Transcript 2011_06_16_Mol_metoder - Oslo universitetssykehus

Molekylærbiologiske metoder
1
INGRID RANDEN
2011
Utvalgte molekylærbiologiske metoder
2
 PCR (konvensjonell og ’real time’)
 SNP analyser
 Sekvensering
 RFLP
 Southern, Northern og Western blotting
 Plasmid og ekspresjonskloning
 FISH
 Mikromatriser
 RNA interferens
Molekylærbiologiens historie
1953
Watson & Crick: DNA dobbelheliks
1966
Nirenberg, Mattaei, Khorana & Holley: Genetiske kode
1972
Berg: Første rekombinante DNA-molekyl
1975
Southern: Blotting
1975
Sanger: DNA-sekvensering
1978
Botstein: RFLP
1982
Augenlicht & Kobrin: Mikromatriser
1985
Mullis: PCR
1990
HUGO lanseres
1996
Dolly klones
2001
Humane genom publiseres
2001
Bass: RNAi
3
PCR:
4
 Renser (kloner) en bit av DNA vekk fra resterende genom
 Renset DNA kan brukes til:





Sekvensering
Diagnostikk av genetiske sykdommer
Deteksjon av virale infeksjoner
Identifisering av liten mengde materiale – rettsmedisin
SNP analyser
(med mer)
 Kvantitering av DNA eller mRNA (’Real time’ PCR)
Hva må til for å kjøre PCR?
5
 Templat: DNA (ev. mRNA)
 Primere
 Deoksynukleotider (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
 Taq polymerase
 Reaksjonsbuffer ([Mg2+] er viktig!)
 PCR maskin (Thermocycler)
6
Primerdesign er viktig for PCR:
7
 Primere skal være komplementære til DNA
 Alltid 2 primere; en for hver side av DNA-stykket som skal
amplifiseres (kalles ”forward” og ”revers” ev. sense og antisense)
 Primere skal være spesifikke, dvs. ingen homologi med annet
DNA
 Typisk lengde: 18-24 baser
 Smeltetemperaturen, Tm, skal være likest mulig for de to
primerne.
Deteksjon av PCR produkter skjer ved farging av det amplifiserte
DNA med ethidiumbromid og elektroforese i en agarose gel
8
PCR er en eksponensiell amplifisering
9
Konvensjonell PCR sammenlignet med ’real time’
10
 Konvensjonell PCR er en endepunktsdeteksjon:






Dårlig presisjon
Lav oppløselighet
Lav sensitivitet
Ikke automatisert (må kjøre gel for å få resultatet)
Resultatet er ikke numerisk uttrykt
Ethidiumbromid-farging er ikke særlig kvantitativt
Kvantitering ikke mulig med konvensjonell PCR.
11
Ethidium bromid farging av
gel etter konvensjonell PCR
’Real time’ PCR hvor økning i PCR-produkt kan
følges på skjerm
’Real time’ PCR (Eks. Lightcycler)
12
 Deteksjon skjer ved et fluorescens-signal vist på skjerm under
PCR-reaksjonen  slipper gel-elektroforese og ethidium bromid
 Fluorescens-signalet er proposjonalt med mengde DNA 
kvantitativt mål for mengde DNA i utgangsmaterialet
 Hybridiseringsprober i tillegg til primere  konfirmasjon av
PCR-produktets identitet
 Hybridiseringsprober er spesielt godt egnet til
smeltepunktsanalyse og mutasjonsdeteksjon
SNP (single nucleotide polymorphism):
13
 SNP finnes i gjennomsnitt 1/1000 baser i det humane
genom
 Viktige redskap for genetisk testing, identifisering av
sykdomsgener og farmakagenomikk
 Ønskelig med raske metoder som kan undersøke store
DNA-områder på kort tid
Mutasjonsdeteksjon: Deteksjonsproben må dekke
mutasjonsstedet og være komplimentær til vill-typen
14
Mutasjonsdeteksjon:
15
 Hybridiseringsprobens Tm avhenger av homologi med templatet
 En probe med én mismatch i forhold til templatet vil smelte av
ved lavere temperatur enn en probe med 100% homologi
Ved sakte heving av temperaturen vil proben med laveste
smeltetemperatur, Tm, dvs. dårligste komplimentaritet med templatet,
smelte av først. Dette detekteres som et fall i fluorescence fordi
probene ikke lenger er nær hverandre.
16
Sekvensering :
(Sanger, F. et al., J Mol Biol 1975; 94, 441)
17
 Forutsi aminosyresammensetningen i proteiner
 Kartlegge gener (HUGO)
 Identifisere exons (proteinkodende regioner) innen
gener
 Identifisere regulatorområder (promotor, enhancer
etc.)
 Identifisere konserverte sekvensmotiv mellom arter
 Identifisere SNP
(med mer)
Sanger sekvensering :
(Chain terminator method)
18
 To trinns prosess:

