ble benyttet var fra 79oC til 81,5oC, alle prøvene var fortynnet 25 %. Figur 8 viser bånd ved 176bp for de seks temperaturene som ble testet. Det ser ut til å være en sammenheng mellom økende temperatur og båndstyrke, da båndstyrke avtar med økende temperatur. Båndene er mye sterkere ved 79oC enn ved 81,5oC. Etter elektroforesen bestemte vi oss for å gå videre med sekvensering av kun én prøve. Dette fordi 30 prøver var litt mye å sette opp til sekvensering. Vi satt derfor opp prøve 1 med alle temperaturene til sekvensering. Det ble ikke påvist mutasjon ved temperaturer fra 79,5 – 81,5oC, men det ble påvist tydelig mutasjon ved 79oC. Vi har funnet en temperatur som viste mutasjon ved annen denatureringstemperatur enn konvensjonell PCR. Temperaturen hadde klart høyere sensitivitet siden prøven som det ble påvist mutasjon i var fortynnet til 25 %. Ved videre arbeid med 35 Universitetet i Tromsø Cold PCR var det derfor naturlig å konsentrere seg om temperaturer rundt 79oC, eventuelt lavere temperaturer siden temperaturer høyere enn 79oC ikke hadde effekt. Etter funn av mutasjon ved 79oC bestemte vi oss for å senke temperaturen ytterligere. Vi senket temperaturen fra 78oC til 73oC uten å bruke halvgrader. Gelbildet for temperaturen fra 73oC til 78oC er ikke tatt med i oppgaven da det kun ble påvist produkt ved 78oC. En av grunnene til dette kan være fordi temperaturer lavere enn 78oC ikke kan denaturere DNA-­trådene. De 20 konvensjonelle PCR syklusene som kjøres først, danner ikke nok produkt til deteksjon av DNA eller sekvenseres. Av den grunn gikk vi ikke videre med dette prøve oppsettet til sekvensering. Vi utførte også PCR på prøve 1 med temperaturer fra 76,5oC til 79oC, med halvgrader. Etter elektroforesen var det klart at en kan se produkt på temperaturene 78, 78,5 og 79oC på gel. Disse har vi derfor valgt å ta videre til sekvensering. Analyse av sekvensering viser at vi har fått dårlige kvalitet ved 78oC, som kan tyde på dårlig effektivitet. Ved 78,5oC og 79oC påvises mutasjon. Sekvensene ved 78,5oC er noe dårligere enn sekvensene ved 79oC. vi har derfor valgt 79oC som optimal temperatur. Vi satte opp alle de opprinelige prøvene med Cold PCR ved 79oC for å se om noen av de prøvene som viste villtypegen ved konvensjonell PCR ville vise mutasjon ved bruk av Cold PCR. Det kunne tenkes at noe av prøvematerialet innehold for få kreftceller slik at en konvensjonell PCR med lav sensitivitet ikke ville detektere eventuell mutasjon. Etter sekvenseringsanalyse ble det klart at alle prøvene som ble negative ved konvensjonell PCR også var negative ved Cold PCR, se tabell 10. Revers tråd til prøve 4, Cold PCR 79oC, var av meget dårlig kvalitet. Ved bruk av konvensjonell PCR fikk vi en blanding av mutasjon og villtype for revers sekvensering, prøve 4. Med utgangspunkt i forward sekvensering, prøve 4, konvensjonell PCR, ble konklusjonen at det også var mutasjon i prøven. For å teste sensitiviteten på Cold PCR ble prøve 1, 2 og 4 satt til analysering med alle fortynningene (2 %, 5 % og 25 %). Etter sekvenseringsanalyse ser vi at vi har fått mutasjon på alle prøvene bortsett fra prøve 2 ved 2 % fortynning. Fortynningen som ble gjort av prøvene fortutsatte at OD målingen var helt korrekt. Hvis denne målingen ikke var korrekt vil den prosentvise fortynningen 36 Universitetet i Tromsø bli ukorrekt. Siden det blir påvist mutasjon i de to andre prøvene som var fortynnet til 2 %, prøve 1 og 4, kan vi konkludere med at sensitiviteten er høy, med forbehold om fortynningsfeil. Gitt at OD målingen er korrekt kan vi si at deteksjonsgrensen er minimum er 5 %. Ved konvensjonell PCR kunne vi ikke påvise mutasjon ved 25 % fortynning. Det betyr at deteksjonsgrensen for analysen er på over 25 %. Sammenliknet med konvensjonell PCR har vi senket deteksjonsgrensen fra over 25 % til 5 %. Dette stemmer overens med en tidligere studie, Cold PCR HRM av Boisselier B. et al. [17], der de har senket deteksjonsgrensen fra 25 % til 2 % ved bruk av Cold PCR HRM. 4.5 IDH2 Med utgangspunkt i resultat av sekvensering av Cold PCR 79oC, kunne prøvene som var negative for IDH1 mutasjon i prinsippet være positive for IDH2. Det ble påvist fem prøver positive for IDH1, hvilket gir seks mulige IDH2 mutasjon prøver. Samtlige prøver ble testet for IDH2 mutasjon ved bruk av konvensjonell PCR men det ble ikke påvist mutasjon. Det ble ikke gjort Cold PCR for IDH2 mutasjonen. 