Transcript pour quelles avancées en microbiologie médicale

NOUVELLES TECHNIQUES :
POUR QUELLES AVANCÉES EN
MICROBIOLOGIE MÉDICALE
Dr Frédérique GOURIET
Fédération de Bactériologie Virologie et Hygiène hospitalière
URMITE CNRS-IRD UMR 6236
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
1
Immunochromatographic
or agglutination
assay
Direct examination
and culture
Real-time PCR
Point of care (POC)
laboratory
assays < 2 hours
Syndrome and disease-based sampling kits
Automated blood
culture monitoring
Diversified
culture conditions
Local, national and
/or international
alert
Transport
Phenotypic identification and
antibiotic susceptibility testing
Core
laboratory
Real-time
genome
sequencing
Molecular detection and
identification
Manual biochemotype
and antibiogram
PCR
Automated biochemical
phenotype and antibiogram
Unidentified
or unusual
bacterium
New or atypical
bacterium
MALDI-TOF MS
15es JNI, BordeauxPhenotypic microarray
du 11 au 13 juin 2014
Sequencing
Metagenomics
SMS message,
Laboratory
website
Strain
2
collection
Nouvelles applications de la spectrométrie de masse au
laboratoire de Microbiologie
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
3
Nouvelles applications de la spectrométrie de masse au laboratoire de
Microbiologie
Identification de souche bactérienne
 identification directe sur flacon d’hémocultures
Identification directe sur les urines
des bactéries
Biotypagedetection
d’une épidémie

Surveillance d’une épidémie
Identification de clones
 Détection rapide de la résistance aux antibiotiques par MALDI-TOF
Carbapénémases chez les bactéries à gram négatif
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Apport de la Spectrométrie de masse pour le diagnostic
microbiologique
Analyse MALDI-TOF
Micro-organisme inconnu
Dépôt sur une cible
Interprétation des données
Banque de données
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
5
Interprétation des résultats
• Comparaison par souches
• 3 niveaux d’identification
– Log supérieur ou égal à 2:
identification d’espèce
– Log entre 1,7 et 2,0: identification
de genre
– Log < à 1,7: absence
d’identification
Biologie moléculaire
Incrémentation de la Base de données Bruker Biotyper
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
6
Performances des différents
Spectromètre disponible pour la microbiologie
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Problèmes d’identification :Discordance MALDI_Tof et identification
classique
Phénotypique en spectrométrie de masse
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Identification phénotypique classique / spectrométrie de masse
•
Problèmes du choix du système
d’identification:
–
–
•
Gram
Tests d’orientation (catalase, oxydase…)
Diversité phénotypique:
– Base de données: nombre importants
de souches par espèce
– Chevauchement des phénotypes
•
Choix préalable inutile
•
Colonie ou échantillon
hémoculture/urines
•
Une seule base de donnée pouvant
être constituée par une seule
souche par espècemodulable
•
Profils protéiques provenant en
grande partie par des protéines
ribosomales
•
Résultat rapide
•
Coût concurrentiel
• Choix multiples
•
Souches déficientes
– Variant
– Inoculum insuffisant
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Détection d’une épidémie
10
9
9
8
N° of patient
7
6
6
5
4
4
3
2
2
1
0
2005
2006
2007
2008
year
18 souches
Issues de13 patients
Arbre phylogénétique position des Corynebacterium spp. comparaisons MALDI-TOF (A) et
sequences partielle ARN –sous unité beta de polymerase gene rpoB (B).
Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 16, No. 8, August 2010
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Surveillance d’une épidémie
Staphylococcus aureus et mucovicidose
MSP Dendrogram
•
•
•
622 isolats
5 clusters
Cluster associations
–
–
C1
Origine Geographical
•
•
Algérie, ST80 (C1)
Marseille (C2-C5)
•
•
Patients non-mucovicidosique (C5)
Patients mucovicidosique
C2
Origine Clinique
–
–
C3
C1 and C2 : children
C3 and C4 : adults
C4
C5
1000
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
900
800
700
600
500
Distance Level
400
300
200
100
 Clusters identification de phénotypes
0
Epidémie et origine géographique
Klebsiella pneumoniae
MSP Dendrogram
Marseille - France
Algeria
1000
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
900
800
700
600
500
400
Distance Level
300
200
100
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
K.
