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Bekhouche
eme
3 Année ingénieur
présontépar:Ing_A.Selmania
farida
Module : Microbiologie industrielle
Introduction
La microbiologie industrielle alimentaire (fermentation) est un procédé qui fait intervenir u n outil
biologique les microorganismes. Il permet de transformer u n produit alimentaire en un aliment plus
accessible par l'amélioration des qualités nutritionnelles et l'augmentation des qualités
organoleptiques.
La transformation des produits alimentaires se fait souvent par voie enzymatique plutôt que par voie
chimique, ce qui permet dans b L u des cas de réduire la consommation d'énergie et de générer
moins de déchets.
La fermentation peut se produire en l'absence d'oxygène (fermentation anaérobie) comme la
transformation d u sucre en C 0 2 et alcool sous l'influence des levures. La fermentation peut
également se produire à l'air libre (fermentation aérobie) c o m m e la transformation d'alcool en acide
acétique.
1. Aspects b i o c h i m i q u e , m i c r o b i o l o g i q u e , e n z y m o l o g i q u e , g é n é t i q u e et e n g i n e e r i n g .
D a n s le domaine de la microbiologie industrielle, plusieurs axes sont concernés : la biochimie, la
microbiologie, l'enzymologie, la génétique et l'engineering. " X * .
L a biochimie, la m i c r o b i o l o g i e et l ' e n z y m o l o g i e permettent les différentes biotransformations des
substrats complexes (cellulose, pectine, lactosérum, mélasses, hydrocarbures...etc.) en faisant
intervenir des réaction chimiques de base réalisées par les cellules microbiennes dans lesquelles se
trouvent des e n z y m e s , des biocatalyseurs susceptibles de transformer ces substrats en d'autres
produits (Alcool, acides organiques, antibiotiques:, etc.).
L a génétique p e r m e t de doter les microorganismes d é v i t é s qu'ils ne possédaient pas. Pour cela
des techniques génétiques destinées à modifier le microorganisme sont réalisées au laboratoire et
pour leurs exploitations à grande échelle,
^lk-> & ^ U j ^ l ^ A
Trois facteurs ont p e r m i s le passage des essais de laboratoire à la bio-industrie :
- Les techniques actuelles dont disposent les chercheurs de reprogrammer les microorganismes pour
modifier leur fonctiomiement,
- la vitesse de reproduction de ces microorganismes,,
- et les potentialités des cultures en masse.
R e m a r q u e : La reprogrammation génétique consiste à découper, r e c o m b i n e r les différents
fragments de gènes et de transférer ce nouveau p r o g r a m m e dans des microorganismes où il pourra
s'exprimer grâce à des modifications de leur patrimoine héréditaire.
L ' e n g i n e e r i n g fait intervenir des bio-réacteurs (appelés aussi fermenteurs) dans lesquels s'effectue
les biotransformations.
. Objectifs
- L'obtention des microorganismes en quantité importante (production de biomasse cellulaire)
- L'obtention des produits sécrétés naturellement par les microorganismes (enzymes et metabolites)
- La transformation des produits complexe en éléments simples (traitement des eaux usés,
valorisation des déchets industriels)
- favoriser une flore utile au détriment d'une flore indésirable afin de prévenir les risques sanitaires
pouvant survenir chez les consommateurs puisque certaines fermentations susceptibles de se
produire dans des denrées alimentaires sont indésirables.
S u b s t r a t s ou
ère
Matière 1
P r o d u i t s finis
M i c r o o r g a n i s m e s , cellules,
Enzymes
Milieux appropriés
B i o r é a c t e u r ou f e r m e n t e u r
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Année
Bekhouche
ingénieur
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Module : Microbiologie industrielle
Chapitre 1 : Les installations des fermenteurs ou bio-réacteurs
I. Description de l ' i n s t a l l a t i o n
Les fermenteurs sont constitués d ' u n e cuve principale et d ' u n certains n o m b r e de systèmes
périphérique. La mise en œuvre de la fermentation implique la préparation du milieu de cultures,
obtenu pat un mélange aqueux de différents ingrédients nécessaires à la croissance du
microorganisme et à la production du métabolite recherché.
L'installation prévoit une ou plusieurs cuves de préps •afions du milieu de cultures, des cuves de
stockages des différents réactifs nécessaires au bon fonctionnement des fermenteurs.
Durant le déroulement de la fermentation :
- Le milieu de culture est ajouté dans le fermenteur au fur et à mesure de sa transformation par les
microorganismes,
- Les réactifs de corrections du p H (acide-base) les composés sécrétés au cours de la fermentation
par les microorganismes (les processus microbiologiques sont très souvent acidogènes),
-Les réactifs antimousses évitent le débordement du milieu,
- Les composés divers sont ajoutés (parfois nécessaires à la biosynthèse des métabolites recherchés.
L'installation est aussi conçue pour permettre le contrôle et l'automatisation des différents
paramètres (stérilisation, maintien de l'asepsie, distribution d'air dans le cas des aérobies, réduction
ou élimination de la m o u s s e et transfert des fluides et des suspensions d ' u n e cuve à l'autre).
I I . L e s conditions d e la f e r m e n t a t i o n
1. L a stérilisation et le m a i n t i e n de l'asepsie
Toutes les fermentations ne nécessitent pas des conditions d'asepsies très rigoureuses ; aussi les
degrés d'exigences de stérilisations varient selon les différentes actions microbiennes.
Exemples
C a s d ' u n e f e r m e n t a t i o n a c é t i q u e o u alcoolique : De par sa composition ce milieu de culture est
très défavorable aux développements des microorganismes de contaminations.
C a s où le milieu de c u l t u r e est r i c h e en s u b s t a n c e s n u t r i t i v e s ( p o u r s a t i s f a i r e les besoins des
m i c r o o r g a n i s m e s exigeants) ou p o s s è d e u n p l i voisin d e îa n e u t r a l i t é : Ce milieu nécessite des
conditions d'asepsies très strictes ; dans ce cas on a recours à la stérilisation et à des précautions
particulières de maintien de l'asepsie plus strictes.
