Transcript TP janvier 2014 - Aix Marseille Université

UNIVERSITE D’AIX-MARSEILLE
FACULTE DES SCIENCES DE SAINT-JEROME - SITE DE L’ETOILE
IUT DE MARSEILLE
Licence Professionnelle
Méthodes et Techniques d’Analyses Chimiques et Biologiques
TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE
UE4
CONTROLE QUALITE MICROBIOLOGIQUE :
ALIMENTS, EAUX, COSMETIQUES
2013-2014
Responsable des TP : Agnès HIRSCHLER-REA
Encadrement avec Johnny BONNARDEL
SOMMAIRE
Organisation des TP
Règles à respecter en microbiologie
4
7
Techniques de microbiologie :
Dénombrements
Coloration de Gram
Isolement de souches de collection sur milieux sélectifs et différentiels
Analyse de l’air et des surfaces
Contrôle du personnel
Contrôle d’un produit cosmétique
Analyse d’une eau
Analyse d’une viande
Analyse d’un lait
8
9
9
10
11
12
17
19
21
Annexes :
Table de Mc Crady
Staphylocoagulase
Thermonucléase
Pastorex Staph-Plus
Sérotypage d’une salmonelle
Galerie API 20E
Interprétation en fonction des normes
26
26
26
27
29
31
35
Gélose à l’ADN et au bleu de toluidine
Baird-Parker (gélose)
Caseine-Soja (bouillon)
Caseine-Soja (gélose)
Cétrimide (gélose)
Chapman (gélose)
Cœur-cervelle (bouillon)
D-coccosel (gélose BEA)
Gélose pour le dénombrement
des microorganismes de surface
Eau peptonée alcaline
Eau peptonée exempte d’indole
Eau peptonée nitratée
Eau peptonée tamponnée
36
37
38
39
40
41
42
43
Milieux de culture :
2
44
43
45
43
45
Gélose d’Edwards modifiée
46
Hektoen (gélose)
47
King A (gélose)
43
Bouillon Lactosé bilié au vert brillant (BLBVB)
48
L.E.B. (bouillon pour Listeria)
48
Lecithine-Polysorbate-Triton X (bouillon)
49
Lecithine-Polysorbate-Triton X (gélose)
49
Litsky (bouillon)
50
Mac Conkey (bouillon)
51
Mac Conkey (gélose)
52
Muller-Hinton (gélose)
53
PALCAM (gélose)
54
PCA (gélose)
55
PCA au lait écrémé
50
Rappaport-Vassiliadis (bouillon de)
56
Sabouraud (gélose)
57
Gélose au sang
55
Bouillon sélénite-cystine
58
Slanetz et Bartley (milieu de)
59
Gélose SS (Salmonella-Shigella)
60
T.C.B.S. (gélose)
59
T.S.C. (gélose Tryptone-Sulfite-Cyclosérine)
61
T.T.C. et Tergitol (gélose lactosée au)
62
Viande-Foie complet (gélose VF-complet)
62
V.R.B.L.
63
(gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre)
Origine des documents :
Sociétés Api System, Biokar Diagnostic, Biomérieux, BioRad Diagnostics Pasteur et Merk.
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Organisation des TP
1er Jour
Confection de milieux liquides et gélosés
Jeudi
Techniques microbiologiques : dénombrement en milieux gélosés, en milieux liquides
Isolements sur milieux sélectifs et différentiels de quelques souches de collection
Identification d’une souche d’entérobactérie (galerie API20E) et vérification de la pureté
de la suspension
2ème Jour
Contrôle de la qualité d’un produit cosmétique
Vendredi
Techniques microbiologiques suite : observations microscopiques (Etats frais et Gram)
Techniques microbiologiques : Résultats
Observation des isolements de souches connues sur milieux sélectifs (24 h – boîtes à conserver)
Lecture de la galerie API20E
3ème Jour
Lundi
Analyse des surfaces, de l’air, du personnel
Analyse d’une viande
Analyse d’une eau
Produit cosmétique (jour 3) : isolements
4ème Jour
Mardi
Analyse du lait :
Recherche d’activités enzymatiques sur deux laits (un lait cru et un lait pasteurisé)
Qualité microbiologique sur un seul lait, le lait cru
lait cru à conserver à 4°C pour le lendemain !
Viande (jour 2) :
Lecture de tous les dénombrements
Lecture et repiquage des BLBVB
Identification d’un coliforme (galerie API20E)
Ensemencement d’un bouillon cœur-cervelle (staphylocoques)
Isolement de salmonelles
4
Eau (jour 2) :
Lecture de tous les dénombrements
Isolement pour la recherche des vibrios
Identification d’un coliforme (galerie API20E)
Ensemencement d’un bouillon cœur-cervelle (staphylocoques)
Ensemencement d’un bouillon de Litsky (streptocoques fécaux)
Recherche de la staphylocoagulase, de la thermonucléase et test ‘Pastorex Staph-Plus’
sur souches de collection : repiquer sur bouillon cœur-cervelle et ensemencer une
gélose Chapman avec chacune des deux souches, S. aureus et S. epidermidis
Produit cosmétique (jour 4) :
lecture des isolements
tests de confirmation
5ème Jour
Mercredi
Analyse du lait (suite) :
recherche d’antibiotiques
recherche de bactériophages
Viande (jour 3) :
Identification d’un coliforme (lecture de galerie)
Identification d’une salmonelle (API20E)
Recherche de la staphylocoagulase, de la thermonucléase*
Eau (jour 3) :
Identification d’un coliforme (lecture de galerie)
Ensemencer ou lecture du bouillon de Litsky
Lecture du milieu TCBS
Recherche de la staphylocoagulase, de la thermonucléase*
*en témoin positif et négatif, réaliser les tests sur les souches de collection
Test rapide ‘Pastorex Staph-Plus’ a effectuer selon la notice du fournisseur
(BioRad) uniquement sur les souches de collection (S. aureus et S. epidermidis)
Lait (jour 2) :
Lecture de dénombrements
Identification d’un coliforme (galerie API20E)
Ensemencement d’un bouillon cœur-cervelle (staphylocoques)
Isolement de salmonelles
Produits cosmétiques (jour 5) :
Dénombrements
Poursuite des confirmations
5
6ème Jour
Jeudi
Produits cosmétiques :
Viande (jour 4) :
Identification d’une salmonelle (lecture de galerie et sérotypage)
Eau (jour 4) :
Lait (jour 3) :
‘challenge-test’ (temps 0)
(jour 6) : Poursuite des confirmations
Lecture du bouillon de Litsky
Test de la staphylocoagulase
Identification d’un coliforme (lecture de galerie)
Identification d’une salmonelle (galerie API20E)
Isolement de Listeria
Résultats, antibiogrammes et bactériophages
Produit cosmétique :
‘challenge-test’ (temps 1 = après 1h30)
7ème Jour
Vendredi
Lait (jour 4) :
Dénombrements et lecture du milieu Palcam
Identification d’une salmonelle (sérotypage)
Sérotypage sur une souche de collection : uniquement dans le cas où aucun
sérotypage n’a pu être effectué auparavant
Produit cosmétique (jour 8) :
temps 1)
Résultats ‘challenge-test’ (suspension stock et
Résultats analyses surfaces, air, personnel : dénombrements, observations
macroscopiques (description des colonies) et microscopiques (coloration de Gram sur 3
colonies bactériennes)
Diffusion des résultats bruts (n = 5)
Commentaires sur les différents produits analysés
Examen écrit
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LES REGLES A RESPECTER DANS UNE MANIPULATION
De rigoureuses précautions d'asepsie doivent être prises, ces précautions doivent toujours être
respectées quelles que soient les manipulations effectuées :
- le bactériologiste doit travailler assis, sans parler, le plus près possible du bec
Bunsen, la paillasse doit être propre (lavée à l'eau de javel) et en ordre ;
- les manipulations s'effectuent le plus près possible du bec Bunsen, en évitant les
mouvements de bras et d'avant-bras désordonnés ; la zone d'asepsie réalisée par la flamme est
de 20 cm de rayon et, en aucun cas un tube ouvert ou une boîte ouverte ne doivent s'en
écarter ;
- avant de servir à l'ensemencement ou au prélèvement le fil métallique de l'öse doit
être porté au rouge dans la flamme du bec Bunsen, puis tenu quelques instants près de celui-ci
afin qu'il refroidisse ; après utilisation, il est impérativement stérilisé à la flamme ;
- au moment d’utiliser une pipette Pasteur, on casse l'extrémité effilée (près du bec
Bunsen), en bouchant l'autre extrémité (cotonnée) avec l'index (pour qu'il n’y ait pas appel
d'air et donc défaut de stérilité) et on passe rapidement l'extrémité effilée à la flamme ;
- la pipette Pasteur usagée doit être déposée côté effilé vers le bas dans un bac de
javel ;
- le manche de l'öse ou de la pipette est tenu entre le pouce et l'index de la main droite,
les autres doigts de la main sont tenus incomplètement fermés et ils permettent de saisir le
coton ou le bouchon des tubes en le calant contre le bord de la main ; le coton et le bouchon
ne doivent en aucun cas être posés sur la paillasse ;
- il faut éviter de faire avec l'avant-bras droit des mouvements, c'est le tube tenu de la
main gauche qui doit se rapprocher de la main droite, il est tenu entre le pouce et l'index de la
main gauche, et il est toujours tenu incliné à 45° ;
- on doit prendre la précaution avant de pratiquer l'ensemencement de passer l'orifice
supérieur du tube débouché à la flamme, faire la même chose avant de reboucher le tube puis
déposer celui-ci en position verticale sur le portoir ; quand le tube ne doit plus être ouvert,
brûler rapidement le coton et l'enfoncer avec la pince ;
- dans le cas des boîtes de Petri (pour couler les milieux ou pour les ensemencer), les
poser au pied du bec Bunsen et soulever le couvercle à 45° ;
- à la fin du TP, laver la paillasse à l'eau de javel et se laver les mains au savon.
Disposition du matériel
Le bec Bunsen est devant le manipulateur, les portoirs à gauche, car c'est la main gauche qui
tient les tubes, le bac à pipettes souillées à droite, le microscope le plus loin possible de la
flamme.
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TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES
Dénombrements d’une suspension bactérienne en milieu solide et en milieu
liquide
- Préparation de dilutions au dixième en cascade
Réaliser une série de dilution jusqu’à 10-10 avec des tubes contenant 9 ml d'eau physiologique
stérile : Introduire 1 ml dans le tube 10-1. Homogénéiser le contenu du tube. Prélever avec une
pipette stérile, 1 ml de cette première suspension et le transférer dans le tube 10-2.
Homogénéiser. Prélever avec une pipette stérile, 1 ml de suspension 10-2 et le transférer dans
le tube 10-3 ... Poursuivre ainsi les dilutions jusqu'à 10-10. Changer de pipette pour chaque
dilution.
- Ensemencement de milieux gélosés
Ensemencement en surface de milieux gélosés
Déposer 0,1 ml des dilutions 10-7 à 10-4 en surface de gélose nutritive en boîtes, 2 boites par
dilution. L’inoculum d’une série de boîte sera étalé à l’aide de 5 ou 6 billes stériles que l’on
retirera avant incubation. Pour la seconde série de boîte, l’inoculum sera étalé avec une
pipette préalablement coudée à la flamme du bec de gaz.
Ensemencement dans la masse de milieux gélosés
Régénérer la gélose nutritive au micro-onde et la placer à l’étuve à 45-50°C. Marquer les
boîtes de Petri sur la tranche de la boîte. Déposer 1 ml de suspension (dilutions de 10-8 à 10-5)
dans le fond de chaque boîte sous forme de plusieurs gouttes en commençant par la dilution la
plus élevée. Y verser le milieu gélosé maintenu en surfusion au bain-marie réglé à 45°C, de
sorte à recouvrir le fond de la boîte. Homogénéiser doucement. Laisser le milieu gélosé se
solidifier, puis retourner les boîtes. Ensemencer 1 boîte par dilution.
Commencer toujours les ensemencements par les dilutions les plus fortes ceci permet de
n’utiliser qu’une seule pipette pour ensemencer l'ensemble des boîtes.
- Ensemencement de milieux liquides : méthode de Mc Crady, ou ‘NPP’ (nombre le plus
probable)
Marquer les tubes de bouillon nutritif de 10-6 à 10-10, 3 tubes par dilution. Ensemencer les
tubes de la dilution 10-10 à la dilution 10-6. Chaque tube est ensemencé avec 1 ml des
dilutions.
Commencer toujours les ensemencements par les dilutions les plus fortes ceci permet de
n’utiliser qu’une seule pipette pour ensemencer l'ensemble des tubes.