4.6 Feilkilder Ved måling av DNA konsentrasjon på NanoDrop ser vi at prøver med lav konsentrasjon har mye bakgrunnsstøy, og derfor høy ratio. Vi kan ikke vite med sikkerhet hva konsentrasjonen av DNA er der OD målingen er lav. Prøve 1, 2 og 4 har en DNA konsentrasjon som er RYHUQJȝO. Selv om konsentrasjonen er høy kan en ikke stole 100 % på at dette er den riktige konsentrasjonen. Dette vil få følger ved fortynningene vi har gjort til test av sensitiviteten. Prøve 2 viste ikke mutasjon ved 2 % fortynning, som kan ha noe med den opprinnelige DNA konsentrasjonen og gjøre. Prøve 10 ble brukt som villtype prøve for å lage fortynningene til prøve 1, 2 og 4. Denne ble brukt fordi den ikke viste mutasjon ved konvensjonell PCR, i tillegg er det et glioblastom grad IV. Vi kunne ikke være helt sikker på at denne tumoren ikke hadde mutasjon, så dette kunne ha interferert med prøvene våre. Men etter analysering av prøven med optimal temperatur ved Cold PCR ble det klart at tumoren ikke har mutasjon. Ser en bort fra OD målingen var ingen av de andre metodene vi har brukt kvantitativ. Pipetteringer har derfor liten eller ingen innvirkning på resultatene våre. 37 Universitetet i Tromsø Ved sekvensering kan det oppstå forstyrrelser som opptrer som bakgrunnsstøy under sekvenseringsanalysen. Dette kan feiltolkes som mutasjoner ved lite mutert DNA. Dersom der er mye bakgrunnsstøy på sekvensene kan en mistolke en mutasjon som bakgrunnsstøy. Det var problem med sekvenseringen i perioden vi hadde praksis, som skyldes at reagensene fra leverandør var av dårlig kvalitet. 5 Avslutning Vi har funnet en temperatur som viste seg å gi gode resultater for PCR maskinen som benyttes ved Molekylærpatologisk laboratorium, seksjon for spesialanalyser ved Klinisk Patologi, Universitetssykehuset Nord-­Norge. Cold PCR er et prinsipp som vil kunne øke sensitiviteten for mutasjonsanalyser, men krever nøye optimalisering for å være effektiv. Vårt forsøk viste at det ved bruk av konvensjonell PCR ikke kunne påvise mutasjoner i prøver fortynnet til 25 %. Ved bruk av optimalisert temperatur, Cold PCR med denatureringstemperatur 79oC, kunne vi påvise mutasjoner i prøver som var fortynnet til 5 %. Metoden kan benyttes til å skille gliomer fra andre hjernetumorer, da det kun er gliomer som har mutasjonen. Optimalisering av temperaturen gjør at metoden kan benyttes på IDH1 mutasjonsanalyser hvor en er usikker på gliomer av grad III og IV. I fremtiden kan påvist mutasjon bli et viktig hjelpemiddel i behandlingen ved bruk av målrettet behandlinger. 38 Universitetet i Tromsø 6 Kilder 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. GenSidene. Nukleotider i RNA og DNA. http://gensidene.uib.no/nukleotid.html. (05.05.11) Storstein, A., et al., Høygradige gliomer hos voksne. Tidsskriftet for Den norske legeforening, 2011. 131(3): p. 238. Damjanov, I., Pathology for the health professions. tredje utgave. 2006, St. Louis: Elsevier Saunders. Johannessen, T. Hjernesvulster hos voksne. http://legehandboka.no/nevrologi/tilstander-­og-­sykdommer/nevrokirurgi/hjernesvulster-­hos-­