C a s d ' u n e f e r m e n t a t i o n d e s t i n é e à la p r o d u c t i o n d e v a c c i n s : Sa culture implique des
microorganismes pathogènes. Elle peut poser des difficultés supplémentaires puisque dans ce cas on
redoute les microorganismes de contaminations et surtout on doit éviter que la souche, agent de
production se propage à l'extérieur du fermenteur étant donné le risque que peut pendre le
personnel.
11. L a s t é r i l i s a t i o n d u milieu d e c u l t u r e
Elle est basée sur l'application des lois classiques de destructions des microorganismes par la
chaleur sur la base de la stérilité pratique.
La stérilisation peut s'effectuer selon différents procédés qui sont :
- La stérilisation du milieu de culture en discontinue,
- La stérilisation dans le bioréacteur,
- La stérilisation par injection de vapeur dans le milieu (en tenant compte de la dilution du milieu),
- Dans le cas où le milieu de culture est sensibles aux traitements thermiques, on applique une
stérilisation continus dans u n échangeur de chaleur. Ce procédé consiste à u n traitement à très haute
température pendant u n t e m p s très court ; ce qui limite considérablement la dégradation des facteurs
de croissances.
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Module : Microbiologie industrielle
12. L a s t é r i l i s a t i o n des p é r i p h é r i q u e s
Les dispositifs périphériques de l'installation tels que les circuits de distributions d'air et
d'évacuations de gaz du bioréacteur doivent être stérilisés. Pour cela on utilise la vapeur produite
par la stérilisation d u milieu de culture lorsqu'elle a lieu dans le biréacteur. Il faut aussi isoler les
circuits de telle façon à pouvoir maîtriser leur entretien.
Des contaminations peuvent se produire aux différents points de communications du bioréacteur
avec l'extérieur (vannes de prélèvements et de vidanges). Tous ces points devront être maîtrisés car
toute réduction de diamètre des conduites est susceptible d'apporter des proliférations
microbiennes.
Les v a n n e s : Elles peuvent provoquer des risques de contaminations au niveau de la tige de la
vanne, bien que protégée par une presse étoupe (appareil adapté à la vanne pour empêcher les
fuites), par l'introduction des microorganismes à cause des m o u v e m e n t s répétés et le fait quelle
soit difficile à nettoyer.
Les p o m p e s : O n emploi des p o m p e s sur des circuits aseptiques q u ' e n cas de nécessitée.
Les dispositifs a n t i m o u s s e s : Certains fermenteurs s ' a c c o m p a g n e d ' u n e forte production de
mousses, il faut les réduire pour empêcher les bioréacteurs de déborder par des m o y e n s chimiques
et mécaniques.
2. L ' a é r o b i o s e i n d u s t r i e l l e
21. Définition d e l ' a é r o b i o s e
C'est le processus de la respiration qui correspond à une c o n s o m m a t i o n d ' o x y g è n e et une
production de gaz carbonique. Cette réaction entraîne une libération d'énergie. Cette énergie peutêtre utilisée pour la synthèse des produits, pour le déplacement des microorganismes ou pour la
production de chaleur. Cette libération d'énergie s'accomplie à partir de l ' o x y g è n e libre mis à la
disposition de la cellule (oxygène atmosphérique ou ox gène dissous dans le milieu intérieur et
l'oxygène provenant des molécules d ' e a u fixées par les composés intracellulaires qui apparaissent
au cours des p h é n o m è n e s de dégradations).
Remarque : Parmi les microorganismes anaérobies on trouve tous les g e r m e s responsables des
fermentations et parmi ces derniers, il est possible de distinguer des microorganismes qui survivent
aussi bien en présence d ' o x y g è n e q u ' e n absence d'oxygène (Les levures).
22. C o n t r ô l e de l ' a é r o b i o s e d a n s le milieu d e c u l t u r e
Après avoir inoculer le milieu de culture habituellement stérile. Il est indispensable de contrôler
l'aération. Dans le cas des microorganismes aérobies, les cultures doivent se faire en présence
d'oxygène qui doit être injecté dans la cuve régulièrement.
Dans le cas des microrganismes anaérobies, on utilise des cuves profondes, le milieu utilisé est déjà
débarrassé de son oxygène initial par le biais de la stérilisation ; les traces d ' o x y g è n e s sont
éliminées rapidement au début de la fermentation par ie dégagement d ' h y d r o g è n e et de gaz
carbonique.
A é r a t i o n et a g i t a t i o n : Les cultures sont agitées et aérées par injection d ' a i r sous pression. A cause
de la réserve de ce m é t a b o l i s m e essentiel et particulièrement faible ; le développement et l'activité
des microorganismes dans le milieu dépend de la concentration en oxygène. E n effet si la
concentration en o x y g è n e est inférieure à une valeur critique, on constate des troubles métaboliques
qui peuvent entraîner la mort des microorganismes.
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Année
Bekhouche
ingénieur
farida
Module : Microbiologie industrielle
Besoins m a x i m u m s et c o n c e n t r a t i o n s c r i t i q u e s d ' o x y g è n e (millimoles/1 d e m i l i e u et p a r
heures)
Microorganismes
T e m p é r a t u r e de
culture °C
Concentration
critique 0 2
Besoins m a x i m u m s
Azotobacter
E. coli
Levures
P. chrysogen um
Acétobacters
Streptococcus
griseus
30
37
30
24
30
30
0,018
0,008
0,004
0,022
260
5-8
10-15
20-30
90
15
-
On remarque aussi que la production de la substance recherchée est liée à la présence o u l'absence
d'oxygène.