Incubation : 37°C pendant 24 heures.
Composition des milieux :
Eau physiologique : qsp 1 l, NaCl 8,5 g.
Bouillon nutritif : qsp 1 l, tryptone 10 g ; Extrait de viande 5 g ; NaCl 5 g ; pH 7,2.
Gélose nutritive : bouillon nutritif auquel 15 g/l d’agar sont ajoutés.
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Observations microscopiques de quelques souches bactériennes à l'état frais
et après coloration de Gram
Coloration de Gram :
Préparer un frottis :
Déposer une petite goutte d’eau distillée sur une lame de microscope. Prélever à l’öse une
fraction de colonie bactérienne et réaliser un frottis par étalement et homogénéisation du
prélèvement dans la goutte d’eau. Laisser sécher. Fixer le frottis à la chaleur.
Coloration :
Faire agir successivement sur le frottis :
- cristal violet, 1 min ;
- lugol, 1 min ;
- alcool, 30 s ;
- safranine, 30 s.
Après l'action de chacun des réactifs, rincer la lame à l'eau distillée.
Sécher soigneusement la préparation avant observation.
Observer la préparation avec l’objectif x100 après avoir déposé une goutte d’huile à
immersion sur la préparation. Les bactéries Gram + apparaissent colorées en violet, les Gramen rose.
ISOLEMENT DE SOUCHES DE COLLECTION SUR MILIEUX
SELECTIFS ET DIFFERENTIELS
Effectuer les isolements suivants (au préalable, réaliser une suspension en eau physiologique
dans le cas de cultures présentées en milieu gélosé) :
-
sur gélose Chapman : Staphylococcus aureus, S. epidermidis et Bacillus spp.
-
sur gélose Baird-Parker : Staphylococcus aureus et S. epidermidis
-
sur gélose VRBL : Escherichia coli et Proteus vulgaris
-
sur gélose Hektoen : Escherichia coli, Proteus vulgaris et une salmonelle
-
sur gélose SS : Escherichia coli, Proteus vulgaris et une salmonelle
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ANALYSE DE L'AIR ET DES SURFACES
De nombreuses bactéries transitent par l'air. Elles peuvent être pathogènes et
contenues dans les aérosols. Elles sont en général saprophytes, quelquefois sporulées,
transportées par les courants d'air, à l'état libre ou fixées sur des particules en suspension dans
l'air (poussières, pollens, aérosols...). Elles se déposent plus ou moins lentement et
contaminent les surfaces exposées à l'air. Ces dernières sont en plus contaminées par les
mains des manipulateurs ou par les produits auxquels elles sont exposées.
But de la manipulation
Estimation de la contamination de l'air de la salle de travaux pratiques et de la surface
du plan de travail.
Matériel et mode opératoire
- 3 boîtes contact
(gélose pour le dénombrement des
microorganismes de surface)
- gélose nutritive PCA
(3 boîtes)
- Contamination de l'air :
Ouvrir 3 boîtes de Petri contenant de la gélose nutritive, les exposer à l'air libre dans la
salle de travaux pratiques. Après chaque heure, refermer une des boîtes. Incuber les boîtes à
30°C pendant 4 jours.
- Contamination du plan de travail :
Trois boîtes de Petri de 55 mm de diamètre comportant un ménisque de gélose
favorable au développement des microorganismes de surface sont mises en contact avec la
surface étudiée pendant 10 secondes et avec une pression constante. Incuber les boîtes de Petri
à 30°C pendant 4 jours.
Lecture et expression des résultats
Compter toutes les colonies présentes sur les boîtes. Dans le cas de la contamination
de l'air, exprimer les résultats en nombre de bactéries déposées par unité de surface et de
temps. Dans le cas de la contamination des surfaces, exprimer le résultat par unité de surface.
Le quadrillage du fond des boîtes permet de faciliter la numération.
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CONTROLE DU PERSONNEL
Matériel et mode opératoire
-
gélose nutritive PCA (3 boîtes)
gélose au sang (2 boîtes)
-
écouvillons stériles (2)
eau physiologique
Mise en évidence de la microflore portée par les cheveux et les poils
Prélever un cheveu ou un poil et le déposer sur une gélose nutritive PCA en boîte de
Petri. Après 5 secondes de contact, le retirer.
Incuber pendant 48 heures à 37°C ou 4-5 jours à 30°C.
Mise en évidence de la microflore de la peau
Humidifier un écouvillon stérile dans une solution d’eau physiologique stérile. A
l’aide de l’écouvillon, effectuer le prélèvement en frottant 6 cm2 de peau (côté du nez, pli du
coude …). Etaler sur une gélose au sang et incuber pendant 48 heures à 37°C ou 4-5 jours à
30°C.
Réaliser la même expérience après avoir vigoureusement désinfecté l’emplacement du
prélèvement avec un tampon d’alcool à 95°.
Contrôle de l’hygiène des mains (à effectuer sur une boîte / étudiant)
Faire une empreinte d’un doigt sur une gélose PCA en boîte de Petri :
avant lavage des mains ;
après avoir passé les mains sous un courant d’eau et séché au papier à usage
unique ;
après un lavage simple au savon (Le lavage est réalisé avec une seule dose de savon
et au minimum pendant 30 secondes puis les mains sont rincées et essuyées
soigneusement en les tamponnant avec du papier à usage unique) ;
après avoir rincé les doigts à l’alcool puis séchés.
Incuber pendant 48 heures à 37°C ou 4-5 jours à 30°C.
Lecture et expression des résultats
Compter toutes les colonies présentes sur les boîtes. Exprimer les résultats en
nombre de bactéries déposées par unité de surface le cas échéant.
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CONTROLE D’UN PRODUIT COSMETIQUE
Contrôle du respect des critères microbiologiques
Paradoxalement, il n’existe pas de critères microbiologiques, au sens législatif du
terme, comme il en existe pour les produits alimentaires. D’après la pharmacopée française
(Xe édition), il faut rechercher ou dénombrer : la microflore totale ; les levures et moisissures ;
les entérobactéries ; les bactéries sulfito-réductrice ; Staphylococcus aureus et Pseudomonas
aeruginosa. Les microorganismes recherchés sont pathogènes (S. aureus, P. aeruginosa :
responsables d’infections cutanées) ou font partie de la microflore commensale. D’une
manière générale la microflore risque d’altérer la qualité du produit (modification de l’aspect,
de l’odeur,…).
La plupart des fabricants de produits cosmétiques, de parfumerie et d’hygiène
respectent les critères suivants :
- Microorganismes aérobies mésophiles :
moins de 103 par ml ou par g dans le cas général ;
moins de 50 par ml ou par g dans le cas de cosmétiques utilisés autour des yeux ;
moins de 100 par ml ou par g dans le cas de cosmétiques pour soins des nourrissons, pour
soins en milieu hospitalier, crèmes à raser, produits d’hygiène génito-urinaire, produits en
contact avec les muqueuses, produits pouvant être inhalés.
- Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa :
absence
- Entérobactéries et bactéries sulfito-réductrices :
absence dans le cas de
produits susceptibles d’être employés pour les soins de nourrissons et des patients
hospitalisés.
- Levures et moisissures :
absence dans le cas de produits susceptibles
d’être employés pour les soins de nourrissons et des patients hospitalisés.
Matériel et mode opératoire
- pipettes stériles
- gélose Lécithine-Polysorbate-Triton
- 1 flacon de 100 ml avec 45 ml de bouillon (flacons)
Lécithine-Polysorbate-Triton X
- gélose VF-complet (2 tubes)
- 1 flacon de 60 ml avec 25 ml de bouillon - gélose Sabouraud (flacons)
Mac Conkey
- gélose Mac Conkey (1 boîte)*
- 1 flacon de 60 ml avec 25 ml de bouillon - gélose au cétrimide (2 boîtes)*
Caséine-Soja
- gélose Baird-Parker (1 boîte)*
- 1 tube paraffine liquide stérile
- gélose ordinaire (1 boîte)*
- 1 tube vide stérile
- gélose King A (1 boîte)*
- bain-marie à 37 et 45°C
- bouillon cœur-cervelle (1 tube)*
- étuve à 42°C*
- eau peptonée nitratée (1 tube)*
- réactif oxydase*
- milieu de Hugh et Leifson (1 tube)*
- gélose à l’ADN (flacon)*
* matériel à utiliser ultérieurement le cas échéant
Certains produits cosmétiques possèdent un pouvoir inhibiteur intrinsèque, c’est à dire une
protection contre la contamination microbienne, soit du fait de leur composition, soit par ajout
de conservateurs. Ce pouvoir inhibiteur intrinsèque doit être neutralisé par l’utilisation de
diluant neutralisant.
- Préparation de l’échantillon : Introduire aseptiquement 5 ml de produit à analyser dans
45 ml de bouillon Lécithine-Polysorbate-Triton X, un diluant neutralisant. Dans le cas de
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X
produits solides, introduire 5 g de produit dans un sac stérile pour stomacher. Homogénéiser
l’échantillon par passage au stomacher pendant 30 secondes environ. Ce broyage permet au
diluant d’entrer en contact avec l’échantillon.
Avant de réaliser les ensemencements, laisser reposer pendant 15 à 20 minutes à température
ambiante.
1- Dénombrement des bactéries aérobies mésophiles : Ensemencer en gélose (gélose
Lécithine-Polysorbate-Triton X) dans la masse, 2 ml de la suspension mère (10-1). Incuber 5
jours à 30°C.
2- Recherche des entérobactéries : Introduire aseptiquement 10 ml de suspension mère
dans un tube vide stérile. Incuber 2 à 5 heures à 37°C avant de les transférer dans un flacon
contenant 25 ml de bouillon Mac Conkey. Incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures.
3- Recherche des staphylocoques et Pseudomonas : Introduire aseptiquement 10 ml de
suspension mère dans 25 ml de bouillon Caséine-Soja. Incuber 24 à 48 heures à 37°C.
4- Recherche des anaérobies sulfito-réducteurs (ASR) : régénérer 2 tubes de gélose
VF-complet au bain-marie bouillant, placer à 45°C. Ensemencer rapidement chaque tube avec
5 ml de la suspension mère. Homogénéiser immédiatement sans aérer. Refroidir sous courant
d’eau et ajouter 1 cm de paraffine liquide. Incuber à 37°C pendant 5 jours.
5- Dénombrement des levures et moisissures : Ensemencer dans la masse une gélose
Sabouraud avec 2 ml de suspension mère (10-1). Incuber 5 jours à 22°C.
Lecture, poursuite des recherches et expression des résultats
- Effectuer les différents dénombrements et exprimer les résultats en fonction des
critères donnés.
- Effectuer un isolement sur une boîte de gélose Mac Conkey à partir de
l’enrichissement en bouillon Mac Conkey pour la recherche des entérobactéries. Après
incubation (24 h à 37°C), dans le cas de colonies suspectes, ensemencer une gélose ordinaire.
Dans ce but, mettre une colonie en suspension dans quelques gouttes d’eau distillée stérile et
réaliser un isolement par épuisement. Après incubation (24 h à 37°C), les colonies présentes
permettront de vérifier les caractères de famille :
Commencer par le test de l’oxydase (voir ci-dessous). Si le test est négatif, poursuivre en
effectuant la recherche du type respiratoire, la voie d’attaque du glucose et la recherche de la
capacité à réduire les nitrates.
Remarque : les entérobactéries, sont Gram -, oxydase -, aérobie-anaérobie facultatif, de type
fermentatif et nitrate réductase +.
- A partir de l’enrichissement en bouillon Caseine-Soja, effectuer, d’une part un
isolement sur une boîte de gélose Baird Parker et d’autre part, un isolement sur une boîte de
gélose au cétrimide. Les boîtes sont incubées 24 h à 37°C.
-En cas de colonies suspectes sur gélose Baird Parker, effectuer un Gram sur une
colonie caractéristique. En présence de coques Gram+, ensemencer un bouillon cœur-cervelle
pour pouvoir effectuer ensuite une recherche de la coagulase et de la thermonucléase.
- En cas de colonies caractéristiques sur gélose au cétrimide, vérifier l’oxydase, et, si
le test est positif, préparer une petite suspension bactérienne à partir d’une colonie dans de
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l’eau physiologique et réaliser un nouvel isolement sur gélose au cétrimide (incubation 42° C
pendant 24 h), et ensemencer une gélose King A.
Tests de confirmation :
Recherche de l’oxydase : A partir d’un milieu solide, prélever une quantité suffisante
de culture et la déposer à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée (=instrument n’oxydant pas
le réactif) sur un papier filtre préalablement imprégné du réactif (chlorhydrate de N,N
diméthyl para-phénylène diamine à 1 g.l-1) placé sur une lame de verre.