voksne-­2490.html. (11.05.11) MedicinNet. Brain Tumor. http://www.medicinenet.com/brain_tumor/page5.htm#7whatare. (25.05.11) Forsdahl, K. and T.S. Thoresen, Grunnleggende molekylærbiologi. 5 ed. 2006, Tromsø: Eureka Horbinski, C., et al., Diagnostic use og IDH1/2 mutations analysis in routine clinical testing for formalin-­fixed, paraffin-­embedded glioma tissues. Journal of Neuropathology & Experimental neurology, 2009. 68(12): p. 1319-­1325. Datto, M. IDH1 mutation with reflex IDH2. 2010 http://clinlabs.duke.edu/DukeMolecular/TemplateTest.aspx?ID=10031&MenuItem=5. (12.05.11) NewsMedical. Mutated IDH1 gene has novel enzyme activity consistent with cancer-­causing gene: Study. 2009 http://www.news-­medical.net/news/20091123/Mutated-­IDH1-­gene-­has-­novel-­enzyme-­
activity-­consistent-­with-­cancer-­causing-­gene-­Study.aspx. (20.05.11) Fu, Y., et al., Glioma-­derived mutations in IDH: From mechanism to potentialy therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010. 397(2): p. 127-­130. Prensner, J.R. and A.M. Chinnaiyan, Metabolism unhinged: IDH mutations in cancer. Nature medicine, 2011. 17(3). Deimling, A.v., A. Korshunov, and C. Hartmann, The Next Generation of glioma Biomarkers: MGMT Methylation, BRAF Fusion and IDH1 Mutations. Brain Pathology, 2010. 21(1). Nørby, S., L. Rasmussen, and V. Kielberg, DNA og RNA: en håndbog. 2003, København: Gads forlag. 365 s. 14. 15. 16. 17. 18. Universitetet i Tromsø Dorak, M.T., Real-­time PCR. 2006, New York: Taylor & Francis. XXVI, 333 s. Milbury, C.A., J. Li, and G.M. Makrigioros. Ice-­COLD-­PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low-­abundance unknown DNA mutations. 2010 http://nar.oxfordjournals.org/content/39/1/e2.full-­text-­lowres.pdf. (11.05.11) Jacobsen, E. Elektroforese. http://www.snl.no/elektroforese. (05.05.11) Boisselier, B., et al., COLD PCR HRM: a Highly Sensitive Detection Method for IDH1 Mutations. Human Genome Variation Society, 2010. 31(12). USB. ExoSAP-­IT. 2009 http://159.226.13.34:8080/page/docs/ExoSAP-­IT_Protocol.pdf. (11.05.11) Vedlegg 1
DNA ekstraksjon med QIAamp DNA Mini kit
Utarbeidet av: Kristin Aaberg
Utarbeidet dato: 14.08.2009
Godkjent av: Thomas Berg
Dokumentnummer: PR3691
Gyldig for: Patologisk anatomisk avdeling UNN
Versjon: 2
INTRODUKSJON:
Kittet er basert på selektive bindingsegenskaper til en silica-basert membran. Kittet kan benyttes til
ekstraksjon av DNA fra bl.a. små volum av blod, små vevs prøver og rettsmedisinske prøver (både ferskt
og parafinmaterialet). Etter lysis tar ekstraksjonen av rent DNA mindre enn 30 min. Renset DNA er fri for
proteiner, nukleaser og andre urenheter. Utbytt er avhengig av volumet og kvaliteten til utgangsprøven.
PRINSIPP:
Prosedyren består av fire steg:
1. Lysering av prøven
Prøvene lyseres under sterkt denaturerende forhold ved høy temperatur, i tilstedeværelse av Proteinase K
og Buffer ATL
2. Binding av DNA til membranen i QIAamp MinElute kolonna
For å oppnå optimal binding av DNA til membranen tilsettes Buffer AL og etanol til lysatet. Lysatet
overføres til en kolonne, hvor DNA absorberes til silica-gel membranen når lysatet passerer ved
sentrifugering. Salt og pH forhold forsikrer at proteiner og andre kontaminanter ikke holdes igjen av
membranen.
3. Fjerning av kontaminanter ved vasking
Nukleinsyrer forblir bundet til membranen i kolonna, mens kontaminanter vaskes bort ved bruk av Buffer
AW1 og AW2.
4. Eluering av reint DNA
DNAet elueres fra kolonna ved Buffer AE . DNAet kan elueres i 50 – 200 ȝl. Volumet som elueres kan
være opp til 5 ȝl mindre enn det tilsatte eluerings-volumet. Hvis høy pH eller EDTA kan påvirke sensitive
nedstrømsreaksjoner bør DNAet elueres i vann (pH minst 7). DNA lagret i vann kan bli degradert ved
hydrolyse.
HENVISNINGER:
- www.qiagen.com/ts/msds.asp (datablad for reagenser)
- Protokoll: Uttak og homogenisering av ferskmateriale
- Protokoll: Prøvemateriale til molekylær patologi
Dette er kun en papirkopi. Gyldig versjon av dokumentet
finnes i det elektroniske kvalitetssystemet .