0
pneumoniae 71
44
24
pneumoniae
51
70
pneumoniae
151
143
pneumoniae
139
43
141
pneumoniae
56
26
pneumoniae 124
140
132
57
pneumoniae
122
NCTC13443
pneumoniae
29
127
pneumoniae
72
45
pneumoniae
25
107
39
pneumoniae 145
162
4
15
pneumoniae
101
pneumoniae
8
100
153
pneumoniae
9
13
pneumoniae 135
154
42
pneumoniae
142
33
pneumoniae
55
155
pneumoniae
48
152
pneumoniae
134
136
pneumoniae
69
95
pneumoniae
89
14
pneumoniae
133
157
pneumoniae
73
21
pneumoniae
83
87
pneumoniae
103
163
pneumoniae
161
160
pneumoniae
166
pneumoniae
165
164
pneumoniae 168
167
159
pneumoniae
158
28
pneumoniae
46
150
pneumoniae
54
138
pneumoniae
84
126
pneumoniae
30
111
156
pneumoniae
12
114
102
pneumoniae
146
148
pneumoniae
92
37
pneumoniae
11
93
pneumoniae
61
59
pneumoniae
81
18
147
pneumoniae
53
47
pneumoniae
105
149
pneumoniae
68
137
pneumoniae
41
58
pneumoniae
49
22
pneumoniae
91
120
pneumoniae
106
99
pneumoniae
85
35
pneumoniae
104
80
118
pneumoniae
112
97
pneumoniae
86
75
pneumoniae
96
60
pneumoniae
16
144
pneumoniae
10
31
23
pneumoniae
90
17
66
pneumoniae
98
76
pneumoniae
119
125
pneumoniae
20
78
pneumoniae
110
94
pneumoniae
77
6
32
pneumoniae
3
62
pneumoniae
74
38
pneumoniae
2
5
pneumoniae
123
82
pneumoniae
115
pneumoniae 19
40
113
pneumoniae
7
117
pneumoniae
79
169
pneumoniae
109
36
pneumoniae
34
65
pneumoniae
52
27
pneumoniae
116
1
pneumoniae
121
pneumoniae
67
63
pneumoniae 88
108
64
pneumoniae
130
128
SKP20
pneumoniae
KP89
CSUR
P130
pneumoniae
131
OKP2
pneumoniae
129
KP93
pneumoniae
OKP12
KP92
pneumoniae
KP68
OKP14
KP88
pneumoniae
KP87
KP67
pneumoniae
OKP4
KP90
pneumoniae
KP86
KP85
pneumoniae
KP65
KP102
pneumoniae
SKP16
KP82
OKP1
pneumoniae
KP96
OKP11
pneumoniae
KP81
KP69
pneumoniae
KP95
SKP21
pneumoniae
SKP17
KP83
pneumoniae
KP101
SKP6
pneumoniae
KP79
SKP25
KP98
pneumoniae
KP64
SKP1
OKP6
pneumoniae
OKP3
OKP7
pneumoniae
SKP30
KP77
KP76
pneumoniae SKP23
KP70
KP80
SKP26
pneumoniae
OKP13
SKP22
pneumoniae
KP62
OKP10
pneumoniae
KP78
KP73
OKP8
pneumoniae KP61
KP63
SKP27
pneumoniae
SKP28
KP74
pneumoniae
OKP15
SKP29
pneumoniae
SKP15
SKP9
SKP7
pneumoniae
SKP14
OKP9
OKP5
pneumoniae SKP4
SKP8
SKP2
pneumoniae
SKP3
Détection des carbapénémases par MALDI-TOF
Intens. [a.u.]
Klebsiella pneumoniae Sensible Imipénème – Test Imipénème
IMP : pic spécifique à 300 m/z
x10 5
2.0
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:F8 MS Raw
1.5
Matrice +Nacl
1.0
Intens. [a.u.]
0.5
0.0
x10 5
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:G7 MS Raw
1.5
IMP 1 B T0
1.0
Intens. [a.u.]
