Transcript Diapositive 1 - Biophotonique Cellulaire Fonctionnelle

Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
La biophotonique pour l’étude de la
dynamique et des interactions moléculaires
dans le noyau
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
Corentin Spriet
Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
Comment décrire une protéine/activité…
L’ARN polymérase II
 Enzyme eucaryote
 Complexe de 550 Kda composé de 12 sous-unité (RBP) chez l’humain
• RBP1 = plus grande sous-unité qui contient un domaine C-ter essentiel
pour l’activité de transcription
Architecture du complexe chez
Saccharomyces cerevisiae
Cramer & al, Science, 2000
 Transcription :
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
• des ARNm
• de certains ARNsn (small nuclear)
• de certains microARN
Comment décrire une protéine/activité…
Comment décrire une protéine/activité…
1
Comment décrire une protéine/activité…
Comment décrire une protéine…
pTEFb
Et le temps…
• Heterodimer (CT1+CdK9)
• Free pTEFb : activates RNA polII early elongation step
Diffusion, random collision, binding, conformational changes
• Hexim : inactivate pTEFb
Low number of molecules
• DRB (5,6-dichloro-1—D ribofuranosylbenzimidazole ) : prevent the RNA Pol II early elongation step.
Modèle proposé
inactive
CT1
Hexim
CdK9
Hexim
Hexim
Hexim
(-)
active
DRB
7SK RNA
CT1
CdK9
DRB
RNA
(-)
mRNAs adjust rapidly to changes in genes activity
Proteins follow slowly mRNA changes
ADN
Comment décrire une protéine…
Population/cellules/localisation
Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
From Elowitz MB et al 2002. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science, 297, 1183-6
Etude de la dynamique des protéines
Photobleaching
« Réactions photochimiques irréversibles»
Oxydation (Oxygène sigulet : radical libre)
Décomposition
Polymérisation
Réaction avec d ’autres molécules
Photo-destruction (photobleaching)
- Caractéristique d ’un fluorochrome
- Dépend de l ’environnement
2 coefficients sont principalement utilisés pour caractériser ces mouvements :
 La fraction mobile M
 La constante de diffusion
Ne pas confondre avec le quenching :
Inhibition réversible, dépendante de
l ’environnement.
2
FRAP
FRAP
Lippincott-Schawrtz
FRAP
FRAP
Mb-GFP (durée 30s)
i-FRAP
FLIP
Compartiment
Molécule
fluorescente
Région
d ’intérêt
Acquisition
(pre-bleach)
Photobleaching ( t0)
Acquisition (t1)
Acquisition (t2)
Acquisition (tn)
Avantage :
on regarde une zone qui n’a pas été soumise à une forte source d’énergie :
limite le stress local.
Inconvénient :
Presque toute la cellule est photo blanchie :
stress global plus important.
Avantage :
on regarde une zone qui n’a pas été soumise à une forte source d’énergie :
limite le stress local.
Inconvénient :
Photo blanchiment répété d’une même zone
Moins invasif que le iFRAP mais plus que le FRAP.
3
Photo-activation
Retour à l’ARN PolII
 Photoblanchiement de l’ARN pol II-YFP
GFP photoactivable
GFP excitable a 488
413 nm
GFP fluorescente
Site de bleaching : au niveau du site de
transcription
488 nm
Observation de la
disparition de fluorescence
au spot de photoactivation
Réapparition de l’ARN pol II en
fonction du temps
Exemple de photoactivation de
la PA-GFP en cellules COS-7
Patterson & Lippincott-Schawrtz, Science 2002
In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription Darzacq X, Shav-Tal Y, de Turris V, Brody Y, Shenoy SM, Phair RD & Singer. Nature Structural & Molecular Biology, 2007
Retour à l’ARN PolII
Retour à l’ARN PolII
données obtenues ( ) = somme d’exponentielles
3 populations
3 rôles ?
