KJB220

PCR - polymerase chain reaction

Prinsipp og metode

1

KJB220

PCR - prinsipp

• • • •

PCR er primer-mediert enzymatisk amplifisering av spesifikke DNA-sekvenser (genomisk eller klonet) ca. 10 år gammel metode som har revolusjonert molekylærbiologien (

og gitt Nobelpris til Kary Mullis

) Syklisk prosess av tre trinn

– denaturering av dsDNA templat – annealing av to motsatt rettede primere til ssDNA templat – elongering av ny komplementær DNA v.hj.a. varmestabil DNA polymerase

Akkumulering av dsDNA med eksponesiell hastighet

– Hver syklus skulle i teorien doble mengden DNA – I praksis er effektiviteten av hver syklus <1 slik at Y = X (1 + eff.) n – Amplifisering når et platå etter 10 5 til 10 9 fold økning 2

KJB220

PCR - prinsipp

En syklus Denaturering 94 o C 72 o C 55 o C

Tid Temp.

Annealing Elongering

Tid

3

KJB220

4

KJB220

Dobling trinn for trinn

5

KJB220

Eksponensiell amplifikasjon

6

KJB220

Eksponensiell økning

PCR-basis: N = N

0

x 2

n – N: antall amplifiserte molekyler – N 0 : opprinnelig antall molekyler – n: antall sykler Amplification curve 7

KJB220

Bruk

•

Analytisk

– Påvise nærvær av en spesifikk sekvens i et biologisk materiale • Spesifisitet bestemt av primere, forventet størrelse, eventuelt hybridisiering – Medisin - diagnostikk (f.eks påvise mutasjoner knyttet til sykdom), – Mikrobiologi - påvise mikroorganisme, – Rettsmedisin - biologiske spor, – Arkeologi osv.

•

Syntetisk

– Verktøy for å modifisere DNA – Innen forskning: Lett å legge til startkodon, stoppkodon, restriksjonsseter, mutagenese 8

KJB220

PCR enzymer

• • • •

Varmestabil DNA polymerase

– dNTP  DNA templatavh. primeravh.

Vanlig brukte

– Taq DNA pol.

– Vent DNA pol.

– Pfu DNA pol.

5´-3´-Exonuclease

– Degraderer nedstrøms primer - lineære templater optimalt

3´-5´-Exonuclease

– Proofreading - korrigerer feilinkorporeringer – Taq uten proofreading, Vent og Pfu med proofreading 9

KJB220

Primere

• • • • •

Typisk lengde 15 -28 nukleotider

– 50 - 60% GC

Tm bestemmes av sekvens og reaksjonsbetingelser

– Tm = temp hvor 50% av primer har hybridisert (dsDNA) og 50% er fri (ssDNA) – Kan grovt estimeres som Tm = 2x [#AT-bp] + 4x [#GC-bp] – Kan mer presis estimeres av dataprogrammer – Salt stabiliserer: Tm avtar med fallende ionestyrke

Optimal annealingstemp = Tm - 5˚C

– normalt mellom 55 og 72 ˚C

Balansert Tm for de to primere Konsentrasjon: 0.1 - 0.5 µM

– For høy kons fremmer misinkorporering, falsk priming og primer-dimer dannelse 10

KJB220

Primere - kriterier for design

• • • •

Annealing av primer til templat kritisk trinn i prosessen

– optimalt: bare annealing til spesifikke områder – i praksis: også falsk priming til uspesifikke områder

Unngå komplementære 3´-ender - fremmer primer dimer

– 40 - 60 bp produkt – forbruker primere og enzym, reduserer utbytte

Unngå G-serier og C-serier (> 3nt) i 3´-enden

– fremmer falsk priming i GC-rike områder

Unngå interne palindromer

11

KJB220

Primernes 5´-ende: sted for tillegg

• • •

5´-ende av primerne trenger ikke være komplementære med templat DNA Blir presist inkorporert i sluttprodukt Egnet til å legge til restriksjonskuttesteder, promotersekvenser, ATG-translasjonsstart, stop kodons osv.

ATG Stopp PCR Restriksjonskuttested ATG Gen Stopkodons Restriksjonskuttested 12

KJB220

DNA templat

• • •

Renhet ikke kritisk

– En av fordelene med PCR er nettopp at spesifikke DNA-molekyler i en kompleks blanding kan amplifiseres (nåla i høystakken identifiseres ved å amplifisere nåla) – Basis for bruk av PCR i kriminalsaker – Kurset: amplifisere direkte fra en bakteriekoloni – Forurensinger kan inhibere DNA polymerasen

Mengde

– 1 molekyl nok – 100.000 molekyler anbefales – nanogram mengder av klonet DNA – mikrogram mengder av genomisk DNA

Også RNA kan brukes

– omdannes til ssDNA templat via revers transkriptase 13

KJB220

PCR-maskiner og rør

• • • •

Maskiner: programmerbar varmeblokk “Hold-time” må være tilstrekkelig til temp.likevekt

PCR-rør: tykkelsen av plastveggen bestemmer tid for temp.likevekt

– polypropylen tynnveggede optimalt – Ned til 15 sek ekvilibreringstid

Problem med fordampning:

Olje

– Oljedekke over

PCR-mix

– Varme i lokk hindrer kondensasjon og væsketransport

Varme i lokk hindrer kondens PCR-mix

14

KJB220

Valg av PCR-syklus

• • • • •

Denaturering temp. og tid

– 94 ˚C i 5 min., 95 ˚C i 30 sek., 97 ˚C i 15 sek.