0.5
0.0
x10 4
6
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:M10 MS Raw
IMP 1 B T1
4
Intens. [a.u.]
2
0
x10 4
6
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:M20 MS Raw
IMP 1 B T2
4
2
0
240
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
260
280
300
320
340
360
380
m/z
Détection des carbapénémases par MALDI-TOF
Intens. [a.u.]
Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive – Test Imipénème
IMP : pic spécifique à 300 m/z
x10 4
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:F7 MS Raw
Matrice +Nacl
1.5
1.0
Intens. [a.u.]
0.5
0.0
x10 5
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:J15 MS Raw
IMP 1 B T0
0.8
0.6
0.4
Intens. [a.u.]
0.2
0.0
x10 4
6
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:A11 MS Raw
IMP 1 B T1
Disparition de l’IMP à T1
4
Intens. [a.u.]
2
IMP 1 B T2
0
x10 4
6
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:N19 MS Raw
5
4
3
2
metabolite
1
imipenem
0
250
260
270
280
290
300
310
320
330
m/z
H
N
H
HN
15es JNI, Bordeaux O
du 11 au 13 juin 2014
S
NH
C11H17N3O2S
H
N
OH
H H
carbapenemase
S
N
O
OH
O
OH
NH
C12H17N3O4S
Détection des carbapénémases par MALDI-TOF
Intens. [a.u.]
Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive – Test Méropénème
MER: pic spécifique à 384 m/z
x10 5
1.5
Matrice+NACL
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:F7 MS Raw
1.0
Intens. [a.u.]
0.5
0.0
x10 5
1.0
MER 1 B to
0.8
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:M15 MS Raw
0.6
0.4
Intens. [a.u.]
0.2
0.0
x10 5
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:J11 MS Raw
MER 1 B t1
1.5
1.0
Disparition de MER à T1
Intens. [a.u.]
0.5
0.0
x10 5
MER 1 B t2
2.0
essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0:J21 MS Raw
1.5
1.0
0.5
0.0
360
370
380
390
400
410
420
m/z
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Détection des carbapénémases par MALDI-TOF
Table 1. Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS
MALDI-TOF analysis
Strain type :No. of isolates
Range of the ratio of the area of
No. of isolates detected as carbapenemase
(Location of isolates [ No.of isolates])
imipenem/metabolite based on the time of
producers based on the time of incubation
incubation
2h
4h
2h
4h
<0.01-1.77
<0.01-0.26
67
70
K. pneumoniae KPC :1
<0.01
<0.01
1
1
K. pneumoniae NDM-1: 2
<0.01
<0.01
2
2
P. aeruginosa VIM : 2
<0.01
ND
2
2
P. aeruginosa IMP : 2
<0.01
ND
2
2
<0.01-1.77
<0.01-0.39
54
57
<0.01
0.02-0.04
3
3
<0.01-0.48
<0.01-0.26
3
3
<0.01-12.86
<0.01 -14.84
0
0
K. pneumoniae ESBL : 31 (Algeria)
ND
0.64-14.84
0
0
K. pneumoniae non ESBL : 4 (Algeria)
ND
1.24-5.82
0
0
Escherichia coli ATCC 25922 (1)
1.64
1.17
0
0
0.61-12.86
0.76 -3.26
0
0
Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC >8 mg/L)
A.baumannii blaOXA23-like : 57 (Marseille [17], Algeria [40])
A.baumannii blaOXA24-like : 3 (Algeria)
A.baumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like : 3 (Algeria)
Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC ≤2 mg/L)
A. baumannii : 43 (Marseille [1], Algeria [42])
Sensitivity = 100% ; Specificity = 100% (t=4h)
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Diagnostic rapide en microbiologie médicale un véritable
challenge
• Les tests microbiologiques améliorent la
prise en charge des malades si les
résultats sont disponibles dans le temps
du soin.