En cas d’apparition d’une couleur violette, la souche possède une enzyme capable d’oxyder la
forme réduite incolore du réactif, en forme oxydée rose violacé. La souche est alors dite
oxydase +.
Voie d’attaque du glucose et type respiratoire :
Préparation des milieux et ensemencement pour l’épreuve de Hugh et Leifson :
Régénérer 1 tube de milieu Hugh & Leifson au bain marie bouillant. Refroidir vers 45-50°C.
Incorporer le glucose pour obtenir une concentration finale de 1% (donnés : solution stock de
glucose à 30% ; volume du milieu Hugh & Leifson, 5 ml / tube ; volume d’une goutte de
pipette Pasteur ≈ 50 µl). Solidifier sous l’eau froide. Inoculer par piqûre centrale. Incuber à
37°C pendant 24 h ou plus.
Lecture-interprétation :
Ce test est destiné à déterminer la voie d’attaque du glucose, mais permet également de
déduire le type respiratoire.
- acidification (virage au jaune) en surface seulement: respiration aérobie du glucose. La
souche est probablement aérobie stricte (vérifier le long de la piqûre). Type oxydatif.
- Acidification dans tout le tube : respiration ou fermentation aérobie du glucose et
fermentation anaérobie. La souche est aérobie anaérobie facultative. Type fermentatif.
- Alcalinisation en surface (virage au bleu) : pas d’utilisation du glucose mais des
peptones. La souche peut être aérobie stricte ou non (vérifier au niveau de la piqûre).
Type inerte.
- Pas de modification du milieu (milieu vert) : vérifier la présence de culture, le milieu
n’est pas ensemencé ou manque de nutriments nécessaires à la croissance du
microorganisme.
Composition du milieu (g/l) : bio-trypcase, 2 ; NaCl, 5 ; K2HPO4, 0,3 ; gélose, 2,5 ; Bleu de
bromothymol, 0,03.
Mise en évidence de la nitrate-réductase :
Ensemencer une eau peptonée nitratée et incuber 24 h à 37°C. Suite à l’incubation, ajouter
dans la culture quelques gouttes des réactifs de Griess (Nit 1 et Nit 2). Une couleur rouge en
surface témoigne de la présence de nitrites.
Si le milieu reste incolore, ajouter une pointe de spatule de poudre de zinc. Agiter et attendre
5 min avant de lire : si le milieu devient rouge brun, il reste des nitrates ; s’il reste incolore,
les nitrates ont été réduit au-delà du stade nitrite.
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Challenge-test : Contrôle de l’efficacité des antimicrobiens présents dans le
produit par test de croissance
Le test d’épreuve (challenge-test) simule une contamination secondaire d’un produit
cosmétique, c’est-à-dire une contamination liée à l’utilisation du produit. Ce test est à
appliquer au stade du développement d’un nouveau produit et permet d’évaluer la protection
antimicrobienne du produit.
Le principe du « challenge-test » consiste à mettre en contact le produit cosmétique
avec un inoculum calibré de microorganismes tests, puis de suivre l’évolution du nombre de
microorganismes à intervalles de temps définis.
Actuellement, il existe plusieurs protocole de « challenge-test » utilisés par les
industriels. Ces protocoles diffèrent par les souches tests utilisées (espèces, souches pures ou
mélange de souches), des concentrations de l’inoculum et de la durée du suivi du test (en
général à J2, J7, J14 et J28).
Le « challenge test » peut aussi être réalisé sur des échantillons de produits
cosmétiques préalablement soumis à un vieillissement accéléré (un mois à 40°C).
Les microorganismes utilisés sont généralement des souches bactériennes (Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) et des champignons (Candida
albicans, Aspergillus niger).
Dans le cadre du TP, le test sera effectué sur une souche bactérienne, à savoir
Escherichia coli, ou sur une levure, Candida albicans. Le suivi ne sera réalisé que sur
quelques heures.
Matériel, mode opératoire et lecture
- 9 tubes ‘courts’ de diluant (NaCl 0,9 %)
- 1 flacon de 60 ml (col large) avec 9 ml de
pipettes stériles
- préculture d’E. coli sur gélose trypcase- bouillon Lécithine-Polysorbate-Triton X
soja* ou de C. albicans sur gélose Sabouraud - gélose trypcase-soja pour E. coli (6 boîtes)*
- spectrophotomètre et cuves
ou Sabouraud pour C. albicans
- vortex
- pipetman et cônes jaunes stériles
-1 flacon vide stérile à col large de 250 ml
* Composition de la gélose trypcase-soja : qsp 1 l, trypcase 4 g, soyase 1,2 g, agar 15 g.
- Préparation de la suspension de l’organisme test :
Prélever des cellules du microorganisme à l’œse et transférer ce prélèvement dans un tube
contenant 9 ml de diluant (solution de NaCl 0,9 %). Homogénéiser la suspension par agitation
mécanique pendant 3 min.
A l’aide du spectrophotomètre, ajuster la densité de l’inoculum à environ 108 cellules/ml
pour E. coli, sachant que dans le cas de cette bactérie, une absorbance à 600 nm égale à 1,
correspond à environ 6. 108 cellules/ml et
à environ 107 cellules/ml pour
C. albicans, sachant que pour cette levure, une A600 de 1 correspond à environ 2. 107
cellules/ml.
La suspension ainsi préparée doit être utilisée dans les 2 h qui suivent.
Déterminer le titre initial de la suspension par ensemencement en gélose. Dans ce but,
effectuer des dilutions en cascade au 10e jusqu’à 10-6. Des dépôts 10 µL des dilutions 10-3,
10-4, 10-5 et 10-6 sont effectués en double essai sur une gélose, selon le schéma fourni ci-après.
Chaque pipetage de 10 µL est pratiqué en pipetage inverse (cf. ci-après) pour éviter tout
15
risque de projection. En parallèle, on confirmera ce résultat par un ensemencement classique
par étalement de 0,1 mL des dilutions 10-4, 10-5 et 10-6 (1 seule boîte par dilution).
Incuber l’ensemble des boîtes 24 h à 30°C pour C. albicans ou 37°C pour E. coli, après avoir
laissé sécher les dépôts de 10 µL sur les boîtes.
- Ensemencement du produit à analyser :
20 ml ou 20 g de produit à analyser sont transvasés dans un flacon stérile vide, et ensemencé
avec la suspension calibrée de manière à obtenir une concentration de 106 cellules/ ml ou g de
produit cosmétique. Mélanger soigneusement. Incuber à 30°C à l’abri de la lumière.
- Prélèvements et dénombrements :
A chaque temps (en TP après 1,5 h), prélever 1 ml ou 1 g de produit analysé et les placer dans
9 ml de bouillon Lécithine-Polysorbate-Triton X. Après 30 min de contact à température
ambiante, effectuer des dilutions complémentaires jusqu’à 10-3 dans le diluant. Ensemencer en
gélose trypcase-soja ou Sabouraud en fonction du microorganisme test, 10 µL de chaque
dilution (2 dépôts de chaque dilution). Incuber pendant 24 h, à 30° ou 37°C en fonction du
microorganisme test.
- Expression des résultats :
Effectuer les différents dénombrements. Calculer la concentration initiale de cellules dans le
produit analysé, ainsi que les concentrations de cellules restantes aux différents temps.
Conclure sur la qualité de conception du produit analysé sachant que dans le cas des crèmes,
émulsions (incluant fonds de teint, produits solaires, dentifrices…), lotions, gels aqueux, une
réduction logarithmique de 2 et 3 est attendue à respectivement J2 et J7.
Dans le cadre du TP, le suivi permet de calculer le pourcentage de la population introduite qui
a été éliminée en l’espace de 1,5 heure. Ces résultats permettent également de tracer une
courbe de mortalité (Ln UFC/ml de produit en fonction du temps) pour déterminer le temps
nécessaire pour réduire de 90% la population microbienne inoculée dans le produit.
L’efficacité des agents de conservation présents dans le produit sur les deux microorganismes
pourra ainsi être comparée.
Annexes du Challenge test
Protocole de pipetage en mode inverse :
- Enfoncer le piston de la pipette jusqu’à la deuxième butée ;
- Aspirer ;
- Distribuer le volume désiré en enfonçant le piston jusqu’à la première butée, le
volume excédentaire reste dans le cône de la pipette.
Gabari pour le dépôt des gouttes :
16
ANALYSE D'UNE EAU
L'eau doit satisfaire à des critères bactériologiques qui sont différents selon son
utilisation. Par exemple :
aérobies
revivifiables
coliformes totaux
coliformes fécaux
streptocoques fécaux
ASSR
staphylocoques
vibrios
salmonelles
entérovirus
eau de forage
100/ml (20°C)
20/ml (37°C)
0/100 ml
0/100 ml
0/100 ml
1/20 ml
0/100 ml
abs.
0/5 l
0/10 l
eau de boisson traitée
100/ml (20°C)
20/ml (37°C)
0/100 ml
0/100 ml
0/100 ml
1/20 ml
0/100 ml
abs.
0/5 l
0/10 l
eau de piscine
100/ml( 37°C)
10/100ml
0/100 ml
20/ml
Matériel pour une analyse et mode opératoire :
- 1 poste de filtration
- 1 flacon ED stérile (rinçage)
- 4 membranes filtrantes de 0,45 µm
- éprouvette graduée stérile
- pipettes stériles (10 ml et 2 ml)
-1 galerie API 20E +1 tube 5ml eau stérile
+ réactifs *
- tubes à hémolyse *
- plasma de lapin (flacon) *
- bain-marie à 45°C
- bain-marie à 80°C
- gélose nutritive PCA (flacons)
- gélose blanche (flacons)
- gélose TTC Tergitol (2 petites boîtes)
- gélose Slanetz (1 petite boîte)
- bouillon de Litsky (1 tube) *
- gélose Chapman (1 boîte)
- bouillon cœur-cervelle (1 tube) *
- gélose VF complet (5 tubes)
- milieu TCBS (1 petite boîte) *
- eau peptonée alcaline conc. 2 fois (2 tubes)
- huile de paraffine
- gélose à l’ADN et au bleu de toluidine (1
tube) *
* matériel à utiliser ultérieurement
1- Dénombrement des bactéries aérobies revivifiables : faire régénérer la gélose
nutritive PCA ainsi que la gélose blanche, les maintenir à 45°C. Déposer 1 ml d'échantillon
par boîte et y couler ensuite le milieu. Après refroidissement, couler la gélose blanche sur la
surface de 2 des 4 boîtes. Incuber les 2 boîtes avec la 2ème couche à 20°C pendant 72 h, les 2
autres boîtes à 37°C, 24 h.
2- Dénombrement des bactéries témoins de contamination fécale :
- coliformes : filtration sur membrane de 100 ml de l'échantillon pour les eaux de
boisson ou de 10 ml d'une dilution au 1/10ème pour les eaux de piscine. Préparer deux
membranes et les déposer sur deux petites boîtes contenant du milieu TTC, la membrane doit
être disposée dans le sens de la filtration. Incuber une boîte à 37°C (coliformes totaux) et une
boîte à 44°C (coliformes fécaux) pendant 24 heures.
Rincer l'appareil entre chaque analyse avec de l'eau distillée stérile.
17
- streptocoques D : filtrer sur membrane 100 ml de l'échantillon. Déposer la membrane
sur une petite boîte de milieu de Slanetz. Incuber à 37°C pendant 24 et 48 heures.
- anaérobies sporulés sulfito-réducteurs (ASSR) : porter 25 ml d'eau à 80°C pendant
10 min (vérifier que le niveau de l’échantillon est bien inférieur à l’eau du bain-marie).
Ensemencer 5 tubes de gélose VF-complet, après régénération de la gélose, avec 4 ml par tube
d'échantillon traité. Homogénéiser doucement sans aérer. Recouvrir d’huile de paraffine
(environ 1 cm), puis incuber à 37°C. Lecture après 24 et 48 heures.
3 - Dénombrement des staphylocoques : filtrer 100 ml d'échantillon sur une membrane
et la déposer sur milieu de Chapman en boîte de Petri. Incuber 24 à 48 heures à 37°C.
4 - Recherche des vibrios : ensemencer deux tubes d'eau peptonée alcaline avec 5 ml
d'échantillon. Incuber 24 heures à 37°C.
Lecture et exploitation des résultats
- Dénombrements des différents groupes bactériens : exprimer les résultats selon les
critères.