• rapide = polymérases qui se fixent sur le promoteur
• moyenne = polymérases impliquées dans l’initiation de la transcription
Modèle mathématique qui correspond le
mieux aux données :
2 composantes exponentielles
3 composantes exponentielles
• lente = polymérases impliquées dans l’élongation
Modèle cinétique utilisé pour simuler les données :
A ~ proportion de molécule
a ~ vitesse
Ecarts des points obtenus
expérimentalement par rapport au
modèle
Le modèle à 3 composantes est
meilleur
Équations différentielles qui simulent ce modèle :
→ Variation [pol] en
fonction du temps
22
Retour à l’ARN PolII
Retour à l’ARN PolII
DRB = Inhibiteur de transcription qui affecte l’élongation
→ vérifier que les polymérases en élongation = population lente
Vérifier que les techniques
permettent des mesures
équivalentes
3D FRAP
Confocal
Localisation
-
+
Rapidité
+
-
13% des polymérases qui interagissent avec leur promoteur vont
poursuivre en initiation
 Parmi celles ci : 8,6% vont jusqu’en élongation (soit 1.1% des polymérases
qui ont interagit avec le promoteur)
23
1 interaction sur 90 va produire un ARNm
Le DRB affecte la composante lente du modèle.
Il y a augmentation du temps de résidence des polymérases en élongation.
La population lente correspond aux polymérases en phase d’élongation. 24
4
En résumé
Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
Intéressant de regarder à longue et courte distance
FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy
FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy
1. On positionne le faisceau laser dans un locus
d’ intérêt
=> les particules fluorescentes
entrent et sortent du volume focal
2. On mesure alors les fluctuations d’intensité
3. Calcul de la fonction de correlation
G ( ) 
F (t )F (t   )
F (t )
2
4. Ajustement par un modèle biophysique
approprié
=> Obtention des paramètres (diffusion,
nombre de molécules…)
FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy
L’auto-correlation… vision très schématique
5
FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy
FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy
ligand linked to another molecule
On a le même signal après dt
mix of free and linked ligand
ligand
On a plus du tout le même signal après dt
FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy
Retour à l’ARN PolII
CT1
Hexim
CdK9
Hexim
Hexim
Hexim
(-)
DRB
7SK
CT1
CdK9
DRB
(-)
ADN
14
1,2
CT1
1
CT1
12
CT1 + DRB
0,8
CT1+DRB
10
0,6
8
0,4
6
0,2
4
0
0,01
100
Temps (ms)
2
10000
0
0,01
0,03
0,05
0,07
0,09
0,2
0,4
0,6
0,8
1
3
5
7
9
20
40
60
80
100
300
500
700
900
1
Retour à l’ARN PolII
Retour à l’ARN PolII
CT1
Hexim
CdK9
Hexim
Hexim
Hexim
(-)
CT1
Hexim
CdK9
Hexim
Hexim
Hexim
(-)
DRB
DRB
7SK
CT1
CdK9
DRB
DRB
(-)
(-)
ADN
ADN
16
6
0,4
4
0,2
15
CT1 333
CT1 254
CT1 333
10
5
0
0,01
1000
700
400
70
Temps de diffusion (ms)
100
7
40
4
10
0
1
100
temps (ms)
10000
0
0,01
0,03
0,05
0,07
0,09
0,2
0,4
0,6
0,8
1
3
5
7
9
20
40
60
80
100
300
500
700
900
2
1
10000
0,6
0,7
100
Temps (ms)
8
0,4
0,2
10
20
CT1 254
0,8
0,04
0,4
Contribution relative (%)
0,6
CT1
CT1
1
Hexim
12
0,01
G(t) normalisé
0,8
1
25
1,2
CT1
14
Hexim
0,1
CT1
1
0,07
1,2
0
0,01
7SK
CT1
CdK9
6
Plan:
SPT: principe
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
Principe simple: suivre des particules uniques au cours du temps et étudier leur déplacement
[Ewers et. al. PNAS, 102, 15110-15]
SPT: fluorophores
SPT: en pratique!