E x e m p l e : Cas de Serratia marcescence qui produit de la prodigiosine (pigment rouge). E n
aérobiose, synthétise de l'asparagine en anaérobiose.
Efficacité d e l ' a é r a t i o n : U n e caractéristique très importante du fermenteur, dans le cas de culture
aérobie est sa capacité de transférer à la biomasse microbienne qu'il contient la partie d ' o x y g è n e
dont elle a besoins. Certains microorganismes sont très exigeante en oxygène or seul l'oxygène
dissous qui peut être utilisé par les cellules. Généralement l ' o x y g è n e est présent à l'état gazeux dans
le milieu et il est peu soluble dans l'eau ; d ' o ù il est difficile de mélanger les trois phases
S. A
Aimée Ingénieur
Bekhouche Farida
Module : Microbiologie Industrielle
3. L'agitation des bio-réacteurs
L'agitation a pour but de mélanger plusieurs p h a s e s :
- La phase solide constituée par les cellules microbiennes : L'opérations de mélange consiste à
réaliser u n e suspension. Qui doit être la plus homogène possible. Tout en préservant l'intégrité
des cellules.
- La phase gazeuse constituée du gaz d'oxygénation pour les procédés aérobies : L'opération de
mélange, dans ce cas est u n e émulsion.
- L a phase liquide constituée par les réactifs que l ' o n ajoute au cours d e la fermentation
(nutriments, solution de correction du p H ) : L'opération à réaliser est u n mélange.
L'agitation doit favoriser, par la turbulence, les échanges thermiques (chauffage ou refroidissement)
entre la culture et le dispositif prévu pour cela.
Les mobiles d'agitation employés sont des turbines ou des hélices à débits radial ou axial. L e s turbines
sont composées de 4, 6 ou 8 pales montées perpendiculairement sur u n disque. Elles sont bien
adaptées à l'agitation des fluides peu visqueux. L ' a c t i o n de cisaillement de ce type de turbine facilite
le transfère d'oxygène. Elles ne conviennent pas pour les microorganismes fragiles. L o r s q u e la
viscosité du fluide à agiter augmente (production d'antibiotiques ou de polysaccharides), o n utilise
d'autres agitateurs à débits radial, tel que l'agitateur à pales larges (Paddle) ou les agitateurs à ancre.
4. La régulation d u pH
P o u r maintenir le p H du milieu on peut utiliser des t a m p o n s à base de phosphates ou de carbonates de
calcium ou des agents neutralisants peu coûteux (HCï N a O H , L ' a m m o n i a q u e ) . L ' a m m o n i a q u e peut
être une source d ' a z o t e aux microorganismes. L ' u t i h : .f on de ces agents, sous formes liquides
s'effectue au c o u r s de la fermentation par l'intermédiaire de contrôleurs automatiques de p H (grâce à
des électrodes).
5. L a régulation d e la température
Chaque microorganisme exige u n e température déterminée pour sa croissance optimale qui est très
proche de la température limite.
La température optimale est voisine de 3 0 ° C pour un grand n o m b r e de bactéries et de champignons
utilisés en microbiologie industrielle. U n intérêt est porté aux microorganismes thermophiles (45 à
65°C) dans l'industrie. Ces microorganismes évitent un grand n o m b r e de contaminations.
N B : Ils existent des microorganismes qui réagissent à des températures différentes selon leurs stades
de développement.
Exemple : Pénicillium
Pendant la 1 phase, le mycélium se multiplie à u n e température bsse et durant la deuxième phase, il
synthétise l'antibiotique à température plus élevée.
6. La régulation et l'automatisation
La régulation est réalisée avec des appareils appelés capteurs. L'appareil est sensible aux variations du
paramètre qu'il sert à mesurer en émettant un signal utilisé généralement sous forme électrique dont
les caractéristiques varient de façon réversibles en fonctions de l'évolution de ce paramètre outre la
sensibilité les qualités d ' u n bon capteurs sont la fidélité et la rapidité des réponses.
Ils existent deux types de capteurs
Les capteurs de mesures physiques permettent de contrôler la température, la pression, la vitesse et la
puissance d'agitation, les débits et les niveaux de liquide» dans la cuve.
Les capteurs de mesures physicochimiques contrôle le Ph le potentiel d'oxydoréduction, l ' o x y g è n e
dissous, l'analyse des gazes et les substrats et les métabolites.
L'automatisation est régis par u n ordinateur qui peut compléter le dispositif classique de régulation de
l'installation. Il intervient dans la gestion des points de consignes en fournissant les signaux
correspondants, qui sont transmis aux régulateurs, dans leur langage.
:
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S.
Année Ingénieur
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Bekhouche Farida
Module : Microbiologie Industrielle
I I I . Le type de cultures utilisées
1. La culture sur milieu liquide discontinue (fermentation batch)
Le mode de conduite consiste à effectuer une fermentation discontinue. On l'utilise dans le cas de
faibles volumes. Après avoir rempli le fermenteur de milieu de culture et l'avoir stérilisé, ou bien après
avoir stérilisé le fermenteur vide et l'avoir rempli de milieu de culture stérilisé à part, on introduit
l'inoculum et o n laisse se dérouler la fermentation. La culture est aérés et agités et durant tout le t e m p s
de la culture on n'introduit pas de milieu de culture. Tout au plus un réactif de neutralisation (en
quantité faible), ou encore un produit antimousses.
La concentration en biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne. Dans le m ê m e
temps le substrat est c o n s o m m é par le microorganisme et le produit recherché apparaît, sa
concentration (P) augmente. E n fin de culture on vide le fermenteur et on extrait le produit désiré.
Ce type de fermentation est caractérisé par divers taux.
1 : Taux de croissance des cellules (X)
Umax
X
¡amax
2
dt
2 : Taux de production du metabolite (P)
K'=l.