- Observer et identifier une colonie de coliformes : à partir du milieu TTC incubé à
37°C, prélever une colonie caractéristique d’un coliforme, bien isolée. Réaliser son
identification par ensemencement d'une galerie d'identification miniaturisée (galerie API 20
E). En parallèle, à partir de la suspension bactérienne utilisée pour ensemencer la galerie,
réaliser un isolement pour vérifier la pureté de la suspension étudiée. Incuber à 37°C pendant
24 heures. Vérifier la pureté et lire les résultats de la galerie. Interpréter en fonction du tableau
API.
- Observer une colonie de streptocoques fécaux : Effectuer une coloration de Gram sur
les colonies suspectes et ensemencer un bouillon de Litsky s’il s’agit de coques Gram+.
- Staphylocoques : Effectuer un Gram sur les colonies suspectes présentes sur milieu
de Chapman. S’il s’agit de coques Gram+, ensemencer un bouillon cœur-cervelle pour
pouvoir effectuer une recherche de la coagulase et de la thermonucléase le lendemain (cf.
annexes).
- Vibrios : en cas de développement dans les tubes d'eau peptonée alcaline, effectuer
une observation au microscope après coloration de Gram et effectuer un isolement
(ensemencement en stries) sur une petite boîte de milieu TCBS si l’observation révèle la
présence de bâtonnets droit ou incurvé Gram-. Incuber à 37°C pendant 24 heures. Observer
les colonies qui se sont développées après 24 heures d'incubation. Dénombrer les colonies
caractéristiques.
18
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE D’UNE VIANDE
La chair d'un animal sain est pratiquement stérile. Chez un animal malade, il peut y
avoir une contamination directe par le système lymphatique. Les bactéries pathogènes de
l'animal sont souvent pathogènes pour l'homme. Toutefois, la plus grande contamination des
produits carnés est due à la manipulation au moment de l'abattage et lors de la distribution.
Des échantillons sont prélevés au moment de l'abattage dans le muscle, dans la rate, la
peau et les ganglions lymphatiques, en vue de contrôler la flore bactérienne originelle. Au
cours de la distribution, des échantillons sont prélevés pour le contrôle de la qualité
bactériologique (viandes emballées, viandes hachées...).
Analyse d’un échantillon de viande de distribution ou de viande hachée :
Matériel et mode opératoire
- pipettes stériles (1 ml)
- gélose nutritive PCA (flacons)
- 6 tubes d'eau peptonée tamponnée
- gélose blanche (flacons)
- 1 flacon de 100 ml avec 60 ml d'eau - gélose VRBL (coliformes, flacons)
peptonée tamponnée
- gélose TSC (ASR, 3 tubes)
- paraffine liquide
- solution stérile de D-cyclosérine à 4%
- bain-marie à 45°C
- bouillon lactosé bilié au vert brillant
(BLBVB, 6 tubes avec cloches de Durham)
- gélose Baird-Parker (3 boîtes)
- bouillon Rappaport-Vassiliadis (1 flacon de
125 ml avec 50 ml de bouillon)
- eau peptonée pour Mc Kenzie (6 tubes
max.)*
- bouillon cœur-cervelle (1 tube)*
- gélose Hektoen (2 grandes boîtes)*
* matériel à utiliser le lendemain le cas échéant
- Préparation de l'échantillon : introduire aseptiquement 15 g de viande dans un sac
stérile pour stomacher. Ajouter stérilement le volume d'eau peptonée tamponnée nécessaire
pour ajuster la dilution au 1/5. Fractionner la viande par passage au stomacher pendant 1 à 1
minute et demi. Laisser reposer pendant 15 minutes à température ambiante (revivification)
avant de réaliser les dilutions.
Réaliser des dilutions décimales à partir de la suspension mère jusqu'à 10-6 dans de
l’eau peptonée tamponnée.
1- Dénombrement des bactéries mésophiles : Ensemencer en gélose (gélose PCA)
-3
-4
-5
-6
dans la masse 1 ml des dilutions 10 ,10 ,10 et 10 . Après refroidissement, couler la gélose
blanche sur la surface des boîtes. Incuber les boîtes 24 heures à 30°C.
2- Dénombrement des coliformes fécaux : ensemencer dans la masse (gélose VRBL) 1
ml des dilutions 10-1 et 10-2. Ensemencer 1 boîte par dilution, après refroidissement couler
une 2ème couche de milieu. Incuber à 44°C pendant 24 h.
Ensemencer 6 tubes BLBVB (3 tubes avec la suspension mère et 3 tubes avec la
dilution 10-1) à raison de 1 ml par tube. Incuber à 44°C pendant 24 heures.
19
3- Dénombrement des staphylocoques : ensemencer par étalement en surface 3 boîtes
de gélose de Baird-Parker avec 0,1 ml de la suspension mère et des dilutions 10-1 et 10-2.
Incuber 24 heures à 37°C.
4- Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (ASR) : régénérer 3 tubes de
gélose TSC au bain-marie bouillant placer à 45°C. Ajouter 0,1 ml de solution de Dcyclosérine par tube et, ensemencer rapidement avec 1 ml de la suspension mère, de 10-1 et de
10-2. Homogénéiser immédiatement sans aérer. Refroidir sous courant d’eau et ajouter 1 cm
de paraffine liquide. Incuber à 46°C pendant 24 heures.
5- Recherche des salmonelles : introduire aseptiquement 50 ml de la suspension mère
dans un flacon de 100 ml contenant 50 ml de bouillon de Rappaport-Vassiliadis. Incuber 24
heures à 37°C.
Lecture et expression des résultats
- Effectuer les différents dénombrements.
- Identifier une colonie de coliforme sur VRBL en ensemençant une galerie API20E
(vérifiez, après ensemencement de la galerie, la pureté de votre suspension).
- dans le but de dénombrer les Escherichia coli (= coliforme fécal, indole +), réaliser
le test de Mc Kenzie (cf. fiche milieu p. 46) sur les BLBVB positifs : ensemencer un tube
d'eau peptonée exempte d’indole et incuber à 44°C pendant 24 heures. Rechercher ensuite la
production d'indole avec le réactif de Kovacs.
- Effectuer un isolement sur une boîte de gélose Hektoen à partir de l’enrichissement
en bouillon Rappaport-Vassiliadis pour la recherche des salmonelles. Exceptionnellement,
dans le cadre des TP, on effectuera un second isolement après avoir dilué l’enrichissement (1
mL de la culture d’enrichissement dans 9 mL d’eau physiologique). Après incubation, dans le
cas de colonies suspectes, ensemencer une galerie API 20E. En parallèle, vérifier la pureté de
la souche sur gélose ordinaire. S’il s’agit d’une salmonelle effectuer un sérotypage à partir de
la boîte ‘vérification de pureté’.
- Effectuer un Gram sur les colonies suspectes présentes sur milieu Baird-Parker. S’il
s’agit de coques Gram+, ensemencer un bouillon cœur-cervelle pour pouvoir effectuer une
recherche de la coagulase et de la thermonucléase le lendemain.
- Critères microbiologiques pour les viandes hachées :
Bactéries mésophiles totales
Coliformes fécaux
E. coli
ASR 46 °C
Staphylococcus aureus
Salmonelles
m
5. 105 /g
102 /g
50 /g
30 /g
102 /g
Absence dans 10 g
En complément des dispositions légales, d'autres critères peuvent être utilisés pour
estimer la qualité de conservation et l'état sanitaire de la viande :
- Indice I+S, recherche de la flore indologène et putride, responsable de mauvaises
qualités organoleptiques.
- Dosage de l'azote basique volatil total (ABVT). Il s'agit de l'ammoniac et des amines
volatiles, dont la quantité est directement liée au niveau de la dégradation protéique. Les bases
volatiles sont déplacées à l'aide d'une base faible, le carbonate de lithium qui n'hydrolyse ni
l'urée ni les protéines, et dosées par l'acide sulfurique en présence d'un indicateur coloré après
entraînement à la vapeur.
20
ANALYSE D'UN LAIT
Matériel et mode opératoire
- pipettes stériles (10 ml, 1 ml, Pasteur)
- 10 tubes stériles
- boîtes de Petri stériles
- bain-marie à 37°C
- étuve à 45°C
- étuve à 80°C*
- réactifs de Gram, bleu de méthylène,
réactifs pour la recherche de la peroxydase
et de la phosphatase
- 6 tubes de dilution (Tryptone-sel)
- gélose nutritive PCA au lait écrémé
(flacons)
- gélose VRBL (flacons)
- gélose Edwards modifiée (flacons)
- gélose D-coccosel (flacons)
- 1 flacon de bouillon LEB (Listeria)
- 1 flacon de 60 ml contenant 25 ml de
bouillon Sélénite-Cystine
- milieu de Baird-Parker (3 boîtes)
- disques de papier stériles
- milieu PALCAM (Listeria, 1 boîte) **
- 1 boîte de Petri en verre contenant du - milieu SS ou Hektoen (1 petite boîte)*
papier filtre stérile
- bouillon cœur-cervelle (tube)
- 2 tubes de 9 ml de Muller-Hinton
- cultures de G. stearothermophilus, et de - 1 tube Eppendorf stérile
B. subtilis
- 1 pipetman de 1000 et 1 cônes stériles
- 2 laits témoin, avec pénicilline ou - 1 ml de culture de L. lactis dans du lait
streptomycine (LTP et LTS) et sans - 1 flacon avec 70 ml de lait stérile
antibiotique (LT), en tubes
- 7 ml de solution de résazurine (0,005 %)
- 1 tube d’eau distillée stérile
- 5 tubes de diluant Ringer
* matériel à utiliser le lendemain
** boîte à ensemencer à partir du milieu LEB incubé 48 h.
Examens microscopiques
Ils ne seront pas effectués lors de la séance de TP.
Ces examens s'effectuent sur un culot de centrifugation d'un échantillon de lait cru :
- par coloration au bleu de méthylène (5 minutes environ) , lavage rapide à l'éthanol
60° et rinçage à l'eau distillée. Après séchage, on peut établir une formule leucocytaire
simplifiée : nombre de mononucléaires (m) / nombre de polynucléaires (p)
Le lait d'une vache saine présente un rapport m/p voisin de 1 ; en cas de mammite
aigüe, m/p est voisin de 0,5.
- par coloration de Gram. La flore bactérienne normale du lait cru est constituée de
bactéries Gram + (coques en diplocoques et en chaînettes, bacilles souvent en chaînes). Une
contamination externe se traduit par la présence de bacilles Gram-. Une mammite
streptococcique de la vache se traduit par la présence de longues chaînes de coques Gram+ .
21
Tests enzymatiques
- réductase : épreuve au bleu de méthylène. Introduire aseptiquement dans un tube à
essais stérile, 10 ml de lait. Ajouter à l'aide d'une pipette stérile 1 ml de la solution de bleu de
méthylène. Mélanger et incuber au bain marie à 37°C. Noter l'heure. Surveiller la coloration
du lait : décoloration du bleu de méthylène toutes les heures (six heures maximum).
- peroxydase : réaction de Dupouy. Introduire aseptiquement 2 ml de lait dans un tube
à essais. Ajouter 2 ml de la solution de gaïacol et deux gouttes d'eau oxygénée. Noter la
coloration (rose ou incolore). Une coloration rose témoigne de la présence d’une activité
peroxydase. La coloration peut apparaître lentement en 2 à 3 min.
- phosphatase : porter 4 ml de lait à ébullition (= lait témoin). Dans 2 tubes à essais,
introduire 2,5 ml de réactif. Placer les tubes au bain marie à 37°C pendant 2 minutes. Ajouter
aseptiquement à un tube, 0,5 ml du lait à analyser et à l'autre tube, 0,5 ml du lait témoin.
Mélanger et incuber à 37°C. Suivre l’apparition d’une coloration jaune, jusqu’à 2 heures,
coloration jaune due à l’activité phosphatase.
Recherche des antibiotiques dans le lait
- Principe : La technique utilisée est celle de la diffusion en gélose comme pour la
réalisation d’un antibiogramme.
Une souche sensible est ensemencée dans un milieu spécifique coulé en boîte de Petri.
Sur cette gélose, des disques imprégnés d'antibiotique ou de lait à examiner sont déposés.
Après incubation, une zone d'inhibition apparaît autour des disques contenant un antibiotique
en quantité suffisante pour être actif sur la souche.
- Organismes-tests :
Trois souches bactériennes sont utilisées :
- Geobacillus stearothermophilus variété calidolactis, souche C 953, pour la recherche
des pénicillines et tétracyclines ;
- Bacillus subtilis, souche ATCC 6633, pour la recherche des aminosides (ex :
streptomycine) et des macrolides (ex : erythropmycine) ;
- Bacillus megaterium, souche ATCC 9885, pour la recherche des sulfamides et du
chloramphénicol.