Side 1 av4
DNA ekstraksjon med QIAamp DNA Mini kit
REAGENSER:
Reagens
Leverandør
QIAamp DNA Mini Qiagen
kit (50 rxn): ulike
bufferløsninger
ATL, AL, AW1,
AW2, AE,
Proteinase K
Etanol (96-100%)
Sentrallager
MH
Versjon: 2
Bestillingsnumm Plassering
er
Cat. No. 56304
R7, Hovedlab
Skap 2, Hovedlab
Evt. Intern nr.
245
112
Lagring
Alle reagenser og kolonnene (QIAamp mini spin column ) lagres ved romtemperatur.
Proteinase K løsningen kan lagres ved romtemperatur i ett år, men ved lengre lagring bør den stå i
kjøleskap.
HMS
Buffer AL, buffer AW1 og Proteinase K kan virke irriterende.
UTSTYR:
0.5 ml rør
1.5 ml rør
vortexer
varmeskap
PCR maskin eller varmeblokk
FEILKILDER:
Kontaminering mellom prøver.
Ufullstendig lysering av prøven.
Utbyttet kan bli mindre hvis lysatet tilsettes i kanten av røret.
Filteret kan bli ødelagt ved berøring med pipettespissen.
Kontaminering av filteret med flow-through.
INDIKASJON:
KONTROLL:
-
Dette er kun en papirkopi. Gyldig versjon av dokumentet
finnes i det elektroniske kvalitetssystemet.
Side 2 av4
DNA ekstraksjon med QIAamp DNA Mini kit
Versjon: 2
UTFØRELSE:
- Prosedyren utføres i Avtrekk 1
- Løsningene skal være rom-tempererte (kittet oppbevares ved romtemperatur).
- Unngå å berøre filteret i kolonna med pipettespissen ved tilsetting av væske.
- Unngå å fukte kanten av røret ved tilsetting av væske.
- Fjern adaptere med flow-through forsiktig, slik at denne væska ikke kommer i kontakt med filteret
igjen.
- All sentrifugering gjøres ved romtemperatur.
- Hvis det er utfelling i Buffer ATL og AL, må dette løses opp ved inkubering ved 56ºC.
- Før start bør Buffer AW1 og AW2 blandes ved risting.
- Unngå unødvendig tining og frysing av lagrede prøver, da dette gir redusert DNA størrelse.
- Ferskt vev homogeniseres før ekstraksjon i Magnalyser. Se protokoll for uttak og homogenisering av
ferskmateriale
Blod
- Ekstrahere DNA fra to ulike blodprøverør (EDTA blod) per pasient, merket I og II.
- Blodet holdes på is, og vendes godt før uttak.
- Ta ut 2 ml blod i ett cryorør, for nedfrysing på ÷70°C. Lister over blodprøver og DNA for FAP pasienter
ligger under Molekylær Patologi\FAP\Liste blodprøver og DNA\ hvor den nye pasienten får koordinater
etter hvor i eska blodet skal stå.
ProteinaseK behandling av BLOD
1. Ha 20 ȝl Proteinase K i et 1,5 ml rør.
2. Tilsett 200 ȝl blod i røret.
3. Tilsett 200 ȝl AL buffer, og puls-vortex i 15 sek.
4. Inkuber ved 56ºC i 10 min.
5. Sentrifuger kort.
6. Fortsett videre med trinn 8 (binding av DNA til membranen i kolonna).
Vev
Fjerning av parafin
1. Skrap ut vevet med skalpell, og ha det i et 1,5 ml rør.
2. Tilsett 800 ȝl Xylen i røret, og bland godt ved å snu røret. La stå 10 min ved 56ºC.
3. Tilsett 400 ȝl absolutt etanol, og bland godt.
4. Sentrifuger i 2 min ved 13.000 rpm, og kast supernatanten.
5. Tilsett 1 ml absolutt etanol, og bland godt ved å snu røret.
6. Sentrifuger i 2 min ved 13.000 rpm, og kast supernatanten.
7. Tørk åpningen av røret på litt cellestoff, og deretter i varmeskap i 10 min ved 56ºC.
Dette er kun en papirkopi. Gyldig versjon av dokumentet
finnes i det elektroniske kvalitetssystemet.