European Journal of Neuroscience, Vol. 30, pp. 987–997, 2009
SPT: en pratique!
SPT: en pratique!
Dt(1)
MSD
Dt
7
SPT: en pratique!
SPT: en pratique!
MSD
MSD
Dt
Dt
SPT: en pratique!
SPT: en pratique!
J. Phys. Chem. B 2007, 111, 3625-3632
http://www.biotec.tu-dresden.de/cms/fileadmin/research/biophysics/practical_handouts/spt.pdf
SPT: en pratique!
Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
BMC Cell Biology 2004, 5:45
8
Interactions…
BiFC
Kerppola Lab Online
BiFC
BiFC
FRET, BiFC = interaction
between molecules
Kerppola Lab Online
BiFC
BiFC
Kerppola Lab Online
9
BiFC… les défauts
Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
Le FRET
Le FRET
Changement de conformation
Interactions protéines-protéines
CFP
YFP
FRET
Transfert d’énergie non radiatif du donneur (CFP) vers l’accepteur (YFP)
FRET
Visualisation du FRET par excitation du donneur et observation de l’accepteur
Le FRET
Le FRET: rapport d’intensité donneur/accepteur
FRET
Points critiques:
• Excitation directe de l’accepteur dans le filtre FRET
• Emission du donneur dans le canal FRET
Expérimentalement:
• Donneur avec les 3 combinaisons de filtres
• Accepteur avec les 3 combinaisons de filtres
• Compensation des excitations indirectes et fuites spectrales
•Calcul du FRET
Erickson et al, biophys J, 2003
10
Le FRET: photo-blanchiment de l’accepteur
Plan:
 Introduction:
 Dynamique des réseaux de régulation
 Cellules uniques vs ensemble de cellules
Principe :
 Mesure de dynamique
 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
 FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy)
 SPT (Single Particule Tracking)
FRET
 Etudes des interactions moléculaires par
 BIFC
 FRET / intensité
 FRET / temps de vie de fluorescence
Fluorescence resonance energy transfer from cyan to yellow fluorescent protein detected by
acceptor photobleaching using confocal microscopy and a single laser
T. S. Karpova et al.
Le temps de vie de fluorescence
Δt
Δt
Le temps de vie de fluorescence
Le temps de vie de fluorescence
Temps de vie de fluorescence
log I0/I
k
=1/
avec k = kr + knr
Iint
intrinsèque
Δt
environemental
Dt (ns)
intégrale:
Intensité de fluorescence
Δt
Environement moléculaire,
FRET…
~indépendant de la concentration
11
Mesure de TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting)
Analyse des courbes
F (t )  IRF  (Of   ai e  t /  i )
 a

a
m
i i
i
i
i
i
F(t)
Of
ai
i
: la fonction à déterminer,
: « l’offset » ou niveau zéro à fixer pour fixer le niveau du bruit,
: les coefficients d’intensité exprimés en amplitude relative,
: les temps de vie de fluorescence.
pTEFb
Application aux mesures de FRET
CT1 Cer
FRET
CT1-Cer hexim-Venus
CT1-Cer hexim-Venus+ DRB
3.2 ns
Lifetime images of CT1-Cer
A B
1000
100
τB
τA
A
B+A
τA
Nbr de pixel
Nbr de photons
10000
10
1
Temps (ns)
Mean lifetime: 2,72 +/- 0,01 ns
Mean lifetime: 2,66 +/- 0,01 ns
2.5 ns
Confocal imaging of CT1-Cer
+/- Hexim-Venus
Mean lifetime: 2,85 +/- 0,03 ns
Molecular interaction between
CT1-Hexim in living cells
DRB modify CT1 and Hexim interactions
higher proximity between partners
Temps de vie (τ)
Temps de vie (τ)
Travail in vivo: étude dans l’embryon
Dynamique et interactions en cellules/tissus/animaux.