Dans le cadre du TP, la recherche de la présence de sulfamides et du chloramphénicol ne
seront pas effectuées.
- Préparation de laits témoins contenant un antibiotique :
- solutions mères :
- Pénicilline G. Benzyl pénicillinate de sodium à 100µg/ml dans de l'eau distillée stérile.
- Streptomycine sulfate, 1 mg/ml.
- Chloramphénicol, 1 mg/ml.
Ces solutions se conservent 2 semaines au maximum au réfrigérateur.
- laits témoins :
- ajouter 6 ml d'une dilution au 1/1000 de la solution mère de pénicilline à 94 ml de lait reconstitué
exempt d'antibiotiques, concentration finale 0,006 µg/ml équivalent à 0,01 UI.
- ajouter 5 ml d'une dilution au 1/100 de la solution mère de streptomycine à 95 ml de lait, concentration
finale 0,05 µg/ml.
- ajouter 2,5 ml d'une dilution au 1/10 de la solution mère de chloramphénicol à 97,5 ml de lait,
concentration finale 2,5 µg/ml.
22
- Mode opératoire :
- préparation des boîtes de Petri : Régénérer les tubes de Muller-Hinton au bain-marie
bouillant. Veiller à bien agiter les cultures avant de prélever. Ensemencer dans la masse avec 1 ou
2 mL de chaque culture en fonction de leur densité ou même que 1 mL d’une dilution au dixième
(en général, 2 mL pour G. stearothermophilus, et 1 mL dil 10-1 pour B. subtilis). Laisser prendre
en masse.
- préparation de l’échantillon de lait : agiter l’échantillon de lait à examiner de façon à bien
mélanger la crème avec le lait. Introduire 2 mL de lait dans un tube à essais stérile en prenant soin
de ne pas mouiller les parois du tube. Placer le tube dans un bain-marie réglé à 80 ± 0,5°C pendant
10 minutes, le niveau de lait étant au moins à 2 cm au dessous de l’eau. Refroidir à la température
ambiante.
- dépôt des disques : prélever au moyen d’une pince propre et sèche un disque de papier
filtre stérile de 5 mm de diamètre. Mettre en contact le bord du disque avec la surface du lait
jusqu’à ce que le disque soit complètement imprégné de lait. L’excès de lait est éliminé en
égouttant le disque contre la paroi du tube puis en déposant ensuite le disque sur une feuille de
papier filtre stérile. Le retourner une fois, puis à l’aide de la pince, le déposer à plat à la surface de
la gélose en pressant légèrement.
Déposer dans chaque boîte de Petri un disque imprégné de lait témoin sans antibiotique, un
disque de lait témoin avec antibiotique, un disque imprégné d’eau distillée stérile et un disque
imprégné de lait à analyser.
Incuber la boîte en position retournée, à 55 ou 30°C pendant 24 heures, et ce pour
respectivement G. stearothermophilus et B. subtilis.
Contrôle de la qualité bactériologique du lait
1- Réaliser une gamme de dilutions de 10 en 10 (1 ml dans 9 ml de diluant stérile, diluant
-6
Tryptone-sel) jusqu'à 10 .
2- Dénombrement des bactéries mésophiles totales : ensemencer dans la masse de gélose
-3
-4
-5
-6
nutritive (PCA + lait écrémé) 1 ml des dilutions 10 , 10 , 10 et 10 . Incuber à 30°C pendant 3
jours.
-1
-2
-3
3- Dénombrement des coliformes totaux : ensemencer 1 ml des dilutions 10 , 10 et 10
en gélose VRBL dans la masse. Ensemencer une boîte de chacune de ces trois dilutions. Incuber à
37°C pendant 24 heures.
4- Recherche des streptocoques :
→ Streptocoques β-hémolytiques : ensemencer en boîte dans la masse de gélose (milieu
-1
d’Edwards modifié) 1 ml de la dilution 10 . Incuber à 37°C pendant 24 heures.
→ Streptocoques fécaux (Enterocoques) - Recherche supplémentaire effectuée dans le cadre des
-1
TP : ensemencer en boîte dans la masse de gélose (milieu D-coccosel) 1 ml de la dilution 10 .
Incuber à 37°C pendant 24 heures.
5- Dénombrement des staphylocoques : ensemencer par étalement en surface, une boîte de
-1
-2
gélose de Baird-Parker avec 0,1 ml de lait et des dilutions 10 et 10 . Incuber 24 heures à 37°C.
6- Recherche des salmonelles : introduire aseptiquement 25 g de lait dans un flacon de 60
ml contenant 25 ml de bouillon au sélénite. Incuber 24 heures à 37°C.
7- Recherche des Listeria : effectuer un enrichissement à partir de 25 ml de lait introduits
dans un flacon de 500 ml contenant 225 ml de bouillon d'enrichissement LEB. Incuber 48 h à
30°C.
23
Recherche de bactériophages
- Principe : La technique utilisée, milieu lait-résazurine, est basée sur la non acidification
d’un lait par Lactococcus lactis lorsqu’il y a présence de bactériophages. L’indicateur d’oxydoréduction, résazurine, présente une coloration rose à l’état oxydée, et incolore à l’état réduit. Les
bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire et réduisent le milieu lors de leur croissance.
- Mode opératoire :
- préparation de l’échantillon de lait à analyser : centrifuger 1,5 ml de lait à analyser dans
un tube Eppendorf stérile pendant 8 min à 9000 t/min. Récupérer le surnageant à l’aide du
pipetman P1000 en prenant soin de ne pas remettre en suspension le culot. Effectuer des dilutions
du surnageant de lait (1 ml) dans 9 ml de solution de Ringer (NaCl 8,5 g/l, KCl 0,25 g/l, NaHCO3
0,2 g/l, CaCl2 0,3 g/l), et ce, jusqu’à 10-4.
- préparation du milieu lait-résazurine, et ensemencement : Ajouter 7 ml de résazurine
stérile (5 mg/100 ml) à 70 ml de lait stérile. Préparer un témoin sans bactérie en introduisant 9 ml
dans un tube vide stérile. Dans le mélange lait-résazurine restant, introduire 1 ml d’une culture de
Lactococcus lactis, homogénéiser et répartir ce mélange dans 5 tubes vides stériles à raison de 9
ml/tube.
- mise en évidence de bactériophages : Introduire 1 ml de chacune des dilutions de
surnageant de lait dans les tubes contenant le mélange lait-résazurine-souche. Préparer un témoin,
en introduisant 1 ml de solution de Ringer dans un tube contenant le lait-résazurine-souche.
Incuber l’ensemble des tubes, y compris le témoin sans bactérie, à 30°C pendant 24 h.
Lecture et expression des résultats
- réductase : observer la décoloration du bleu de méthylène. Le test est positif quand le
tube est décoloré au moins sur les 2/3 de la hauteur. Noter le temps correspondant.
Note
1
2
3
Appréciation
lait contaminé
lait peu contaminé
lait de bonne qualité
Temps de réduction
t < 2 h (1 h 30)
(1h30) 2h < t < 4 h (3h)
t > 4 h (3h)
nota : les temps indiqués correspondent à une température extérieure inférieure à 20°C, les temps entre
parenthèses correspondant à une température supérieure à 20°C.
- peroxydase et phosphatase :
activité
phosphatase
activité
peroxydase
-
-
Température
Stérilisation :
UHT (140°C - 2 s)
Classique (120°C - 20 mn)
100°C
---- ---------------------------
------------------- ----------------
Haute pasteurisation
75°C
(85°C - 2 mn)
---- --------------------------Basse pasteurisation
(63°C - 20 mn)
60°C
---- --------------------------Lait crû
24
------------------- ---------------+
------------------- ---------------+
+
- Antibiotiques : mesurer le diamètre de la zone d'inhibition autour des disques. Sont
considérés comme positifs, c'est à dire contenant des antibiotiques, les échantillons de lait donnant
une zone d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre. Le lait témoin contenant l'antibiotique doit
présenter une zone d'inhibition d'au moins 12 mm de diamètre.
- Bactériophages : noter après 24, la réduction de l’indicateur coloré (passage à l’incolore)
qui témoigne de l’absence de bactériophages.
- Qualité microbiologique :
- Effectuer les différents dénombrements.
- A partir d'une colonie de coliforme sur VRBL, ensemencer une galerie API20E et
vérifier la pureté.
- Dénombrement des colonies suspectes de Staphylocoques : à partir de colonies suspectes
de staphylocoques sur le milieu de Baird-Parker, effectuer un Gram et ensemencer un bouillon
coeur-cervelle pour la recherche de la staphylocoagulase et, dans le cas d’une coagulation peu
franche, rechercher ensuite la thermonucléase.
- Recherche des salmonelles : faire un isolement sur gélose SS ou Hektoen. Incuber 24 h à
37°C. En cas de colonies suspectes, effectuer une galerie API et vérifier la pureté de la suspension
utilisée sur une gélose ordinaire. Cette boîte permettra en outre d’effectuer, le cas échéant, un
sérotypage (le lendemain).
- Recherche des Listeria : après 48 h d’incubation, faire un isolement sur gélose PALCAM.
Incuber à 37°C pendant 24 heures.
- Critères microbiologiques pour le lait :
Microflore totale
Coliformes totaux
Coliformes fécaux
réductase
phosphatase
peroxydase
Bactéries indologènes
Staphylococcus aureus
Streptocoques β-hémolytiques
Clostridium sulfito-réducteurs
Listeria monocytogenes
Salmonelles
- : pas de critère
Lait crû
(destiné à la consommation
humaine)
< 5.104 /ml
Lait pasteurisé
conditionné
4
< 5.10 /ml
< 102/ml
< 102 /ml
< 1 /ml
Voir tableau d'interprétation
positive
négative
positive
positive
< 102 /ml
absence
absence dans 0,1 ml
absence dans 25 g
absence
absence dans 25 g
25
Lait pasteurisé pour
transformation
< 104 /ml
absence dans 1 ml
négative
positive
absence dans 1 ml
absence
absence dans 50 ml
absence dans 25 g
ANNEXES
Table de Mac Crady
Staphylocoagulase :
L’activité coagulase libre doit être recherchée à partir d’une culture de 24 h en milieu
non inhibiteur (bouillon cœur-cervelle). Un volume* de culture est alors mélangé dans un
tube à hémolyse à un volume de plasma de lapin oxalaté. Le tube est incubé à 37°C et observé
toutes les heures. La coagulation se manifeste par une prise en masse du plasma : le tube peut
être renversé sans problème. Si le résultat est négatif après 4 heures, laisser encore en
incubation pendant 24 heures.
* : 6 gouttes de pipette Pasteur suffisent.
Les tests de la coagulase libre et de la thermonucléase sont les 2 tests permettant de
différentier les espèces S. aureus et S. intermedius (espèces où se trouvent l’essentiel des
souches toxinogènes) des autres Staphylococcus. Le test de la coagulase a été retenu comme
test de confirmation dans les normes du contrôle qualité des aliments. Ces textes précisent que
« la réaction à la coagulase est positive quand le coagulum occupe plus de la moitié du
volume initialement occupé par le liquide ». En règle générale, S. aureus ou S. intermedius
donnent une réaction franchement positive (coagulum occupant tout le volume et souvent
adhérant au tube). Lorsque le coagulum n’est pas entier on peut conseiller de procéder à
des tests complémentaires comme la recherche de la thermonucléase.
Thermonucléase :
La thermonucléase, une endonucléase résistante aux températures élevées (15 min à
100°C), est caractéristique des souches de Staphylococcus aureus d’origine animale ou
humaine, mais elle est aussi présente chez d’autres espèces d’origine animale comme S.
hyicus et S. intermedius. De plus, on remarque que les souches de S. aureus possèdent
souvent une autre protéine thermorésistante, l’entérotoxine responsable d’intoxication
alimentaires.
26
La recherche de la thermonucléase est effectuée sur une fraction de culture en bouillon
cœur-cervelle, fraction qui a été placée au préalable 15 minutes dans un bain marie bouillant.
Méthode : Une goutte de culture refroidie est déposée dans une cupule creusée dans
une gélose à l’ADN et au bleu de toluidine (gélose à couler dans une petite boîte de Petri).
Remarque : les cupules sont formées en utilisant l’extrémité large (stérilisée) d’une pipette
Pasteur comme emporte-pièce.
La boîte est incubée au minimum 4 heures à 37°C, sans la retourner !!! Un halo rose (> 1 mm
autour du puits) à bords nets révèle la présence de DNase.
Un témoin positif sera réalisé par introduction dans une autre cupule d’une goutte de culture
de S. aureus, et un témoin négatif par introduction d’une goutte de culture de S. epidermidis.