DNA som skal sekvenseres er templat for enzymatisk syntese
av nytt DNA. Syntesen begynner ved et definert primersete

Inkorporering av dideoksy-nukleotider stopper reaksjonen
(tilfeldig)
Hva må til for å sekvensere?
19
http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/sequencing/sequencing.html
Deoksynukleotider er
byggesteinene i DNA
molekylet
Dideoksynukleotider mangler
3’-OH-gruppe
Inkorporering av et
dideoksynuklotid stanser
polymerisering
Reaksjonen kjøres med
dNTP/ddNTP > 1
http://www.bio.davidson.edu/courses/Bio111/seq.html
20
Merking med fluorescein : Ikke radioaktivitet, en kolonne på gelen, og
automatisering
21
Til venstre :
Radioaktiv sekvensering
hvor fire
sekvenseringsreaksjoner
kjøres parallelt. DNA
separeres ved
elektroforese på en
polyacrylamid /urea-gel.
DNA-båndene
visualiseres ved
røntgen-film og
sekvensen leses
nedenfra
Til høyre:
Dye-terminator
sekvensering. Hver av
dideoksynukleotidene
merkes med ulik
fluoriscerende farge og
kan kjøres i samme
sekvenseringsreaksjon
Sekvensering brukt til mutasjonsdeteksjon
© 2003 by Steven M. Carr
22
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
Gammel molekylærbiologisk metode:
* Screening av sykdomsgener
* DNA-fingeravtrykk i rettsmedisin
Fordel: Meget nøyaktig
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RFLPs.html
23
Prinsipp for RFLP:
24
Restriksjonsenzym EcoRI
RFLP metode:
Digestion
Restriction
Apply to
Gel
DNA
Fragments
DNA Fragments on
Membrane
Electrophoresis
Southern
Blotting
Hybridized Fragments
Autoradiogram or
Lumigram
25
Sigd-celle anemi: RFLP identifiserer SNP:
Arvelig recessiv sykdom hvor glutaminsyre i posisjon 6 i beta-kjeden av
hemoglobinet er byttet ut med valin
SNP-en gjenkjennes av et restriksjonsenzym
Syk, CCTGTGG
Frisk, CCTGAGG
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RFLPs.html
26
Southern blot:
•
Dobbelttrådet DNA-fragmenter separeres på gel
•
Nitrocellulosepapir eller nylonmembran legges over gelen og
papirhåndklær legges på toppen. Bufferen trekkes i gjennom mens den
denaturerer DNA slik at enkelttråder fester seg på nitrocellulosen.
•
Nitrocellulosen fjernes forsiktig fra gelen.
•
Nitrocellulosepapiret legges i en buffer som inneholder radioaktivt
merket probe. Papiret vaskes grundig slik at bare probe som er bundet
til DNA er tilbake.
•
Papiret legges sammen med en film som svertes der hvor proben har
bundet seg.
Northern blot fungerer på samme måte, men med sekvenser
spesifikke for mRNA i stedet for DNA
27
DNA kloning
1
1
2
y
y
1
1
3
y
y
1
1
1
y
y
4
1
1
6
y
y
1
1
5
y
y
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/index.php#Anchor-Biological-3800
28
Ekspresjonskloning
Protein
29
FISH: fluorescence in situ hybridization
30
 Lokalisering av gener på kromosomer
 Deteksjon av kromosom abnormaliteter:
 aneuploiditet
 translokasjoner
 mikrodelesjoner
Prinsipp for FISH:
31
Interfase (kjerne)-FISH: aneuploiditets test
32
http://members.aol.com/chrominfo/intfish.htm
Trisomi 21: Grønn = kromosom 13, Rød = kromosom 21
Metafase-FISH: Deteksjon av BRCA2 på kromosom 13
http://pathology2.jhu.edu/pancreas/geneticsweb/fish.htm
33
Mikromatriser
34
 Kvantitere og sammenligne genekspresjon i stor
skala
 Brukt mye til klassifisering av maligne
sykdommer
 Øyeblikksbilde/tidsstudier (for eks. cellesyklus)
 Tidkrevende og dyrt – planlegg nøye:
MIAME = minimum information about a microarray experiment
(http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html)