Side 3 av4
DNA ekstraksjon med QIAamp DNA Mini kit
Versjon: 2
Proteinase K behandling av VEV
Utgangsmateriale: opp til 25 mg vev (ved parafin-vev har man en pellet i et 1,5 ml rør etter fjerning av
parafin; ved ferskt vev kuttes vevet opp, eller homogeniseres og haes i et 1,5 ml rør). Dersom ”Green
Beads” og Magnalyser benyttes tilsettes 100 ȝl ATL med Proteinase K og til vevet som er homogenisert i
PBS jmf protokoll: Uttak og homogenisering av ferskmateriale
1. Tilsett 180 ȝl ATL buffer i røret (100 ȝl ATL buffer for ferskt vev).
2. Tilsett 20 ȝl Proteinase K, og vortex.
3. Inkuber i 56ºC varmeskap over natt (dette gjelder fiksert materiale; ved ferskt materiale holder det
med 3 timer). Vortex gjerne underveis.
4. Sentrifuger kort.
5. Tilsett 200 ȝl AL buffer, og puls-vortex i 15 sek.
6. Inkuber ved 70ºC i 10 min.
7. Sentrifuger kort.
Binding av DNA til membranen i kolonna
8. Tilsett 200 ȝl etanol (96-100%), lukk røret, og puls-vortex i 15 sek.
9. Sentrifuger kort for å fjerne dråper i lokket.
10. Overfør forsiktig lysatet til en QIAamp Spin kolonne. Lukk lokket, og sentrifuger ved 8000 rpm i
1 min.
11. Kast væska og sett kolonna i en rein 2 ml adapter. (Sentrifuger en gang til hvis ikke alt lysatet har
kommet gjennom kolonna).
Vasking
12. Åpne kolonna forsiktig, og tilsett 500 ȝl AW1 buffer (For blod; Bruk 750 ȝl AW1). Lukk lokket,
og sentrifuger ved 8000 rpm i 1 min.
13. Kast væska og sett kolonna i en ny 2 ml adapter.
14. Åpne kolonna forsiktig, og tilsett 500 ȝl AW2 buffer. (For blod; Bruk 750 ȝl AW2). Lukk lokket,
og sentrifuger ved 13000 rpm i 3 min.
15. Kast væska og sett kolonna i en ny 2 ml adapter.
16. Sentrifuger ved full hastighet i 1 min, for å tørke membranen helt. (Etanol carryover kan
interferere med resten av ekstraksjonen).
17. Kast væska og sett kolonna i et 1.5 ml rør.
Eluering
18. Åpne kolonna forsiktig, og tilsett 100 ȝl AE buffer. (Bruk H2O hvis høy pH eller EDTA kan ha
noen innvirkning på analysene ekstraktet skal brukes til.) Elueringsvolumet vil være ca. 5 ȝl
mindre enn det volumet av elueringsløsning som ble tilsatt til kolonna.
19. Lukk korken, og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
20. Sentrifuger ved full hastighet i 1 min.
21. Mål OD i Nanodrop
22. DNAet lagres ved -20 °C
REFERANSER: QIAamp DNA Micro Handbook 08/2003
Dette er kun en papirkopi. Gyldig versjon av dokumentet
finnes i det elektroniske kvalitetssystemet.
Side 4 av4
Vedlegg 2
Nanaodrop-Spektofotometrisk måling av DNA og RNA
Utarbeidet av: Thomas Berg
Utarbeidet dato: 20.08.2009
Godkjent av: Thomas Berg
Dokumentnummer: PR19430
Gyldig for: Patologisk anatomisk avdeling UNN
Versjon: 1
Introduksjon:
Nanodrop er et spektrofotometer som måler OD-spektrum mellom 220-750 nm. Den krever kun 1-2 ul
prøve og vi benytter den til å måle konsentrasjon (OD 260) og renhet (ratio 260/280 og 260/230) til
nukleinsyrer. En kan måle konsentrasjon mellom 2-3700 ng/ul.
Utstyr:
-Nanodrop rom L9.220
-Pipette 0,5-10 ul
-Pipettespisser
-Vann
-Blank (elueringsbuffer)
-USB Minnepenn
-Penn og Papir
-Hansker
tas med fra lab (eske)
Utførelse:
-Log inn på PC (UiT nettverk)
-Plugg inn USB minnepenn
-Tørk av øvre og nedre del av ”pedestal” med linsepapir fuktet med vann.
-Start program ND 1000 v3.2.1
-Velg Nucleic Acids
-Følg instruksjon for å initere instrumentet
med vann (Bruk 2 ul). Det åpnes da et nytt
vindu.
.
Dette er kun en papirkopi. Gyldig versjon av dokumentet
finnes i det elektroniske kvalitetssystemet .
Side 1 av2
Nanaodrop-Spektofotometrisk måling av DNA og RNA
Versjon: 1
-Velg DNA-50 el RNA-40
-Tørk av pedestal og legg på 2 ul blank
(elueringsbuffer).
-Trykk blank. Tørk av.