Kit Pastorex Staph-Plus :
Lors d’un autocontrôle, des tests rapides de confirmation de colonies caractéristiques
sont parfois utilisés. Le Kit ‘Pastorex Staph-Plus’, par exemple, permet à partir de colonies
suspectes de S. aureus d’obtenir une réponse en quelques minutes. Dans le cadre des TP, ce
kit sera utilisé uniquement sur les souches de collection (S. aureus et S. epidermidis), souches
que vous aurez repiquées sur une gélose Chapman. En effet, la réalisation de ce test nécessite
plusieurs colonies de la même souche à étudier.
Fiche technique du fournisseur (BioRad) :
27
28
Sérotypage d'une salmonelle:
Les Salmonella sont les agents de gastro-entérites d'origine alimentaire. Salmonella typhi, paratyphi A et B sont
responsables de fièvres typhoïdes, paratyphoïdes A et B, formes les plus graves des salmonelloses.
L'identification précise des Salmonella est rendue nécessaire par leur importance en pathologie et la nécessité
de recherches épidémiologiques. L'étude des caractères biochimiques permet, dans un premier temps,
l'identification du genre Salmonella et de quelques sérovars particuliers. "en existe en fait plusieurs milliers,
toutes n'étant pas pathogènes pour "homme. Elles se différencient par leurs antigènes. Le sérotypage
consiste à individualiser une variété, le sérovar, en dressant sa carte antigénique.
Le sérotypage des Salmonella repose sur la recherche d'antigènes classiques des bacilles gram - :
- antigène 0 de paroi (de nature glucido-lipido-protéique)
- antigène H de flagelle (de nature protéique) pour les souches mobiles'
- antigène VI de micro-capsule,(de nature polyosidique) qui recouvre le plus souvent l'antigène 0
mais qui ne concerne que 3 sérotypes : Salmonella typhi, paratyphi C, et dublin.
Les antigènes recherchés sont communs à de nombreux autres bacilles gram -. L'identification biochimique
préalable de la souche à tester est obligatoire.
TechniQue;
i
La technique du sérotypage repose sur l'utilisation de sérums-mélanges permettant de réaliser une économie
financière et une gain de temps.
Il existe des sérums mélanges 0, baptisés OMA, OMS, OMC '" Les deux premiers (OMA et OMS) agglutinent
98 % des souches d'origine humaine. Leur composition est la suivante:
nom
:'J
OMA
OMB
OMC
OMD
OMF
OMG
anticorps des
grouDes .,.
antigènes 0
correspondants
ABDEL
C,F,GH
I,J K,L M N,O,P
a,RSTUVW
X,V 2,51,52,53
60,61,62,63,6566,67
1,2,34,591012,1921 46
67811 13 14 20 22 23 24
16 171828,303538
394041 4243,4445
4748,5051,5253
60 61,62,63,65,66,67
Une grande amélioration de l'efficacité du sérotypage est obtenue en hiérarchisant les recherches en fonction
de la fréquence des Salmonella isolées.
Bien entendu, des sérums monovalents 0 permettent d'affiner l'analyse.
29
Organigramme'
1
(
1
Souche de salmonella è Sérotyper identifiée biochimiquement
,
1
)
( Vérifier alla souche est autoaggkJtinable ou non
SI elle est autoagglutlnable, réaliser un nouvel Isolement et recommencer.
(
\.
, le glOl.p9 est A, B, D, E, ou L
Tester abrs dans rordre suivant
les sérums anti-O de d'laque
"""'Ii
anti 09
anti 01,2
(grot.peA)
"""'Ii
Tester éventuellement les
awes sérums-méJêrge ...
C,F,G.ouH
(gro~D)
(g1O~E)
"""'Ii
Tester abrs le sérum
anti-O du groupe le
pus fréquert :
arii 06,7,8
(groupeB)
anti 03,10,15
t
,
'"
J
OMA-etOMB­
1
le groupe est
gro~:
anti 04,5
OMB+
1
OMA+
t
"­
,
Tester l'agglutilatlon de la souche dans les Sérums-mélanges antl 0
et Tester ragglutination
avec le sénJm anti Vi
(~C)
\..
Vi~lF
ViFDSITF
..J
1
~
~
1
n
'J
, POUrsuMe obIi'Jaloirement par les sérums­
morovalents 0 COITespondants (si rldentificaOOn
est celle d'un sérotype ~ant rantgène v~
le rechercher ...)
p..is
les sérums anti H COO8SpOrICIanls (rnéIa-'ges.
moroYaIenIs de la phase 1 et 2 après éventuelle
nversbn de phase)
"""
'" ConclJre.
~
' V'érfler que la
sou:he est bien
lJ'l9 SatraleIa
Parmrnerœr
le sérotypage
' r
"""
et
kiœsserla
sou:heà
rlnstitlJ
\..P~
~
'Troisséràypes
possHes:
-S. typhi
- S. para1ypii C
-S.dlbin
Détruire par
chauffage 10 min.
à 100"C et recom­
meo::er le séroty­
page.
"'"
~
La commen:::ialisatbn par rlnstit1.A PasteIX des Sérums est imlée. leIX (X)l) est i'fllortari.
Dans t>l.te la me5l1"9 du possbIe, i est préférable d'a::lresser une souche isolée al Cerire
de référence des SahlonelIa à l'1nslhJl Past9lJ' RJe du Doc.teur FbJx 75015 PARIS.
le sur.; des 5ahloneIbses est ansi asslJ'é ailsi que les 19Chen::hes sur les sou::hes.
Mode opératoire .
SÉRUMS POUR AGGLUTINATION SUR
LAMES
Les sérums ne doivent pas être dilués.
• Déposer sur une lame propre une goutte de sérum.
• Mettre directement en suspension, dans cette goutte, la culture
bactérienne prélevée sur milieu gélosé (le plus humide possible
pour identifier les antigènes Hl. La suspension doit être bien homo­
gène. Agiter par un mouvement tournant pendant 1 minute au
maximum.
• Ure à l'œil nu au-dessus d'une surface sombre, ou, mieux, au­
dessus d'un miroir concave.
30
20100/20 160
api 20 E
01584 C • 0912000
~api20 E
01584 C ·0912000
Réactif Zn
10 g
Pour dIagnostIc ln vItro
Zinc en poudre
INFLAMMABLE
R15: Au contaclde l'eeu dégage des gaz trés
Systéme d'identification des Enterobacterlaceae et autres bacilles à Gram négatif
UTILISATION
API 20 E est un systéme pour l'Identlflcatlon des
Enterobacterlaceae et autres bacilles à Gram négatif non
fastidieux, utilisant 21 tests biochimiques standardisés et
miniaturisés, ainsi qu'une base de données. La liste
compléte des bactéries qu'II est possible d'Identifier avec
ce systéme est présente dans le Tableau d'Identification
en fin de notice.
PRINCIPE
La galerie API 20 E comporte 20 microtubes contenant
des substrats déshydratés. Les mlcrotubes sont Inoculés
avec une suspension bactérienne qui reconstitue les
milieux. Les réactions produlles pendant la période
d'incubation se traduisent par des virages colorés
spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.
La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de
Lecture et "Identification est obtenue à l'aide du
Catalogue Analytique ou d'un logiciel d'Identification.
REACTIFS
Innammsbles.
R17: Spljntsnément Innammable ê rslr.
5718 : Conssrver le récipient tHen fermé et è rabrl
Matériel de laboratoire nécassalra :
- Etuve (35-37'C)
- Réfrigérateur
• Bec Bunsen
• Crayon marqueur
de J'humldlté.
543 : En cas d'Incendie utiliser de la pljudre
contre Incendie provoqué per les métaux. "Ne
Jamels utiliser d'seu".
PRECAUTIONS
COMPOSITION DES MILIEUX ET REACTIFS
NaCI0,85%
Medium
5ml
Chlorure de sodium
Eau déminéralisée
8,5 g
1000 ml
ou
Suspanslon
Madlum
5ml
Eau déminéralisée
RéactlfTDA
5ml
Perchlorure de fer
H20
3,4 g
qsp 100 ml
Réactif JAMES Composant J 2183 (confidentiel) 0,5 g
qsp 100 ml
HCI1N
5ml
yeux.
En ces de contact avec les yeux, rincer
• 25 galeries API 20 E
- 25 boites d'incubation
- 25 fiches de résullats
- 1 barrette de fermeture
1 notice technique
En cas de contact avec le peau, laver avec du
savon et beaucoup d'eau.
Composition du coffret réf. 20160 (100 tests):
40g
100ml
CORROSIF
- 100 galeries API 20 E
- 100 boltes d'Incubation
- 100 fiches de résultats
1 barrette de fermeture
1 riotlce technique
R35: Provoque de graves brOlures.
52 : Conserver hors de portée des enfants.
526: En cas de contact avec les yeux, laver
Imm6dlatement et abondamment avec de reau el
consulter un spécialiste.
527 : Enlever Immédiatement tout vêtement
80Umé ou ,éclaboussé.
537/39: Porter des gants approprlés el un
Produits complémentaires non fournis
(' Produits disponibles chez bloMérleux •
consulter tarif ou bloMérieux pour leur référence) :
appareil de protection des yeux/du vissge.
RéactifVP 2
5ml
- NaCI 0,85 % Medium, 5 ml (') ou
Suspension Medium, 5 ml (')
- Kit réactifs (') ou
réactifs individuels: TDA
JAMES (')
VP 1 (')
VP2(')
NIT 1 (')
NIT2 (')
• Réactif Zn (')
- Oxydase (')
- Huile de paraffine
- Pipettes ou PSlpettes
- Catalogue Analytique API 20 E (') ou
logiciel d'Identification (')
- Protége-ampoules (')
• Portolr pour ampoules (')
a-naphtol
Ethanol
6g
100ml
FACILEMENT INFLAMMABLE
57: Conserver le rédplant blan farmé.
516: Consarverâ l'écart de touta source
d'IgnItion .. Ne pas fumer.
n
n
Hydroxyde de potassium
H20
Réactif NIT 1
5ml
Acide sulfanilique
Acide acétique
H20
0,4 g
30 g
70 ml
CORROSIF
R34 : Provoque des br(llufel.
52 : Conserver hors de portée des enfants.
523 : Ne pas respirer les vapeurs.
526 : En cas de contact avec les yeux., laver
n
Immédiatement et abondamment avec de
consulter un spécialiste.
Réactif NIT 2
5ml
Plus éventuellement les produits complémentaires
(non fournis) suivants:
n·:
- API OF Medium
Test pour la détermination du métabolisme fermentatif
et oxydatlf du glucose.
- API M Medium (') :
Test pour la détermination de la mobilité des bactéries
aéro-anaérobles.
bioMérieuxsa
N,N-dlméthyl-1-naphtylamlne
Acide acétique
H20
ree~
-
O
:?)"
immédiatement avec beaucoup d'eau au maint
pendant 10 minutes.
Réactii'VP 1
5ml
fi
::j
524125 : Eviter le contact avec la peau et les
Composition du coffret réf. 20 100 (25 tasts):
• Destiné au diagnostic in vitro seulement.
• Ne pas pipeter à la bouche les prélévements et les
réactifs.
• Eviter le contact des réactifs avec la peau. les yeux et
les vêtements.
• Ne pas employer les réactifs aprés la date d'expiration.
• Aprés la sortie du réfrigérateur, laisser les réactifs
revenir à la température ambiante (20·30'C) avant
emploi.
• Ouvrir les ampoules délicatement comme suit:
Placer l'ampoule dans le protége-ampoules.
/;//
• Tenir l'ensemble verticalement dans une
't
main (bouchon blanc vers le haut).
!
. Bien enfoncer le bouchon.
! ~
- Recouvrir la partie Inclinée du bouchon avec
la premlére phalange du pouce.
- Exercer une pression avec le pouce à la
base de la partie inclinée du bouchon avec
un mouvement vers l'extérieur de façon à
casser l'extrémité de l'ampoule à l'Intérieur
du bouchon.
• Retirer l'ampoule du protége-ampoules et
conserver le protége-ampoules pour une
utilisation ultérieure.
, Ampoule sans bouchon compte-gouttes:
• Enlever délicatement le bouchon.
, Ampoule avec bouchon compta-gouttes:
• Renverser l'ampoule et la maintenir en
posllion verticale.
- Appliquer une pression latérale sur le
bouchon pour laisser échapper une goutte
de réactif (kit API 20 E réactifs) ou ·pour
transférer la totalité du réactif dans le fiacon
compte-gouttes (autres réactifs).
NOTE: le fait d'appuyer sur le bouchon avant
de renverser l'ampoule permet d'aspirer tout
excés de réactif et évite de le répandre à
l'extérieur du bouchon.