XI
X
dP
dt
3 : Taux de conversion du substrat (S)
Tps
K"=, l . d S
2. Culture sur milieu liquide discontinu et alimenté (fermentation en feed batch)
X dt
Dans ce cas la fermentation c o m m e n c e dans u n petit volume de milieu de culture (appelé pied de cuve)
Ensemencé par l'inoculum. Si la concentration de l'inoculum ensemencé est importante la
fermentation démarre plus vite et lorsque le microorganisme est en phase exponentielle de croissance,
on introduit dans la cuve le milieu de culture stérile. Le débit d'alimentation est réglé de façon à ce que
la concentration en substrat soit constante dans la cuve et corresponde à une étape de la phase
logarithmique de croissance cellulaire.
D e u x cas possibles sont observés :
-Si le débit d'alimentation est trop faible, et en fonction de sa valeur, la concentration cellulaire
augmente selon une courbe plus ou moins proche de la courbe correspondant à l'évolution de la
croissance en discontinue.
- Si au contraire le débit d'alimentation est trop grand, la concentration en biomasse à tendance à
diminuer, l'effet de dilution l'emportant. Dans ces conditions, le volume de milieu e n fermentation
dans la cuve augmente.
Dans le cas où on souhaite maintenir X constant, on peut écrire : V. d X = X. dV
dt
dt
La variation de la concentration en biomasse dans le volume V de milieu due à l'alimentation qui
provoque un effet de diluton.
Si l'alimentation a lieu alors que le mcroorganisme est en phase exponentielle de croissance,
l'équation est : V.
X = X. d V
d ' o ù on déduit : dV = u , dt
dt
V
c'est la loi d'évolution du volume de milieu en fermentation (évolution dans le t e m p s du débit
d'alimentation).
jUL
m
m
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Bekhouche Farida
Année Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle
Le procédé de cette fermentation :
Lorsque la cuve est remplie, o n coupe l'alimentation. La culture évolue selon le système discontinu. A
ce stade on observe la phase de ralentissement puis la phase stationnaire au cours desquelles on
observe l'épuisement en substrat du milieu. Ce mode est le plus utilisé car il permet de gagner du
temps et d'améliorer la productivité de la cuve en fermentation. Il permet aussi de modifier la
composition du milieu d'alimentation selon les besoins (orienter le métabolisme du microorganisme
utilisé, favoriser la croissance cellulaire et stimuler la production de métabolite).
3. Culture sur milieu liquide continu
Dans ce procédé, un état d'équilibre dans la cuve est maintenu par l'alimentation de milieu et le
soutirage de façon continue.
Deux principaux cas sont à envisager :
3 1 . La culture continue infiniment mélangée
La suspension microbienne est infiniment homogène en tout point de la cuve. C e m o d e de
fonctionnement nécessite u n e phase de croissance discontinue préalable à l'alimentation et au
soutirage en continu.
Le procédé est le suivant :
On ensemence le milieu de culture de volume V qui reste constant dans la cuve. L'alimentation et le
soutirage ont lieu aux m ê m e s débits et c o m m e n c e quand une certaine concentration cellulaire X est
atteinte dans la cuve. Il lui correspond une concentration S en substrat et P en produit formé. A ces
concentrations correspondent des vitesses respectivement de croissance cellulaire (Rx), de dégradation
de substrat (Rs) et d'apparition de métabolite (Rp).
L'équation d'équilibre de la biomasse est : F. Xo + V. R x = F. X
On suppose que le taux de dilution F/V, est suffisant pour assurer le renouvellement du milieu de
culture, apporter suffisamment de substrat et maintenir la population microbienne dans un état
physiologique suffisamment éloignée de la phase stationnaire. La condition de l'équilibre est que le
taux de dilution soit égal au taux de croissance.
32. La culture à gradient de concentration
Ce concept est assimilé à un réacteur tubulaire dans lequel le milieu de culture ensemencé XO ce
déplace en m ê m e temps que la fermentation se déroule. L'évolution des concentrations, d ' u n bout à
l'autre du réacteur, correspond à l'allure cinétique de la fermentation. Les concentrations en biomassse
microbienne X et en produit formé P augmentent progressivement tandis q u e la concentration en
substrat diminue. Le fonctionnement d ' u n tel réacteur s'exprime en considérant un volume élémentaire
dV et en écrivant le bilan de fonctionnement en équilibre : F. X + dV. R x = F ( X + dX)
o ù d V . R x = F . d X o ù d V = dX
F
Rx
Ce type de culture est assimilé à l'association de trois cultures réalisée successivement dans trois cuves
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e m e
S,
Année Ingénieur
A
Bekhouche Farida
Module : Microbiologie Industrielle
Cuvel
cuve 2
cuve 3
X
Xf
foi
x
$**
*v*C,
2
X,
X
0
Les temps de séjours sont égaux dans les trois cuves, les débits d'alimentations et de soutirages et les
volumes de milieu en fermentation sont égaux. Ce type de concept est utilisé pour la production
d'alcool.
4. C u l t u r e s u r milieu l i q u i d e c o n t i n u e avec recyclage d e la b i o m a s s e
L'intérêt de recycler la biomasse c'est pour augmenter le taux de dilution au-delà de la limite
biologiquement possible.
Plusieurs moyens peuvent être utilisé :
Cuve
7
Dans ce cas on centrifuge 1'effluent de la
cuve de fermentation.
Les microorganismes sont concentrés ainsi et
la suspension concentrée est réintroduite.
Cette solution est très utilisée dans la
pratique dans le cas de fermentations mettant
en œuvre des levures, en particulier en
production d'éthanol avec reprise des levures
La deuxième voie utilise la décantation
statique. L'effluent traverse un récipient dans
lequel la biomasse est concentrée par simple
sédimentation sous l'action de la pesanteur.
Une variation de température peut faciliter le
phénomène. Ce type convient pour les
microorganismes qui ont tendance à floculer
ou à former des agrégats. Ce procédé est
utilisé dans le traitement biologique des eaux
et effluent pour le recyclage des boues
activées.