http:// pga.maw.edu/pga/jsp/components/education/CHS_2001_Kwitec
35
Rødt representerer kontroll cDNA
Grønt representerer prøve cDNA
Gult representerer en kombinasjon av prøve og
kontroll hvor begge hybridiserer likt til proben
Svart representerer områder hvor verken prøve
eller kontroll har bundet seg
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/microarrays.html
36
Hierarkisk clustering:
Dendrogram som baserer seg på
at co-ekspresjon indikerer co-regulering
Korte grener indikerer høy korrelasjon
Lange grener indikerer lav korrelasjon
37
Hvor mange gener er
involvert i cellesyklusregulering?
Studier av HeLa cellelinjen
viste at 850 gener har
periodisk ekspresjon
gjennom cellesyklus.
From the following article:
Common markers of proliferation
Michael L. Whitfield, Lacy K. George, Gavin D. Grant
and Charles M. Perou
Nature Reviews Cancer 6, 99-106 (February 2006)
38
To-farge kontra en-farge mikromatriser
39
To-kanals
En-kanal
Måler relativ forskjell i genekpresjon
Måler absolutt nivå av genekspresjon
Har samme probe på flere forskjellige
steder på chipen
Foretrukket for målinger mellom
forskjellige typer vev, tidspunkter etc
Har prober med ”perfect match” (PM) til
genet og prober med en ”mismatch” (MM)
i midten av proben – kan korrigere for
uspesifikk binding
Agilient, Eppendorf, Telechem
Affymetrix, Applied Microarrays, Eppendorf
40
RNA interferens (RNAi):
41
 Translasjonskontroll
 mRNA ødelegges vha sekvensspesifikk degradering
 Resultat
 Redusert / ingen genekspresjon
 Brukes til
 Genfunksjonsstudier
1) Lange dsRNA -biter transfekteres inn i cellen
2) Dicer (RNAse III enzym) kutter dsRNA inn i
mindre biter (siRNA)
3) siRNA biter (21-25 nt lange) binder seg til RNAinducing silencing complex (RISC)
4) siRNA denatureres (vha ATP), RISC aktiveres og
binder mål-mRNA. Subenheter av RISC kutter mRNA
5) Andre proteiner degraderer mRNA ytterligere og
hindrer ekspresjon av målproteinet
42
Eksempel på ”knock out” av enzymet GAPDH
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
ved hjelp av RNAi i HeLa celler:
I venstre panel:
Tilfeldig siRNA introdusert (ikke komplementært til
GAPDH mRNA)
I høyre panel:
siRNA komplementært til GAPDH slår ut mRNA
og proteinet blir ikke uttrykt
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/siRNA.htm
Rødt: Merket siRNA
Blått: Kjernefarging
Grønt: GAPDH protein
43