• Tous les produits inoculés doivent être considérés
"comme potentiellement infectieux et manipulés de façon
appropriée.
• Les prélévements. et cultures bactériennes doivent être
considérés comme potentiellement infectieux et doivent
être manipulés de façon appropriée par un personnel
compétent et averti. Les techniques aseptiques et les
précautions usuelles de manlpuiatlon pour le groupe
bactérien étudié doivent être respectées tout au long de
la manipulation; se référer à "NCCLS M29-A, Protection
of Laboratory Workers lrom Instrument Biohazards and
Infectious Disease Transmitted by Biood, Body Fluids,
and Tissue; Approved Guideline - December 1997".
Pour informations complémentaires sur lès précautions
de manipulation, se référer à "Blosafety in Micro­
biologlcal and Biomedical Laboratories, HHS Publication
No. (CDC) 93-8395, 3rd Edition (May 1993)," ou à la
réglementation en vigueur dans le pays d'utilisation.
et
0,6 g
30g
70 ml
CORROSiF
R34 : ProvOque des brOlures.
52 : Conserver hors de portée des enfants.
523: Ne pas respirer les vapeurs.
526 : En ces de contact avec las yeux, laver
immédIatement at abondamment avec de reau et
consulter un spécialiste.
~O
• A la fin du test, aprés lecture et interprétation, tous les
prélévements. souillures et produits Inoculés (ampoules,
bottes, pipettes et galeries) doivent être autoclavés,
incinérés ou Immergés dans un désinfectant germicide
avant élimination.
• Les performances présentées sont obtenues avec la
méthodologie indiquée dans cette notice. Toute dé­
viation de méthodologie peut altérer les résultats.
• L'interprétation des résultats du test doit être faite par un
microbiologiste compétent qui prendra en considération
le contexte clinique, l'origine du prélévement, les
aspects macro et microscopiques et éventuellement les
résullats d'autres tests, en particulier l'antibiogramme.
CONSERVATION DES GALERIES
Les galeries sont présentes dans une poche en
aluminium avec sachets déshydratants.
Aprés ouverture de celie-ci ('), conserver les galeries
restantes avec les déshydratants en refermant la poche à
l'aide de la barrette de fermeture (présente dans le
coffret): placer l'extrémité de la poche entre les deux
piéces de la barrette et les clamper soigneusement, à
fond, sur toute leur longueur. Les galeries peuvent ainsi
être conservées 10 mols aprés ouverture de la poche,
à 2-8'C (ou Jusqu'à la date limite d'utilisation indiquée sur
l'emballage, si celle-ci est antérieure).
(') RecommandatIon pour l'ouverture de celle-cl: couper
Juste en dessous de la soudure, en maintenant la poche
droite, pour éviter d'endommager les sachets déshydra­
tants.
CONSERVATION DES REACTIFS
Les réactifs doivent être conservés à l'obscurité à 2-8'C
(sauf TDA, VP 1 et NIT 1 qui peuvent être conservés à
2-30'C et Zn à 8-30'C) jusqu'à la date limite d'utilisation
indiquée sur l'emballage.
Aprés ouverture des ampoules (et transfert des réactifs
dans les flacons compte·gouttes), les réactifs peuvent
être conservés 1 mois (bU Jusqu'à la date limite
d'utilisation si celle-cl est antérieure): noter la date
d'ouverture sur l'étiquette des flacons ou des ampoules.
"Le réactif JAMES est trés sensible à la lumlére : entourer
le flacon d'une feuille d'aluminium et ne sortir ie réectlf du
réfrigérateur que le temps nécessaire à son utilisation.
Veiller à ne pas le laisser longtemps sur la palliasse.
UTILISATION DES REACTIFS
Laisser les réactifs revenir à la température ambiante
(20-30'C) avant emploi.
1. Kit API 20 E réactifs:
• Ouvrir les ampoules de réactifs comme indiqué au
paragraphe "Précautions" (ampoule avec bouchon
compte-gouttes).
.
2. Réactifs TDA, VP 1, VP 2, NIT 1, NIT 2 :
• Ouvrir les ampoules de réactifs et effectuer le transfert
comme indiqué au paragraphe "Précautions" (ampoule
avec bouchon compie-gouttes).
• Délivrer une goutte de réactif.
• Bien refermer le flacon aprés usage et" le conserver
comme indiqué au paragraphe "Conservation des
réactifs".
....
Français. 1
Français - 2
bioMérieux sa
api 20 E
3, Réactif JAMES:
o Ouvrir l'ampoule de solvant associée au réactif JAMES
comme indiqué au paragraphe "Précautions" (ampoule
sans bouchon compte-gouttes).
o Prélever le contenu de l'ampoule à l'aide d'une pipette
trés séche et transférer ce solvant dans le flacon
compte·gouttes (contient le principe actif désséché).
o Adapter l'embout compte-gouttes.
o Bien refermer le flacon,
o Agiter.
o Attendre 5-10 minutes pour une dissolution complète du
principe actif.
o Utiliser le réactif ainsi reconstitué et bien refermer le
fiacon aprés usage et le conserver comme indiqué au
paragraphe "Conservation des réactifs".
4. Réactif Zn :
o
o
o
Ouvrir le flacon.
Prélever un aliquot de poudre (de l'ordre de 2 à 3 mg) à
l'aide de la spatule du bouchon et déposer cette
quantité dans la cupule réactionnelle.
Bien refermer le flacon aprés usage et le conserver
comme indiqué au paragraphe "Conservation des
réactifs".
5. Test Oxydase:
o
o
Réaliser le test selon' les instructions d'utilisation du
fabricant.
Noter le résultat sur la fiche de résultats.
NOTE: Le test oxydase doit étre réalisé car il constitue le
21· m• test de l'identification.
MODE OPERATOIRE
Traitement des prélèvements
A j'aide d'une pipette ou d'une PSlpelte, prélever une
seule colonie bien isolée sur milieu gélosé.
o Réaliser
une suspension bactérienne en homo­
généisent soigneusement les bactéries dans le milieu.
NOTE: la plupart des espéces de Vibr/o sont halophiles.
En cas de suspicion d'un Vibr/o, réaliser la suspension
bactérienne dans NaCI O,S5 % Medium.
Préparation de la galerie
o Réunir fond et couvercle d'une boite d'incubation et
répartir environ 5 ml d'eau distillée ou déminéralisée [ou
toute eau sans additif ou dérivés susceptibles de libérer
des gaz (Ex: CI2, C02 ...)] dans les alvéoles pour créer
.une atmosphére humide.
o Inscrire la référence de la souche sur la languette
latérale de la boite. (Ne pas inscrire la référence sur le
couvercle. celui-ci pouvant être déplacé lors de !a
manipulation.)
o Sortir la galerie de son emballage.
o Placer la galerie dans la boite d'incubation.
NOTE: API 20 E doit étre utilisé avec des bacilles à
Gram négatif non fastidieux. Les microorganismes
fastidieux, exigeants et nécessitant des précautions de
manipulation particuliéres (ex. Brucella et Franc/sella)
ne font pas partie de la base de données API 20 E.
Il convient d'utiliser d'autres techniques pour exclure ou
confirmer leur présence.
Préparation de l'inoculum
Ouvrir une ampoule de NaCI 0,S5 % Medium (5 ml) ou
'une ampoule de Suspension Medium (5 ml) comme
indiqué au paragraphe "Précautions" (ampoule sans
bouchon compte-gouttes) ou utiliser un tube contenant
5 ml d'eau physiologique stérile ou d'eau distillée stérile,
sans additif.
o
o
Inoculation de la galerie
l.9IJ ,l.YEJ
Remplir tubes et cupules des tests
et 1GELI
avec la suspension bactérienne en utilisant la pipette
ayant servi au prélévement.
o Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des
autres tests.
o Créer une anaérobiose dans les tests ADH, LOC, QQQ,
H2S, URE en remplissant leur cupule d'huile de
paraffine.
o Refermer la boite d'incubation.
o Incuber à 35-37'C pendant 1S-24 heures.
• Incubation pendant le week·end: La lecture des
réactions biochimiques de la galerie API 20 E doit se
faire aprés 1S-24 heures d'incubation. En cas
d'impossibilité de lecture aprés 24 heures d'incubation a
35-37'C (ex. incubation pendant le week-end), il est
fortement recommandé de retirer les galeries de l'étuve
et' de les conserver à 2-S'C (réfrigérateur) jusqu'au
moment où les réactions peuvent être lues.
o
Lecture de la galerie
o Aprés 1S-24 h à 35-37'C, la lecture de la galerie doit se
faire en se référant au Tabieau de Lecture.
o Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions
spontanées.
'
o
API 20 E ne doit pas être utilisé directement à partir des
prélèvements d'origine clinique ou autre.
Les microorganismes à identifier doivent dans un premier
temps être isolés sur un milieu de culture adapté à la
culture des bacilles à Gram négatif non fastidieux
(ex. MacConkey) selon les techniques usuelles de
bactériologie.
o
api 20 E
07584 C - 0912000
Si 3 tests ou plus (test GLU + ou -) sont positifs, enre­
gistrer la lecture du test GLU puis révéler les tests
nécessitant l'addition de réactifs:
- Test TDA: ajouter 1 goutte de réactif TDA. Une
couleur marron.rougeâtre indique une réaction
positive à noter sur la fiche de résultats.
• Test IND: ajouter 1 goutte de réactif JAMES. Une
couleur rose diffusant dans toute la cupule indique
une réaction positive à noter sur la fiche de résultats.
- Test VP : ajouter 1 goutte des réactifs VP 1 et VP 2.
Attendre au minimum 10 minutes. Une couleur rose
ou rouge indique une réaction positive à noter sur ia
fiche de résultats. ,Une faible coloration rose
apparaissant aprés 10 minutes doit être considérée
négative.
'
- Test N02 : ajouter 1 goutte des réactifs NIT 1 et NIT 2
dans 'e tube GLU. Attendre 2
5 minutes. Une
coloration rouge indique une réaction positive. Une
réaction négative (coloration jaune) peut être due a la
production d'azote (éventuellement signalée par ia
présence de microbulles) : ajouter 2 à '3 mg de réactif
Zn dans la cupule GLU. Aprés 5 minutes, un tube
resté Jaune indique une réaction (N2) positive à noter
sur la fiche de résultats. Si la cupule est orange·
rouge, la réaction est négative, les nitrates encore
présents dans le tube ont été réduits en nitrites par le
Zinc.
Cette réaction est intéressante pour les bacilles
Gram négatif oxydase positive.
a
a
NOTE: Les tests de réduction des nitrates et de la
production d'indole doivent étre réalisés en dernier, car
ces réactions Iibérent des gaz qui risquent d'altérer
l'interprétation d'autres tests de la galerie, Ne' pas
remettre le couvercle d'incubation aprés l'ajout de ces
réactifs.
bioMerieux 50:
Français - 3
07584 C - 0912000
Si le nombre de tests positifs (y comprls le test GLU) est
inférieur à 3, ne pas ajouter les réactifs:
• Inoculer 2 ampoules d'API OF Medium pour vérifier le
métabolisme du glucose,
- Ensemencer un milieu de MacConkey,
• Vérlfier la mobilité: Inoculer 1 ampoule d'API
M Medium ou observer entre lame et lamelle au
microscope.
- Incuber la galerie 24 heures de plus.
• Ajouter les réactifs comme indiqué précédemment.
- Noter les réactions de la galerie et les résultats des
tests complémentaires sur la fiche de résultats en se
référant au Tableau de Lecture.
Identification
L'identification est obtenue à partir du profil numérique.
o Détermination du profil numérique:
Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par
groupes de trois et une valeur 1, 2 ou 4 est indiquée
pour chacun. La galerie API 20 E comportant 20 tests,
en additionnant à l'intérieur de chaque groupe les
valeurs correspondant à des réactions positives, on
obtient 7 chiffres; la réaction de l'oxydase qui constitue
le 21- test est affectée de la valeur 4 lorsqu'elle est
positive.
o
Identification:
Elle est réalisée
• à l'aide du Catalogue Analytique:
• Rechercher le profil numérique dans la liste des
profils.
• à l'aide du logiciei d'identification:
• Entrer manuellement au clavier le profil numérique à
7 chiffres.
Par ailleurs dans certains cas, le profil à 7 chiffres étant
insuffisamment discriminant, les tests complémentaires
suivants sont nécessaires:
- Réduction des nitrates en nitrites (N02)
- Réduction des nitrates en azote (N2)
- Mobilité (MOS)
- Culture sur gélose de MacConkey (McC)
- Oxydation du glucose (OF-O)
• Fermentation du glucose (OF·F)
Ces tests complémentaires, mentionnés dans le
Catalogue Analytique, peuvent être utilisés pour
constituer un profil à 9 chiffres, identifiable avec le logiciel
d'Identification.