– For høy: enzymet inaktiveres – For lav: snapback av templat 94 o C Denaturering

Annealingstemp. og tid

– Temp. justeres for hvert sett av primere – Tid: 30 sek nok 72 o C Elongering

Tid Elongeringstemp. 72 ˚C

55 o C

Tid Temp.

Annealing

Elongeringstid

– 35 -100 nt pr sek – Justeres for hver reaksjon utfra regel om at man pr minutt kan lage 1- 2 kb DNA – Kan økes utover i programmet når enzym/templat ratio avtar

Antall sykler

– Med størrelsesorden 10 5 templatmolekyler brukes 25 -30 sykler – Bruk ikke flere enn nødvendig (bakgrunn øker) 15

KJB220

Optimalisering av reaksjonsbetingelser

• •

Mg ++ konsentrasjon

– DNA pol. krever fri Mg ++ – [Mg ++ ] påvirker flere trinn (annealing, polymerase osv) – Flere komponenter i blandingen (særlig dNTP) binder Mg ++ overskudd av fri [Mg ++ ].

. Viktig at det er tilstrekkelig – Ved optimalisering: varier [Mg ++ ] i trinn på 0.5 mM

dNTP ( ekvimolar blanding av dGTP, dATP, dCTP, dTTP )

– Optimalt mellom 20 og 200 µM • 20 µM i 100 µl nok til 2.6 µg DNA (400 bp) – Lav konsentrasjon best mhp spesifisitet og fidelitet – Stabilitet: 50% igjen etter 50 cycler 16

KJB220

Optimalisering av reaksjonsbetingelser forts

• • •

Buffer og salt

– 10 - 50 mM TrisHCl som buffer – pH 8.3 justert ved RT (husk temp avh.: gjennom sykler 6.8 - 7.8) – Opptil 50 mM KCl for å fremme primer annealing (for høy salt hemmer enzym)

Enzymmengde

– Taq DNA pol.: 1 - 2.5 enheter – Ved optimalisering: varier fra 0.5 - 5 enheter pr. 100 µl – For mye enzym: uspesifikke produkt – For lite enzym: lavt utbytte

Andre tilsetninger

– BSA for å stabilisere enzymet – Ikke-ioniske detergenter (Tween 20) også for å stabilisere enzymet – DMSO eller glycerol kan ha fordelaktig effekt på vanskelige templater 17

KJB220

Analyse av PCR-produkt

•

Agarosegel elektroforese

Forventet Størrelse - et bånd Mange ekstra bånd Bånd av feil størrelse

Troubleshooting?

18

KJB220

Troubleshooting

• • • •

Problem: ingen produkt

–

TILTAK

: • Optimalisering av reaksjonsbetingelser (titrere enzym, Mg..) • Optimalisering av temperaturer / tider i PCR programmet

Problem: falske produkt

–

TILTAK

: • Høyere annealingstemp.

• Hot start • “Strupende” betingelser: mindre enzym, mindre dNTP, færre sykler • Renslighet (“carryover” problematikk)

Problem: primer-dimer

–

TILTAK

: som over + design

Problem: PCR-genererte mutasjoner

–

TILTAK

: • Proofreading enzym • Blanding av proofreading enzym og Taq • Senke dNTP konsentrasjon 19

KJB220

Stringens

• • • •

Hot start

– Tilsetning av enzym etter oppvarming hindrer elongering av falsk priming

Voks

– holder komponenter adskilt inntil temp blir så høy at voksen smelter

Inaktivt enzym (AmpliTaq Gold)

– reaktiveres etter inkubering ved 92-95 ˚C i 9-12 min

Mix av enzymer

– Taq + proofreading varmestabil polymerase – Den siste korrigerer feilinkorporering som stopper elongering 20

KJB220

RT-PCR

• • •

Mye brukt anvendelse av PCR

– for å detektere og kvantitere eukaryote RNA species isolert fra ulike vev eller cellulære kilder.

To trinn

– 1. Første-tråd cDNA syntese med revers transkriptase, dNTP og primer – 2. PCR

Primer til første-tråd cDNA syntese

– pd(N)6 Primer (random hexamers) – Not I-(dT)18 RT PCR 21

KJB220

Real-time PCR: PCR til kvantitering av RNA/DNA

• • •

RNA isolering cDNA-syntese PCR med fluorescense deteksjon

– Analyse med real-time PCR på et instrument som har on-line deteksjon av fluorescence 22

KJB220

Deteksjon av PCR-produkt mens de dannes via fluorescense

Alternativ I: SYBR-green måling av akkumulert total DNA Alternativ II: Hybridiserings-prober måling av akkumulert spesifikk DNA

23

KJB220

Mye templat Mindre templat

Real-time PCR: prinsipp for kvantitering

Instrumentet genererer en lineær standard kurve som gir sammenhengen mellom utgangsmengder templat og antall PCR-sykler

Med en serie av kjente mengder input, lages en standardkurve som ukjente prøver kan kvantiteres utfra.

Standard curve

n linear Log N 0

Formula for compared reactions

Noiseband = log N 0 + n log2 Starting amount (known or estimated) # cycles at cross-point (measured) 24