3 ns
Dynamique
Interactions (FRET)
FRAP
Fluorescence Recovery
After Photobleaching
FCCS
TCSPC
Fluorescence Cross
Correlated Spectroscopy
Time Corelated Single
Photon Counting
FLIP
FCS
φ/M
SLiM
Fluorescence Loss In
Photobleaching
Fluorescence Correlated
Spectroscopy
Phase and Modulation
lifetime
Spectral and Lifetime
Measurements
1.5 ns
12
Definition
Les bio-senseurs
•
Les biosenseurs sont des systèmes de reconnaissance moléculaire dont certains
éléments sont inspirés ou ont été empruntés à des systèmes biologiques connus.
•
La définition formelle proposée par IUPAC est : [traduction libre]
Un biosenseur est un dispositif intégré autonome capable de fournir des informations
analytiques quantitatives ou semi quantitatives en utilisant un élément biologique de
reconnaissance qui est en contact spatial direct avec un élément de transfert.
Un biosenseur doit être clairement distingué des systèmes bioanalytiques qui demandent
des étapes supplémentaires de fonctionnement, tel que l'addition de réactifs.
De plus, un biosenseur doit être distingué d'une biosonde qui est soit jetée après une
utilisation, i.e. à usage unique ou incapable de suivre la concentration d'analyte de
façon continue.
Analyte
Biorecepteur Transducer
Measurable signal
Biosenseur : un terme générique a large spectre!
Principe
Analyte
Biorecepteur Transducer
Measurable signal
Biosenseur
•
Kinase activity reporter
Un biosenseur est généralement constitué de deux parties aux fonctions distinctes.
Ces parties sont le système de reconnaissance et le transducteur (« transducer
élément »).
Kinase activity reporter
Biosensors design: Getting the blocks together
1
2
3
4
1-FRET donor, 2- PAABD +Linker, 3- Kinase substrate and docking site, 4- FRET acceptor
Fig. 1. Basic structure of a kinase activity reporter. A kinase activity reporter consists of four basic
modules that are linked in sequence, namely a FRET donor (e.g. CFP), a phosphoaminoacid binding
domain, a substrate domain, and a FRET acceptor (e.g. YFP). Additional elements include defined
docking sites for recruiting the kinase of interest and localization sequences for targeting the reporter to
different subcellular compartments or protein complexes.
FRET-based biosensor tool kit library
Using multisite Gateway strategy
13
Kinase activity reporter
Le FRET: rapport d’intensité donneur/accepteur
FRET
Points critiques:
• Excitation directe de l’accepteur dans le filtre FRET
• Emission du donneur dans le canal FRET
Expérimentalement:
• Donneur avec les 3 combinaisons de filtres
• Accepteur avec les 3 combinaisons de filtres
• Compensation des excitations indirectes et fuites
spectrales
•Calcul du FRET
Erickson et al, biophys J, 2003
Le FRET: rapport d’intensité donneur/accepteur pour les senseur!