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Bekhouche Farida
Année Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle
C
Cuve de fermentation
1
M o d u l e à ultrafiltre
Echangeur
de chaleur
— 4 -
Pompe
Ce système appelé module à m e m b r a n e s de micro ou d'ultraîiltration est utilisé lorsqu'on veut
travailler avec des concentrations cellulaires élevées.
Schéma de fonctionnement du fermenteur continu infiniment
m é l a n g é avec recyclage d e la b i o m a s s e
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S.A
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Année Ingénieur
Bekhouche Fanda
Module : Microbiologie Industrielle
Exemple de système d e culture continue : Culture des microorganismes p a r dialyse
*
L e système est composé de deux compartiment séparés par u n e colonne (ultra filtrante). * /
-Dans un compartiment se trouve la culture microbienne en suspension dans le milieu liquide.
-Le second compartiment, en général beaucoup plus volumineux est un réservoir R contenant le
milieu de culture.
Les éléments nutritifs passent à travers la membrane du réservoir dans le compartiment de culture.
Tandisque les cellules et certains produits du métabolisme font le chemin inverse.
L'avantage de ces cultures prolonge la phase exponentielle qui s'explique par le fait que les éléments
nutritifs sont fournis par le compartiment réservoir à travers la membrane, tandisque des métabolites
sont éliminés régulièrement. L e s cellules restent viables beaucoup plus longtemps au cours d e la phase
stationnaire.
La dialyse permet aussi l'élimination d e tous les toxiques métabolisés par les cellules.
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C u v e d e fermentation
Réservoir
Uiaiyseur
1 et 2 : Sortie des gazes 3 et 4 : Entré d'air
Représentation schématique d'un système d e culture en continue par dialyse
L a régulation d e ce système dépend des propriétés de la membrane, d u rapport volume d e s d e u x
compartiments. C e type de cultures peut-être valables dans des fermenteurs discontinus ou continu.
L e s membranes utilisées :
Les membranes d e dialyse constituées en matière plastiques d e porosités d e 0,3 à 10 m a n o m è t r e .
Elles retiennent les grosses molécules (enzymes, toxines) tout en permettant le passage des petites
molécules tels q u e les oses et les sels minéraux.
L e s membranes filtrantes sont constituées d e celluloses, de matière plastique, d e porcelaines o u en
verre fritte et d e porosité de 2 5 à 2 0 0 manomètre. Elles retiennent uniquement les cellules
bactériennes et laissent passer les macromolécules.
VI. Les différents bio-réacteurs utilisés
Parmi les fermenteurs utilisés, ils existent d e s cuves munies de systèmes permettant le réglage d e leurs
besoins en oxygène.
Ils existent trois types:
-Les bio-réacteurs avec agitations mécaniques (turbines et serpentins)
-Les bio-réacteurs avec agitation pneumatique (utilisant des gazes)
-Les bio-réacteurs avec agitation par p o m p a g e et recirculations ou fermenteur à jet.
N B : Les cultures anaérobies n e nécessitent pas u n e agitation puisque la production de gaze d e
fermentations favorise le bouillonnement.
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Mut
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Bekhouche Farida
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3 " Année Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle:
1. Bio-réacteurs avec agitation mécanique
a. Sans circulations internes (fig 4-16)
C'est une cuve cylindrique (7 m de hauteur) munie en bas et en haut de deux calottes sphériques (4,2
m), d'un agitateur introduit par le haut de la cuve, de deux dispositifs de guidage de trois turbines
d'agitations d ' u n mobile supérieur destiné à réduire la mousse. C e type de bio-réacteurs convient à la
production d'antibiotiques. C'est un processus peu exothermique, utilisant des microorganismes
filamenteux fragiles et sensibles aux actions de cisaillement et qui ne sont pas très exigent en 0 .
b. Avec circulation interne (fig 4-18)
Certains microorganismes sont très exigent en 0 et sont aussi exothermiques. L'utilisation de ce
système permet d'évacuer l'énergie produite aux cours de la fermentation en augmentant la surface
d'échange thermique grâce à des serpentins et des doubles enveloppes. L e refroidissement du milieu
de culture lors des surchauffes peut être réalisé dans un échangeur de chaleur à l'extérieur du
bioréacteur. O n peut aussi améliorer la circulation du milieu dans la cuve en introduisant un t u b e de
circulation à l'intérieur de la cuve.
2. Bioréacteur avec agitation pneumatique
L'introduction des gazes c o m m e moyens d'agitations à pour but d'évaluer le coût d'énergie du transfer
d'oxygène et permet aussi de diminuer le coût d'énergie de la production.
a. Le système sans circuiation d'air ou colonnes à bulles
Dans le cas ou le processus microbiologique ne nécessite pas un transfert d'oxygène important, on
utilise des colonnes à bulles.
Ils s'agissent de cuves dont la hauteur est supérieure au diamètre (cuves profondes).
Les colonnes à bulles conviennent aux cultures filamenteuses. Leurs capacités de transferts ont été
améliorées en les équipant de plateaux perforés et de tubes de circulations.
Ce système présente c o m m e inconvénient : l'apparition des effets de cisaillements et difficiles à
nettoyer.
b. Le système avec circulation interne ou externe (bio-réacteurs à boucles)
On distingue deux types avec circulation selon qu'elle a lieu à l'extérieur ou à l'intérieur de la cuve.
b l . Le système avec circulation interne (fig. 4-20)
Il est conçu pour les fermentations continues ; à l'intérieur de la cuve u n cylindre délimite deux zones
>
(une zone centrale et une zone périphérique).
• W*. i M**.^ ^ Í * ¿ C & J*ct¿kútP ^
Dans les cuves de petites tailles
La suspension microbienne, le milieu de culture et l'oxygénation se trouvent dans la zone centrale. Les
cellules microbiennes sont expansées dans le milieu grâce aux débits d'alimentations des gazes.