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
18
Organisation du laboratoire central en microbiologie
Regroupement géographique des laboratoires sur un seul site
PRE-ANALYTIQUE
ANALYTIQUE
Sérologies Automates
> Réception
24/24,
365 jours/an
inoculation
automatique
> Enregistrement
Prélèvements
d’environnement
- réservoirs
- vecteurs
Inoculation
Manuelle
> Dispatching
• cellules
• animaux
• Validation
• Identification par
séquençage
Identification MALDI-TOF
échantillons
POST-ANALYTIQUE
•Génomique au débit
Antibiogramme
automatisé
• Expertise et conseil
thérapeutique
•
Contact avec cliniciens
Limites des laboratoires cœur: résultats retardés dans les tests de routine
Création de laboratoires secondaire d’urgence
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
19
Objectif: laboratoire d’urgence
•
Prise en charge médicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les résultats
des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service
d’urgence => Résultats < 4 heures
•
Afin de répondre à 4 questions cruciales
•
1 – Hospitalisation nécessaire ?
•
2 – isolement requis ?
•
3 –traitement anti-infectieux nécessaire ?
•
4 –analyses complémentaires nécessaires ?
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
20
Point of care à l’hôpital
de la Timone/ et hôpital Nord
257 cm
60 cm
60 cm
Ordi
+ imp.
Smart
Cycler
Placard mural
L120 x h70 x p30
113 cm
Smart
Cycler
153 cm
Placard sous paillasse
L113 x h85 x p50
50 cm
66 cm
PSM
Holten
LaminAir
POC Timone
17,2 m2
65 cm
101 cm
60 cm
92 cm
Monarch
Ordi
60 cm
Ordi
Frigo
bas
+4°C GenXpert
2 étagères murales
L270 x p36
240 cm
210 cm
Micro
Zeiss
Axiolab
Congélo
bas
-20°C
60 cm
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Ordi
Vortex Bain
Sec
Bioblock Stuart
143 cm
Placard sous paillasse
L113 x h85 x p50
2 étagères murales
L160 x p36
EZ1
Qiagen
Centri
Jouan
C3i
Evier
20 cm
21
Critères de sélection des analyses au POC
• Résultats en moins de 4 heures, transmission SMS
• bonne valeur prédictive
• dépistage par syndrome
• Résultats modifient la prise en charge
Immunochromatographie
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
PCR en temps réel
22
Exploration par syndrome
PNEU
Pneumonia
Meningitis
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Flu ICT
VRS ICT
Mycoplasma pneumoniae PCR
Whooping-cough (B. pertussis) PCR
Coxiella burnetii PCR
Staphylococcus aureus (ICU only) PCR
Pneumocystis jiroveci PCR
Legionella urinary antigen
Pneumococcal urinary antigen
MENIN
Gynecology
GYNECO
Gastro-enteritis, diarrhoea
GASTRO
• Rotavirus – adenovirus ICT
• Norovirus ICT
• Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT
Tropical fever
Tropical fever
• Malaria PCR
• Malaria ICT
• Dengue ICT
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Cytology
Enterovirus PCR
Herpes virus PCR
Varicella zoster virus PCR
Meningococcus PCR
Pneumococcus PCR
Cryptococcus
ANG
• HIV ICT
• Group B streptococcus PCR
• Atopobium vaginae PCR
Pharyngitis
• Group A streptococcus ICT
• Infectious mononucleosis MNI test
Others
Other
• Blood exposure accident = HIV
• Tetanus toxin ICT
• Procalcitonin
23
Real-time PCR assays: syndrome-specific strips
190 µl sample
+ 10µL TISS
Une barrette par patient
ex: méningite
Extraction EZ1 Virus card
pure DNA
5 µL
in all wells
Strip 1
LCR code
mix
HSV
VZV
ctrA
crgA
PlyN
Strip 2
CONTRÔLE NEGATIF - rien à rajouter – prêt à l’emploi
Strip 3
CONTRÔLE POSITIF- Rien à rajouter – prêt à l’emploi
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
LytA
7SL-RNA
TISS
24
Real-time PCR assays:
syndrome-specific multiplexed strips
190 µl sample
+ 10µL TISS
1 patient par barrette
ex: pneumonie
Extraction EZ1 Virus card
pure DNA
5 µL
cup1
cup2
cup3