-Legg inn sample ID (f.eks L47-06)
-Legg på 2 ul prøve. Trykk measureŹ
-Lagre resultat på USB minnepinne ved å
gå til Fil, save window (til E:\..)
-Tørk av ”pedestal” med linsepapir
-
Når man er ferdig tørker man over pedestal med fuktig linsepapir og legger et linsepapir i pedestal.
Lim inn spektra i loggark for prøven
Dette er kun en papirkopi. Gyldig versjon av dokumentet
finnes i det elektroniske kvalitetssystemet.
Side 2 av2
Vedlegg 3
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
64.5.6.69
Versjon
1
Utarbeidet av:
KE
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
Page 1 of 4
Q-test BIOMED2
Synonymer: Q-test. Specimen Control Size Ladder, multiplex PCR.
Introduksjon:
BIOMED2 Specimen Control Size ladder er et multiplex PCR utviklet under BIOMED-2
Concerted Action, se referanse henvisning, og først og fremst laget med tanke på
kvalitetstesting av DNA ekstrahert fra parafininnstøpt vev.
Multiplexen har 5 målgen med ulik fragment størrelser (100, 200, 300, 400 og 600bp),
resultatet er en stige av økende fragment lengder, se figur.
Grunnen til at det er viktig å kjøre en kvalitetstest på DNA fra parafinblokker er usikkerheten
rundt DNA konsentrasjon, kvaliteten på DNA og tilstedeværelse av PCR inhibitorer.
Kvaliteten og kvantitet på DNA:
Det vil være mange faktorer som påvirker kvaliteten på DNA fra parafinmateriale, og en har
sett at det er en kombinasjon av faktorer som er avgjør kvaliteten til prøven (en har ikke
funnet at en spesifikk faktor er mer avgjørende enn en annen).
x
x
Fikserings type og tid: Histologen på UNN bruker 10 % NBF (neutral-buffered formalin)
som er den vanligste og best egna. Fikseringstid varierer med type vev og størrelse. Større
biopsier trenger lengre tid på gjennomtrengning av fiksativet, og formalin degraderer
DNA.
Med store biopsier kan det være at forråtnelsesprosessen inntreffer før fiksering (en
utfordring med mamma preparat).
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
64.5.6.69
Versjon
1
Utarbeidet av:
KE
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
Page 2 of 4
Q-test BIOMED2
Synonymer: Q-test. Specimen Control Size Ladder, multiplex PCR.
x
x
x
x
x
x
Integriteten til DNA er også avhengig av alder på blokka, eldre blokker har en tendens til
å gi veldig degraderte fragment.
Lagring av ekstrakt før analyse.
Ekstraksjonsprosedyre: Flere protokoller for ekstraksjon fra parafinmateriale er publisert,
mange hjelper å redusere videre degradering samt redusere ko-ekstraksjon av PCR
inhibitorer, men er lite passende i rutinen. Vi renser DNA med kolonner (Qiagen kit) for å
fjerne flest mulig av de inhiberende elementene. I tillegg kan fortynning av DNA prøven
redusere konsentrasjonen av disse inhibitorene til et nivå som tillater amplifisering.
Den optimale mengde DNA for PCR har vist seg å ligge mellom 50ng og 100ng. En ser
en inhibering av amplifiseringen av store fragment (300bp eller mer) ved konsentrasjoner
rundt 500ng.
Selv om en kan få OK produkt med DNA på 5ng i kvalitetstesten, vil dette for eksempel
være en risikabel konsentrasjon ved klonalitetsanalyse av lymfomer (kan resultere i falsk
positiv test – små sub kloner). Dessuten har 5ng DNA ingen fordeler i forhold til en
fortynning på 50ng DNA.
OD-måling bestemmer mengde og renhet til DNA (forutsetter at ekstraktet er renset først)
men ikke kvaliteten dvs om DNA er degradert og heller ikke effekten av inhibitorer som
vil være tilstede. Fortynning av DNA vil ha en god effekt på inhibitorer, men hjelper ikke
om årsaken er degradering. Det anbefales at man setter opp minst to fortynninger av
prøven når man setter opp kvalitetstesten. Velger derfra den fortynningen som kom opp
best for videre analyse.
Prinsipp:
Multiplex PCR som kan gi 5 PCR produkt i størrelsesorden 100-600 bp. PCR produkt kan
analyseres ved agarosegelektrofores eller fragmentanalyse. Når Q-test gjøres som del av
klonalitetstest er det mest praktisk å analysere produktene på fragmentanalyse.
Henvisninger:
DNA ekstraksjon med QIAamp DNA Mini kit
Isolering av genomisk DNA fra Laser-mikrodissekert vev. QIAamp Micro Kit.