Le taux d'expansion, égal au volume de suspension expansée par volume de suspension totale, est très
important.
Dans les c u v e s de grandes tailles
Dans ce cas le sens de circulation est inversé, l'expansion du fluide en fermenteurs et l'alimentation
ont lieu d a n s la zone périphérique. Ce type de bioréacteur est utilisé p o u r la production d e biomasse à
partir de matières premières diverses (mélasses, lactosérum).
b2. L e système avec circulation externe (fig, 4-22)
Dans ce cas la circulation du fluide est organisée dans deux colonnes (cas des fermenteurs à boucle
externe).
Dans la colonne montante a lieu la principale phase d'oxygénation. L ' a i r est introduit p a r un tuyau
perforé. A la partie supérieure elle communique avec une canalisation horizontale munie d ' u n e
ouverture permettant la sortie des gazes. A l'entré du compartiment descendant une réinjectiorf"vers le
b a s J D a n s la partie où est placé l'échangeur de chaleur de façon à obtenir un bon coefficient
2
2
V-
o
11
Bekhouche Farida
3°"* Année Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle
3. Bioréacteurs avec agitation par p o m p a g e et recirculation à jet (fig. 4-25)
Dans ce cas l'agitation est provoquée par une p o m p e centrifuge (aspire et refoule le fluide). L e liquide
est prélevé à la base de la cuve p o u r le réinjecter à grande vitesse. C e système est utilisé pour les
cultures anaérobies et peut-être associées à un dispositif d'introduction de g a z e pour des cultures
anaérobies.
12
3^
Bekhouche Farida
Année Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle
Chapitre 2. E t u d e quantitative des processus biologiques microbiens
1. Rappel sur les métabolismes énergétiques microbiens
Sur le plan énergétique les microorganismes possèdent deux processus d'utilisation de l'énergie :
-Le processus au c o u r duquel de l'énergie leurs est fournie soit par la lumière, soit indirectement sous
forme d'énergie chimique par oxydation de substances minérales ou organiques,
- L e processus au cour duquel de l'énergie produite durant les différentes réactions peut-être stockée
dans les liaisons chimiques " r i c h e en é n e r g i e " ou utilisé pour les réactions de biosynthèses.
I L Le type respiratoire
• L a respiration aérobie est caractérisée par la nature de l'accepteur final d'électrons est l ' o x y g è n e
moléculaire. Elle est assuré par une chaîne de réaction enzymatiques dont la p l u s classique est c o n n u e
sous le non de voie des cytochromes ( N A D , F A D + F e ) ,
• La respiration anaérobie est un processus d'oxydation bîologies biologiques producteurs
d'énergie, Son caractère propre est que l'accepteur d'électron n ' e s t ni l ' o x y g è n e moléculaire, ni u n
c o m p o s é organique, mais une substance inorganique (Un sulfate ou un carbonate),
Les microorganismes de ce type sont des anaérobies stricts, Ils font appel à des cytochromes spéciaux
c o m m e transporteurs d'électrons,
C H 0 + 12KN0
^ 6 C Ü 2 + 6 H 0 + 12KNÜ2 + Kilocalories
6
1 2
6
3
2
12. La fermentation
La fermentation est aussi un processus d'oxydoréductions mais à l'inverse de la respiration, les
accepteurs finaux d'électrons sont des composés organiques. Ce processus libère de l'énergie mais à
un degré très inférieur à la respiration. L e s seuls transporteurs d'électrons sont le N A D et le N A D P H 2 .
N A D P : participe en tant que coenzymes à la transformation du glucose en acide lactiques ou en
alcool.
Ex : la fermentation d e la molécule d e glucose produit .h l'acide acétique et très peu d'énergie ( 2 2 , 5
Kcal).
Les produits obtenus sont d ' u n e grande variété :
-Parmi les alcools, n o u s obtenons de l'éthanol, du butano!, de l'isopropanol et du glycérol.
- Parmi les acides organiques, les microorganismes peuvent produire des acides : acétique,
propionique, lactique, citrique et gluconique.
2. Cinétiques microbiennes
Le développement microbien est considéré c o m m e un ensemble de réactions chimiques en relation
directe avec la composition des cellules et les conditions du milieu dans lesquels se trouvent ces
cellules. L o r s q u ' u n microorganisme se trouve dans un milieu de culture lui convenant, il y développe
une activité qui présente deux aspects liés l'une à l'autre :
- Le microorganisme se reproduit; il en résulte une augmentation de la concentration en biomasse
microbienne. L a biosynthèse des constituants cellulaires se fait à partir des c o m p o s é s du milieu de
culture.
- Parallèlement, il arrive que le microorganisme sécrète à travers sa membrane cellulaire des c o m p o s é s
qui seront récupérés en fin de culture, concentrés et purifiés.
2 1 . Le bilan chimique d e production de b i o m a s s e
Le phénomène de la croissance microbienne se traduit par la réaction chimique suivante :
AC H O + B 0 + DNH4OH
a
b
c
2
^ EC«HßO N + F C 0 + G H 0
Y
13
ç
2
2
Bekhouche Farida
y™* Année Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle
Cette réaction n e s'applique que dans le cas où la croissance microbienne est le seul produit fini.
ç représente 9 0 % de la biomasse produite au cours d e la réaction et 1 0 % représentent les
a
Y
cendres.
C HpO N
C Ht>O
représente la quantité de substrat à partir de laquelle s'effectue la synthèse de la biomasse.
Ce substrat peut j o u e r deux rôles :
- Il fournit d ' a b o r d de l'énergie nécessaire aux réactions de synthèse et de maintenance, cette énergie
est traduite sous forme d ' A T P .
- Par ailleurs certaines molécules de substrats, vont servir aux renouvellements des constituants
cellulaires.