Nothing to add – Ready to use controls
Coxiella burnetii
M. pneumoniae
Bordetella pertussis
Code
mix
X
7SL-RNA
patient
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
TISS
X
7SL-RNA
Negative control
X
7SL-RNA
TISS
Positive control
25
P.O.C: PCR en temps réel
Xpert® Flu
Detection of Flu virus de type A and B, and H1N1 2009
Preparation : 2 min Result : 77 min
Xpert® EV
Molecular detection of enterovirus meningitis
Preparation : 5 min Result : 150 min
Xpert® C. difficile
Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile
Preparation : 2 min Result : 47 min
Xpert® GBS
Intrapartum detection of Streptococcus group B
Preparation
: 1 min Result : 52 min
15 JNI, Bordeaux
es
du 11 au 13 juin 2014
26
Activité exponentielle
influenza virus
RSV
S. pneumoniae
L. pneumophila
M. pneumoniae
C. burnetii
B. pertussis
Procalcitonin
S. pyogenes
EBV
EV
HSV-1/2
S. pneumoniae
N. meningitidis
M. pneumoniae
Rotavirus/adeno
C. difficile
H. pylori
S. agalactiae
HIV
Plasmodium spp
Dengue virus
C. tetani
Total
Test
1390
1537
2008
Diagnostics
102
378
%
7
25
168
1
1
1169
1817
82
296
3
267
272
206
339
9
84
0
10
6
18
19
11
28
0
4
2
537
352
33
149
199
277
45
105
7
4
21
2
50
4
20
2
12
14
1
18
9
8593
1328
15
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Test
12455
3300
67
405
668
2009
Diagnostics
1489
297
12
4
25
%
12
9
18
1
4
561
1090
2912
143
482
114
479
480
38
1075
518
49
352
401
367
66
16
26038
20
169
567
13
92
3
10
3
1
313
10
4
64
4
90
6
8
3204
4
16
19
9
19
3
2
1
3
29
2
8
18
1
25
9
50
12
Test
2551
2171
967
954
1184
244
761
774
2210
146
416
251
410
403
144
1221
535
60
417
269
382
15
21
16506
2010
Diagnostics
25
451
63
9
47
0
10
104
420
16
58
3
14
6
0
295
17
1
66
5
83
2
18
1713
%
1
21
7
1
4
0
1
13
19
11
14
1
3
1
0
24
3
2
16
2
22
13
86
10
Cohen-Bacrie S et al., PloS One 2011
Activité exponentielle
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Cohen-Bacrie S et al., PloS One 2011
Perspectives: POC délocalisé, Afrique
Diagnostic kits
Diagnostic kits
I.H.U
Hospitalization
Consultation
Diagnostic kits
Emergency room
P.O.C.
Assistance Publique des Hôpitaux
de Marseille
POC
Other
Core Laboratory
Clinics, hospitals, laboratories
In France and abroad
Remote POC
Remote, mobile POC
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Remote POC in
patient’s premices
29
Approche syndromique du diagnostic en
microbiologie médicale
Place des nouveaux outils moléculaires
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
30
Approche syndromique : kit péricardique
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
Application métagénomique
Detection : Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide péricardique pour la 1ere fois chez l’homme
PLoS One. 2014 Apr 1;9(4):e93367. 2014.
Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis.
Fancello L, Monteil S, Popgeorgiev N, Rivet R, Gouriet F, Fournier PE, Raoult D, Desnues C.
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
32
Approche syndromique : ex Kit endocardite
Génome en
temps réel
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
33
Application : génome en temps réel
• Génome en temps réel de S.epidermidis
Staphylococcus epidermidis souche isolée de 3 hémocultures sur 3 chez responsable d’une
endocardite aortique chez un homme de 26 ans
génome de 2.5-Mb :sequence unique avec 32 genes de virulence.
CSUR P278
J Clin Microbiol. 2013 May;51(5):1617-21.
Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve
endocarditis.
Fournier PE, Gouriet F, Gimenez G, Robert C, Raoult D.
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
remerciements
•
•
•
•
Pr Michel Drancourt
Dr jean-Paul Casalta
Dr Pierre Yves Levy
Pr jean Marc Rolain
Merci pour votre attention
15es JNI, Bordeaux
du 11 au 13 juin 2014
35