Nanodrop -Spektofotometrisk måling av DNA og RNA.doc
Støping av agarosegeler
Arbeidsskjema PCR oppsett BIOMED2 Kvalitetstest av DNA
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
64.5.6.69
Versjon
1
Utarbeidet av:
KE
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
Page 3 of 4
Q-test BIOMED2
Synonymer: Q-test. Specimen Control Size Ladder, multiplex PCR.
Reagenser:
Reagens
PCR.
Leverandør
JumpStart Taq DNA
polymerase
SigmaAldrich
Polyklonal kontroll IVS0000
InVivoScribe
Technologies
10x Primermix BIOMED
InVivoScribe
Multiplex:
Technologies
Specimen Control Size ladder.
Separering på agarose gel.
MedProbe
SeaKem“LE agarose
RedGel
Biotium
LB (loading buffer)
Promega
TrackIt 100bp Ladder
Invitrogen
Bestillingsnummer Plassering
D9307
Mastermix rommet:
Frys y20qC, skuff 1
Fryser/Kjøl hovedlab
Mastermix rommet:
Frys y20qC, skuff 1, eske merket Lymfom
Biomed2
Cat.No. 50004
Cat.No. G190A
Cat.No.
10488-058
Ved vektene på PCR/Elektroforese rom
Kjøleskap PCR rom
Kjøleskap PCR rom
Kjøleskap PCR rom
Utstyr:
x PCR maskin
x Pipettespisser med filtertips (nuclease-fri, og aerosolresistent.) Kan bestilles både på UiTø
og UNN-lageret. Plassering: reol 12, hylle 4
x 0,5 ȝl PCR-rør (PCR-gradert) Bestilles på universitetslageret. Plassering: reol 8, hylle 3.
x Elektroforeseutstyr til separering av PCR produktet.
Prøvemateriale:
x Ekstrahert DNA fra blod, frosset vev og parafininnstøpt materiale.
x Oppsett er laget med tanke på kvalitetstesting av DNA fra parafininnstøpt materiale.
x Ved lymfom settes prøven opp i paralleller med hhv 20 og 40ng/ul
x Dersom DNA konsentrasjonen er lavere en 40ng/ul fortynnes ikke prøven.
Positiv kontroll:
DNA fra polyklonal kontroll BIOMED. Skal gi produkter på opp til 600bp. Med ferdiglagd
primermix fra InVivoscibe ser vi 2 produkter på 92 bp og 98 bp, og ingen på 100bp.
Kontamineringskontroll
Sterilt H2O
Utførelse:
Fyll ut Arbeidsskjema BIOMED Q-test.doc.
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
64.5.6.69
Versjon
1
Utarbeidet av:
KE
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
Page 4 of 4
Q-test BIOMED2
Synonymer: Q-test. Specimen Control Size Ladder, multiplex PCR.
x
x
x
x
x
Fortynn prøve til 20 og 40ng/Pl i vann og finn frem IVS0000. Merk rør (0,5 Pl PCR rør)
og pipetter 2,5 Pl DNA i sine respektive rør.
Tin 10xprimermix Q-test i aluminiumsboks. Sentrifuger innholdet kort i en
mikrosentrifuge før åpning. Pipetter litt opp og ned (blander/homogeniserer innholdet) før
uttak.
1 rør (1,5ml micro fuge) merkes Q-test. Miks reagens i følge arbeidsskjema. Bland godt
med pipette.
Tilsett 22,5 Pl mastermix til hver prøve, og bland med pipetten uten å få bobler.
Settes i PCR-maskinen på følgende program.
USER: Lymfom
RUN: Biomed2.abi3100
PCR profil:
Denaturering:
Cykle: Denaturering:
Annealing:
Extensjon:
Final extension:
95°C
95°C
60°C
72°C
72°C
15°C
7:00
0:45
0:45 x 35
1:30
10:00
for ever
NB! Felles PCR program som IGK, IgH, BCL2/JH t(14;18) og TCR (ȕ, Ȗ, į) kit fra Biomed2/Invivoscribe.
(Eget PCR program for BCL1/JH t(11;14)).
x
x
Ta ut 1 ul av hvert PCR produkt og tilsett formamid/Rox. Det kan alternativt gjøres
agarosegelelektroforese (1,5 % agarose gel, 90V ca 1 time.).
Polyklonal kontroll skal gi produkter på 92, 98, 200, 300, 400 og 600bp. Dersom det ikke
lar seg gjøre å amplifisere større produkt enn 200 bp er kvaliteten av DNA i prøven dårlig,
og resultater fra andre analyser må tolkes i lys av dette.