La concentration du substrat dans le milieu de culture doit tenir compte des deux composants du
métabolisme cellulaire. L a proportion du substrat servant c o m m e source d'énergie ou c o m m e source
de carbone apparaît dans l'évaluation du coefficient de conversion du substrat Yx/s et qui exprime la
quantité de biomasse produite (en grs) par g r a m m e de substrat dégradé.
a
c
Yx/s
= E ( 1 2 . + 1 » + 16 + 14 | )
A(12a + b + 1 6 c ) ( 1 - n )
T
L e milieu de culture doit aussi contenir d'autres éléments nécessaires à la synthèse de la biomasse
c o m m e les éléments minéraux. Parmi les éléments les plus importants :
- L'azote, peut être utilisé à l'état gazeux (N2) ou sou; Forme de composé minéral (ammoniaque,
nitrate et nitrite) ou sous forme de composés organiques (AA, peptides et protéines).
- L e p h o s p h o r e est impliqué d a n s le métabolisme énergétique et dans la synthèse d e s acides
nucléiques.
- L e soufre entre dans la composition de certains acides aminés et j o u e un grand rôle d a n s la structure
de la molécule protéique.
- L e p o t a s s i u m , le s o d i u m , le c a l c i u m et le magnésium sont présents en quantités non négligeables.
- D ' a u t r e s éléments minéraux participent aussi au renouvellement de la cellule mais en très faible
quantité : F e r , c u i v r e , m a n g a n è s e et m o l y b d è n e .
C o m p o s i t i o n en é l é m e n t s m i n é r a u x des c e n d r e s d e s m i c r o o r g a n i s m e s
Eléments minéraux
(g/100 g d e m a t i è r e s
sèches
Bactéries
Moisissures
Levures
Phosphore
Soufre
Potassium
Magnésium
Sodium
Calcium
Fer
Cuivre
Manganèse
Molybdène
2,0- 3,0
0,2- 1,0
1,0- 4,5
0 , 1 - 0,5
0,5-1,0
0 , 0 1 - 1,1
0,02- 0,2
0,01-0,02
0 , 0 0 1 - 0,01
0,4-4,5
0,1-0,5
0,2- 2,5
0,1-0,3
0,02- 0,5
0,1-1,4
0,1-0,2
0,8-2,6
0,01-0,24
1,0-4,0
0,1-0,5
0,01-0,1
0,1-0,3
0 , 0 1 - 0,5
0,001-0,002
0,0005- 0,0002
0 , 0 0 0 1 - 0,0002
-
-
14
3
è m e
Année Ingénieur
Bekhouche Farida
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2. Les phénomènes biologiques
2 1 . Les modes de productions des microorganismes
Au cours de leurs croissances les microorganismes se reproduisent selon deux modes sexué ou
asexué). L a reproduction est généralement asexuée, elle se fait par fusion cellulaire chez les bactéries
et les levures. Pour certaines espèces de levures et dans certaines conditions, les cellules restent
accrochées ; elles forment alors des filaments appelés pseudomycélium.
La reproduction des moisissures et des bactéries filamenteuses se fait par allongement et ramifications
des filaments en fonction des conditions physico-chimiques dans lesquelles se déroule la croissance.
22. Les techniques d'évaluations des populations microbiennes
L ' é t u d e de la croissance microbienne ne peut s'effectuer que si on dispose de techniques appropriés
d'évaluations.
2 2 1 . Les méthodes directes
a. La détermination de la concentration cellulaire
a l . C o m p t a g e des cellules au microscope à l'aide d e s cellules de T h o m a s ou de Malassez. C e sont
des lames calibrées munies de quadrillages, emprisonnant les cellules à dénombrer dans u n v o l u m e
connu.
La méthode consiste à mettre un volume de suspension connu sur la lame et les compter dans u n ou 2
cm .
a2. La cytométrie à flux (figure 3.2)
La détection des cellules se fait par la mesure d ' u n e fluorescence émise par les cellules préalablement
marquées avec un Fluorochrome.
Principe de la technique : L e s cellules après marquage par un fluorochrome sont entraînées dans u n e
veine liquide et passent devant u n e source lumineuse qui les illumine u n e par une. L a
fluorescence
émise par chaque microorganisme est captée par un photomultiplicateur et analysée. Les résultats sont
traduits en histogramme qui donne le nombre d'événements en fonction d e l'intensité de la
fluorescence. Cet histogramme traduit un profil de population.
a 3 . Dénombrement avec culture
Il consiste à dénombrer les colonies obtenues sur les boites de Pétrie sur milieu gélose.
a4. Détermination de la biomasse cellulaire
Ces techniques sont valables p o u r les microorganismes unicellulaires ou filamenteux.
• La matière sèche : C'est une méthode très rigoureuse; on récupère la biomasse des cellules par
centrifugation, la masse cellulaire est lavée afin d'éliminer le milieu de culture retenu entre les cellules
puis elle est séchée à 105°C.
• L a mesure optique : Turbidimétrie
L a technique consiste à mesurer la densité optique d'ime suspension microbienne à l'aide d ' u n
spectrophotomètre avec u n e longueur d ' o n d e de 600 à 700 nm. Les mesures obtenues sont évaluées en
fonction d'une g a m m e d e référence où on déduit la concentration en biomasse. Dans le cas d ' u n
système continu, la mesure est réalisée à l'aide d ' u n biophotomètre stérilisable qui fonctionne en
continu.
2 2 2 . Les Méthodes indirectes
L e u r principe consiste à remplacer la détermination de la biomasse microbienne elles m ê m e par celle
d ' u n paramètre facilement déterminable et dont la valeur peut-être corrélée avec précision à celle de la
biomasse.
a. La détermination des constituants cellulaires
On remplace la détermination de la matière sèche par celle d ' u n constituant qu'elle renferme :
protéine, acide nucléique, A T P , N A D .
a l . Les protéines : l'augmentation de la biomasse est étroitement dépendante de la synthèse des
protéines. Les protéines peuvent être doser selon plusieurs méthodes (détermination de l'azote total,
dosage des protéines totaux, dosage des acides aminés).