Etudes d’interaction dynamique
Phase lifetime
AKAR2 biosensor
Monitors PKA/phosphatase equilibrium
• PKA activation: phosphorilation of theonine domain
Reversible conformational change:
• Phosphatase: can dephosphorilate the probe
Forskoline: indirect activator of PKA activity
Modulation lifetime (ns)
2,5
Forskoline
2,4
2,3
ROI1
2,2
ROI2
2,1
ROI3
2
ROI4
1,9
ROI5
1,8
ROI6
1,7
tEpac vv
Couplage de technique
0
500
1000
time (s)
1500
2000
ROI7
cAMP activity Reporter
14
Biosenseurs Caspase
Biosenseurs Caspase
 Exemple de résultats :
Principe d’un biosenseur caspase :
Biosenseur caspase 8
Activation caspase 8 en
cellules HeLA après induction
de l’apoptose par le TNF-α
FRET
Luo et al, BBRC, 2003
Condition : 10 nm max entre les
fluorophores
10 μm
 Exemple de résultats :
Biosenseur caspase 3
Différents biosenseurs
caspases existants
Neefjes et al, Nat Rev Drug Discov, 2004
85
86
Cellules HeLa traitées à la staurosporine (= inducteur apoptose)
activation caspase 3
Ai et al, Nat Met, 2008
Régulation du cycle cellulaire
Premo™ FUCCI Cell Cyle Sensor
Premo™ FUCCI Cell Cyle Sensor
Premo™ FUCCI Cell Cyle Sensor
Movie S1. Time-Lapse Imaging of Fucci-Expressing HeLa Cells. Cells were grown on a glass-bottom dish, and
time-lapse imaging was performed with an LCV100 microscope (Olympus). Images were acquired every 13.5 min.
Playback speed is 24300 × real time. Total imaging time = 64 hr.
15
Premo™ FUCCI Cell Cyle Sensor
TD Exam!
Movie S2. Time-Lapse Imaging of Fucci-Expressing NMuMG Cells. Cells were grown on a glass-bottom dish with
(right) or without (left) TGFβ. After incubation for 3 days, culture medium was replaced with fresh medium. Images
were acquired every 10.3 min. Playback speed is 18,000 × real time. Total imaging time = 87 hr. The scale bar
represents 50 μm.
Lambda/NA
4 Questions rapides (5 min par question, prévoir 20 min, 1/3 des
points)
Expliquer la limite de résolution en optique par un schéma et une
courte explication. Donner les paramètres importants.
Critère de Rayleigh :
d=
0,61 
N.A.
N.A. : ouverture numérique
de l’objectif
Objectifs
Exemples de questions rapides:
•
•
•
•
•
•
•
Différence technique entre un confocal et un microscope champ large
Dans quel cas choisir un confocal ou un microscope champ large
Choix de l’echantillonnage
Comment retirer du bruit d’une image sans ajouter un effet de flou
Proposez une méthode pour « remplir les trous » de cette structure.
Principe du FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)
Comment choisir son fluorophore?
Exemples de questions redactionelles:
Principales spécifications :
- ouverture numérique (ex. : 1,4)
- grandissement (ex.: 60x)
- milieu d’immersion (air, eau, huile)
- type de correction
• Proposez une méthode pour faire du suivi de cellules et de mitoses
• Proposez une méthode de suivi de l’étape du cycle cell
• Proposez une méthode se suivi de la dynamique d’une protéine d’interet
stratégie générale et pourquoi
description rapide de l’experience
contrôles proposés
16
ICF
Effet confocal assuré!
ICF
Champ large vs Confocal
Camera CCD
Photomultiplicateur
Filtres
Pinhole
Miroir Dichroïque
Source
Laser
Objectif
Conventionnelle
dxy = 0,61.em/(n sin)
dxz = 2.em/(n sin)2
dxy = 0,4.em/(n sin)
dxz = 1,4.em/(n sin)2
Fluorophore
Echantillon
Lampe Mercure
100 W
Confocal
Scanning
Microscopie
Classique
Abbe, 1872
Microscopie
confocale
Marvin Minsky
(1957)
ICF
Un bon fluorophore doit posséder :
• une absorbance molaire élevée
• un rendement quantique de fluorescence le plus près possible de 1
• un spectre d'émission dans le visible
• un déplacement de Stokes supérieur à 50 nm
•éventuellement une stabilité des propriétés de fluorescence une fois couplé à une
molécule non fluorescente (protéine) que l'on cherche à coupler.
Peu de substances rassemblent ces propriétés. La fluorescéine, la rhodamine, les
coumarines, l'umbelliférone et leurs dérivés sont les plus utilisés. La durée de vie
de toutes ces substances sont brèves, de l'ordre de quelques ns.
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