Feilkilder:
Feil under pipettering
Feil programmering av PCR maskin
Referanser:
Ref 1 og 2 ligger i litteratur mappa under Lymfom.
1.
JJM van Dongen, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of
clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations:
Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.Leukemia (2003) 17, 2257–2317
IGK: se side 2275-2280.
2. Datablad som følger med kittet fra InVivoScribe Technologies.
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
Versjon:
1
Utarbeidet av:
AHK
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
1
BIOMED Q-test
Synonymer: ingen
Utført av: Studenter, Bio 08 (H.L, I.L,G.I)
Dato: 27.01.2011
DNA:
PAA Biopsi Nr.:
Mol. Pat. Nr.:
Fragm.str Q: 84,96,200,300,400 og 600bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 6
Prøve 7
Prøve 8
Prøve 9
Prøve 10
Prøve 11
Pos ktr (DNA biomed)
Negativ ktr (NTC) (tilsatt vann i stede for DNA)
Antall reaksjoner
15
—l pr. reaksjon Ant. Pl for totalt ant. reaksjoner
Komponent
dH2O
7,5
112,5
Jump Start
12,5
187,5
Q-test 10X Primermix
2,5
37,5
22,5
337,5
Total mastermix
DNA
2,5
ABI
--Mix:
PCR maskin nr ___:
PCR
Denaturering:
Denaturering:
Annealing:
Extension:
Final extension:
95°C
7:00
95°C
60°C
72°C
72°C
4°C
0:45
0:45 x 35
1:30
10:00
’
1Pl PCR produkt
9,5Pl formamid
0,5Pl Rox
-Leveres sekvenseringslab på Plan 6, MH (– 45422)
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
Versjon:
1
BIOMED Q-test
Synonymer: ingen
Utarbeidet av:
AHK
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
2
Vedlegg 4
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
Versjon:
1
Utarbeidet av:
AHK
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
1
PCR med IDH - primer
Synonymer: ingen
Utført av: H.L, I.L, G.I
Dato: 02.02.2011
DNA:
PAA Biopsi Nr.:
Mol. Pat. Nr.:
Fragm.str : 176 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 6
Prøve 7
Prøve 8
Prøve 9
Prøve 10
Prøve 11
Pos ktr (DNA biomed)
Negativ ktr (NTC) (vann i stede for DNA)
Antall reaksjoner
15
—l pr. reaksjon Ant. Pl for totalt ant. reaksjoner
Komponent
dH2O
7,5
112,5
Jump Start
12,5
187,5
IDH 1 10x primermix
2,5
37,5
22,5
337,5
Total mastermix
DNA
2,5
ABI
--Mix:
PCR maskin nr ___:
PCR
Denaturering:
Denaturering:
Annealing:
Extension:
Final extension:
95°C
7:00
95°C
60°C
72°C
72°C
4°C
0:45
0:45 x 35
1:30
10:00
’
1Pl PCR produkt
9,5Pl formamid
0,5Pl Rox
-Leveres sekvenseringslab på Plan 6, MH (– 45422)
Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Kvalitetssystem
Patologisk anatomisk avdeling
Dokument ID:
Versjon:
1
Utarbeidet av:
AHK
PCR med IDH - primer
Synonymer: ingen
Godkjent av:
Gyldig fra:
Revidert:
Side:
2
Vedlegg 5
Arbeidsskjema sekvensering IDH1
Direkte sekvensering av alle 4 exons:
BIG DYE Terminator Cycle Sequencing
PCR produkt rensing: 2 ul EXO-SAPIT + 5 ul PCR produkt. 37 °C. 15 min. 80 °C 15 min.
Fortynn PCR prod 1:5
PCR maskin nr ___:
Antall prøver
Big Dye
Sekvenseringbuffer (5x)
dH2O
Primer (1pmol/—l)
Mastermix pr prøve
PCR produkt (fortynnet 1:5)
Totalt sekvenserings rxn
NR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
PCR
prod nr
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
12
12
1
0,5
3,5
12
3
19
1
20
14
7
49
168
42
PCR maskin nr ___:
Sekvenserings
Program:
User: sekvensering
Run: sekvensering
PCR program: 96qC 10 sek
50qC 5 sek
60qC 4 min
4qC
Programmet tar ca 3 timer.
Prøve ID
Sekvenserings
primer
Prøve 1
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 5
Prøve 6
Prøve 6
Prøve 7
Prøve 7
Prøve 8
Prøve 8
Prøve 9
Prøve 9
Prøve 10
Prøve 10
Prøve 11
Prøve 11
Pos ktr (DNA biomed)
Pos ktr (DNA biomed)
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
IDH1 F
IDH1 R
Kommentar.