2
15
^eme ß^fe
Bekhouche Farida
Ingénieur
Module : Microbiologie Industrielle
a2. L ' A D N : L a biomasse produite renferme u n e teneur importante et constante en A D N . L e dosage
de cet élément permet aussi d'évaluer cette biomasse produite.
a3. L ' A T P : L e dosage d e F A T P produit par les cellules tend à ce généraliser. Ce constituant est un
intermédiaire important du métabolisme cellulaire, puisqu'il est au centre du métabolisme énergétique.
a4. N A D et N A D H : L a biomasse peut être évaluée par la mesure de certaines activités enzymatique ;
comme pour les réactions d'oxydoréduction cellulaire. Au cours de la croissance cellulaire, la quantité
de N A D - N A D H a u g m e n t e en liaison avec la reproduction cellulaire. L a technique utilisée c'est la
fluorimetrie : L e N A D H , coenzyme d'oxydoréduction émet une fluorescence à 4 6 0 n m quand il est
excité par une lumière fluorescente. Sous sa forme oxydée, le c o e n z y m e N A D ne fluoresce pas.
b. Le dosage des constituants du milieu de c u l t u r e
L a croissance microbienne a pour effet de modifier considérablement la composition du milieu dans
lequel elle se déroule. Parallèlement à l'apparition de la biomasse, on assiste à la disparition du
substrat, à la consommation d'oxygène, d ' a m m o n i a q u e , à l'apparition de sous-produit d e métabolisme
et au dégagement de chaleur. L ' é t u d e de la variation des ces paramètres permet de suivre l'évolution
de la biomasse.
c. La détermination des composés volatils p r o d u i t s par les cellules
Les substances volatiles synthétisées par les cellules peuvent être corrélées à la croissance
microbienne.
Exemple : la production d'acétaldéhyde et la concentration en Streptococcus
thermophilus.
d. La détermination du dégagement de chaleur
Toute production de biomasse est accompagnée de dégagement de chaleur. La microcalorimétrie
dynamique permet de relier le dégagement tout développement microbien à la biomasse cellulaire
présente et à son métabolisme.
3 . La courbe d e croissance microbienne
Pour étudier l'évolution d e la croissance microbienne dans u n milieu de culture, on réalise u n e culture
de type classique, dans laquelle, après ensemencement l& croissance se poursuit j u s q u ' à l'épuisement
du milieu. Les paramètres de productions (température pH) sont maintenus constants et favorable au
développement du microorganisme étudié.
L ' é t u d e consiste à suivre, en fonction du temps(t), l'évolution de la concentration X ( n o m b r e de
cellules par unité de v o l u m e de culture) ou concentration en biomasse microbienne (g d e matière sèche
cellulaire par unité de v o l u m e de culture) selon le type de microorganisme (unicellulaire ou
filamenteux).
Les différentes phases obtenues sont :
16
3^
•Soutirage
Air
Colonne
se m o u s s e
-Colonne
descendante"
? J
Echangeât de c h a l e u r
MilieuMilieu
>e
4.22.
Fimx
Fermentar
T.C.I,
à boucle
externe.
Air
Efflent gazeux 2/3
Soutirage
Effluent
gazeux
1/3
Milieu
Bioréaot&ur
Figure
4.SS.
VOGELBUSÇH de 40 m
3
montante
s.a
Mobiles d'agitation à débit radial.
K
I
1
/ s
i
r
1
F!
-4- o
Turbine
Turbine k pale;
incuvées
RUSHTON
Paddle
Agitateur à ancre
Mobiles d'agitation à débit
Hélice marine
Agitateur SPIN
(CHEMAPEC)
axial
Hélice double
Mobile d'agitation à débit radial et
rlux
Hélice à grandi
pales minces
Agitateur à ruban
axial.
belicoidal
Turbine à pales
Figure
inclinées
4.10 - Lea tfférerits
mobiles
d'agitation
183
3 ^
Soutirage
Air
Colonne
Brise
mousse
Colonne
descendante
montante
Echangeur
de c h a l e u r
«—•Air
Milieu-
Milieu
Fiaure
4.22.
- Vemmteur
S.CI.
à boucle
externe.
Air
I
Efflent gazeux 2/3
•••
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Soutirage
ss
Effluent gazeux 1/3
.
VA
\ ñ
Biorêaateur
J?
Figure
4.SS.
V0GELW8ÇH de 40 m
Milieu
(
S.
ñ
Mobiles d'agitation à débit radial
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H/7'
I-
Y
Turbine
RUSHTON
Turbine h pales
incuvces
Agitateur SPIN
(CHF.MAPEC)
Paddle
Agitateur à ancre
Mobiles d'agitation à débit axial _
Hélice marine
Hélice double vlux
Mobile d'agitation à débit radial et
axial.
Hélice à grandes
pales minces
Agitateur à ruban
belicoIda1
aX7>
Turbine à pales
inclinées
Figure 4.10 - Les
differenti mobilen
d'agitation.
183
Fitjura
4. 18.
Fevmmtetw à aù'eulatiun interna
2^jlJ.
/
M aiti*»-
>^vLy^M>Hc \
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o \
A
CJUÏ^
/
\
11
A
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\
Ì I b - A
M: Milieu; S: Soutirage; A: Air
Figure
4.20.
Fermenteur LEFRANCOIS (SPEICHIM) : 1 - Cuve LEFRASCOIS-MARILLER ; 2 -- Cuve LEFRANCOIS inversée
type V ; .3 - Cuve LEFRANCOIS type J.
..
,
^ ^
W U J E
-
5.Л
Fermenten»
Figure 4. Г/
UAUHIOF (WANG ai coll.
ШУИ)