~p~;ik.~;J
5315173 (57) Enterobecter gergovlee
CONTROLE DE QUALITE
Les milieux, galerles et réactifs font l'objet de contrOles de qualité systématiques aux différentes étapes de leur fabrica­
tion. Un contrOle bactériologique des tests de la galerie est de plus réalisable au lab
- ,-- ---_.,-- --,._"-- .....
ONPG i'>l2!::I bQÇ QQQ l.mJ H,S
GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA N03·
I!.!.B.É. TDA IND
+
1.
V
V
+
- - +
2.
+
+
+
+
+
+
+
+
+'
+
+
+
+
3,
+
+
V
+
+
+
V
V
+
4.
+
+
+
V
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5. _ +
+
+
+
+
+
-
- -
- - - -
llœJ
- - - - -
u.w
-
- -
- - - + +
- - - -
-
+
+
+
ATCC 51331
(4) K/ebs/ella pneumonlee ssp pneumoniee
ATCC 35657
ATCC 13047
(5) Escher/chie coll
ATCC 25922
ATCC 35659
ATCC ,: Amerlcan Typa Culture Collection, 10801 University Boulevard, Menassas, VA 20110-2209, USA.
• Le stada N2 (+) peut être observé pour la souche ATCC 13047.
o Profil obtenu après 24-48 H d'incubatlon pour la souche ATCC 51331, é partir de colonies cultivées sur 9élose Trypcase Soja + san9.
o Profils obtenus après 18-24 H d'Incubation pour les autres souches, é pertlr de colonies cultivées sur gélo.e Trypcase Soja + sang.
o Suspension bactérlenna préparée en NaCI 0.85 % Medium.
(1) Stenotrophomonas mallophilia
(2) Enterobaetercloacee
(3) Proteus mirabilis
LIMITATIONS
VALEURS ATTENDUES
". Le systéme API 20 E est destiné à l'identification des
bacilles à Gram négatif non fastidieux présents dans la
base de données (voir Tableau d'Identification en fin de
notice) et à eux seuls. Il ne peut être utilisé pour Identi­
fier d'autres microorganismes ou exclure leur présence.
o Des
discordances par rapport aux techniques
conventionnelles peuvent être observées dues aux
différences de principe des réactions utilisées en
technique API. Des écarts de pourcentages peuvent
également être observés qui s'expliquent par des
, variations de substrat.
o Pour certaines espéces (ex. Klebs/ella ou Proteus), des
réactions du test glucose initialement positives peuvent
parfois devenir négatives (apparltion d'une coloration
bleu-vert). Dans ce cas, cette réection doit être
considérée comme négative, Les pourcentages indIqués
dans le Tableau d'Identification prennent en compte ce
genre de phénoméne.
o Dans le cas d'identification à Saimonella ou Shigella,
' une identification sérologique doit être effectuée pour
confirmer l'identification bactérienne.
o Seules des cultures pures contenant un seul type de
microorganisme doivent être utilisées.
Français - 4
Se référer au Tableau d'Identification en fin de celle
notice pour les valeurs attendues des différentes
réactions biochimiques.
PERFORMANCES
7900 souches cliniques et souches de collection
appartenant aux espéces de la base de données ont été
testées:
- 92,05 % des souches ont été correctement identifiées
(tests complémentaires nécessaires pour 46,57 % des
souches).
- 5,OS % des souches n'ont pas été Identifiées,
- 2,87 % des souches ont été mal identifiées.
bioMéricux sa
METHODOLOGIE
TABLEAU D'IDENTIFICATION
BIBLIOGRAPHIE
p. 1
p. Il
p, IV
METHODOLOGIE / PROCEDURE 1METHODIK 1TECNICA 1 PROCEDIMENTO
TABLêAU DE LECTURE
RESULTATS
TESTS
SUBSTRATS
OX
ortho-nltro-phényl-~D-gal-
actopyranoslde (ONPG)
ONPG
~
~
1 colonie / 1 colony / 1 Kolonie /
1 colonia / 1 col6nia
NaC\ 0.85 % Medium 5 ml /
Suspension Medium 5 ml
~
18888888888 88888888881
api 20 E
~
f'»1
~
18:00-24:00/48:00
1,9mg
arglnlne dlhydrolasa
jauna
rouge / orangé (2)
1,9mg
lysine décarboxylase
jaune
rouge/ orangé (2)
QQÇ
omlthlne
1,9mg
omlthlne décarboxylese
Jaune
rouge / orangé (2)
lQrJ
citrate de sodium
0,83 mg utilisation du citrate
vert pâle / Jaune
bleu-vert / bleu (3)
lM
thlosulfate de sodium
76,0 ~g production d'H2S
incolore / grisâtre
dépot noir / fin liseré
~
urée
0,76 mg uréase
jaune
rouge / orangé (2)
TDA / Immédiat
TDA
~
tryptophane
6
~
.-.L.l
---
........cl
IND
-1 CIT 1
tryptophane
-1 GEL 1
ADH-+ODC
H2S - URE­
lYEJ
créatine
pyruvate de sodium
1,9mg
[Q§J
gélatine de Kohn
0,17 mg gélatinase
-~
Incolore
TDA
TDA
IND
JAMES (IND)
VP
VP 1'" VP 2
GLU (N02) NIT 1 ... NIT 2 ("'Zn)
rose
vart pâle / Jaune
0,38 mg
production d'acétoTne
Incolore
rose / rouge (5)
non diffusion
diffusIon du pigment noir
GLU
giucose
1,9 mg
fermenlatlon / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
jaune 1jaune gris
MAN
mannitol
1,9 mg
fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
jaune
INO
inosttol
1,9 mg
fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
jaune
SOR
sorbitol
1,9mg
fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
Jaune
RHA
rhamnose
1,9mg
fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
Jaune
SAC
saccharose
1,9mg
fermentetlon / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
jaune
MEL
mellblose
1,9mg
fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
jaune
AWfY
amygdatlne
0,57 mg fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
Jaune
ARA
arabinose
fermentation / oxydation (4)
bleu / bleu-vert
Jaune
1,9mg
. (voir notice du test oxydase)
Réduction
des
nitrates
MOS
cytochrome-oxydase
(voir notice du test oxydase)
NIT 1 + NIT 2 / 2-5 min
production de N02
nitrate de potassium
76,0 ~g
tube GLU
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
~~
0,19 mg production d'indole
- LYE.J
01'-0
-- -III
marron.rougeàtre
jaune
YP 1 +YP2/10mln
~
~
0,38 mg tryptophane désaminasa
JAMES {Immédiat
OF-F
-~
Jaune (1)
lysine
McC
--_.
beta-galactosldese
arglnlne
OX
~
Incolore
0,23 mg
J.QÇ
api 20 E
+ • + - + -
POSITIF
6Q!:l
1~~~~~~~~iiI~ ~~~~~~~~~~I
api 20 E
NEGATIF
7,6 ~g
~
I~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~I
REACTIONS/ENZYMES
'oopropytthlogalacto­
pyranoslde (IPTG)
37°C
~
Tests G) < 3
(y compris J includlng /
einschlief.\lich / incluldo J
compreso / incluindo GLU)
OTE
réduction au stade N2
API M Medium ou
rouge
Jaune
orange rouge
b!l1. ~
jaune
microscope
mobilité
immobile
mobile
milieu de MacConkey
culture
glucose (API OF Medium)
absence
présence
fermentation: sous huile
vert
Jaune
oxydation ~ é l'air
vert
Jaune
Une trés légére couleur Jaune est également positive..
Une couleur orange apparaissant aprés 36-48 H d'Incubation doit êtra considérée négative.
Leclure dans la cupule (zone aérobie).
la fermentation commence dans la partie inférieure des tubes, roxydation commence dans la cupule.
Una légére coloration rose apparaissant aprés 10 minute. doit être lue négative.
-
bioMérieux
Produit enregistré à l'Agence Frençaise de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé
Fabrtcant: bloMérleux sa
bloMérleux sa
bloMérleux, Inc.
au capital de 77 421 420 F
595 Anglum Road, Hazelwood,
673 620 399 RCS LYON
Missouri 63042-2320 / USA
69280 Marcy-rEtoiie J France
tel. (1) 314.7318500/ fax (1) 314.7318700
tél. (33) 04 78 87 20 001 fax (33) 04 78 87 2090
h t t p : / / w Y f f l . b t o m e r l e u x . c o m l m p r i m é en France
api®20 E TM
__.•_---------_.._---_ _ - - ­
._-_._---------_._._--.
...
07584J - xl- 2010105
TABLEAU D'IDENTIFICATION 1IDENTIFICATION TABLE 1PROZENTTABELLE 1 TABLA DE IDENTIFICACION 1TABELLA DIIDENTIFICAZIONE 1QUADRO DE IDENTIFICAÇÂO
ntNAKAE TAYTOnOIHEHE IIDENTIFIKATIONSTABEL IIDENTIFlEHINGSTABELL 1TABELA IDENTYFIKACYJNA
% de rêactions positives après 18-24" 48 h à 36"C ± 2"[; / '1c, of positive reacti0l15 after 18-24/43 tirs at 36"C i 2"C 1 % der positiven Reaktioncn nach 18-24/48 h bei 36"C ± 2"C 1
% de las reaCClones positivas después de 18-24/48 H a 36"C ± 2°C! % dl reazioni positive dopa 18-24 148 ore a 36"C ± 2°Ç 1 o,.{, de reacç6es positivas ap6s 18-24/48 h a 36° C ± 2° C 1
% 8nrKwv avrriSpdaEwv IJE:TO orré 18-24/48 WPEÇ arouç 36~C ± 2"C 1 % positl'Ja reaktioner efter 18-24 148 timmar vid 36"C ± 2"C 1 % af positive reaktioner eHer 18-24/48 timer ved 36°C ± 2"Ç 1
% Poz.ytywnych reakcji po 18-24/48 godz:inach w
V4.1
API 20 E
Bufliaux.eJla resfis
Cedeœa davisae
Cedecea la a ei
Cilrowcfer braakii
Cilrobader freundii
Cilrobacler koserilamafonaliws
Citrobader koseriffarmeri
Citrobacler n Be
Edwardsiella hoshinae
Edwardsiella larda
Enterobacfer aer nes
Enlerobacler (lmnÎ nus 1
En/erobacler amnÎ enus 2
Enlerobacler asburiae
EnferobilCfer cancer nus
Enlerobacler doecae
Enlerobacléf ~ m'Îae
Enlerobader inlennèdius
Enlerobader sakazak.Îi
fscherichià,ro!i1
Escherichfa roll 2
Escherichia (e usonÎÎ
Eschelichla hemianmï
Esc/lerichia vu/neris
Ewin lIa ameticana
Ha(niaalvei 1
Hafnia alvei 2
K!ebsieJla ox 0C8
KlebsieJla neumoniae ss ozaenae
Klebsiel/a neumoniae ss neumoniiJe
K!ebsiella neim-loniae ssp mmoscleromMis
KJ 81as
Lec/ercia adecarbo afa
Moellerefla wisconsensis
Mo enella mor anii
Panloeas 1
Panloeas 2
Panloeas 3
Panloea s 4
Pro/eus mirahilis
Pro/eU$ onen
Pro/eus vulqads fOU
ProvirJencia alca/iftJciensirusli ianÎÎ
Pl{widencia refl ri
Providenda sluMii
Rahnelfa a ualilis
Raouf/effa omifhino ica
Raoul/ef/a lerri ena
Salmonella choI8Iae.suis 5S an-zO/l8e
Sa/Oléine/la cho!eraesw·s ss choleraesuÎs
Salmonella S'er.Gal/inarum
URJ.;.
IDA
-:-";';'-t~~-t--";;o-'--t~o·
a
G
[ND
VP
0
0
--
GLU
-MAN
0
O·
0
-10
-0-"
a
000
-1
± zoe
"RHt\ &l\C
3G~C
INQ' SOH
4
1--- 00 ........
1
---;;---+--;;--,
o
api® 20 E TP.1
07584J - xl- 2010/05
e
API 20
V4.1
Salmonella ser.Parat li A
Salmonella serPu/forum
Salmonella hi
$afmonena s p
Serrafia ocaria
Serraliafon!iro/a
Serralia li ue(ac;ens
Serralia marcescens
SerrafiaOOorifera1
Serratia odori{efJ 2
SeiTalia 1 uthica
Sena/ia rubii1aea
Sh· e!/aSDHnei
Yersifiia enterocolilica
Yersiliia frederiksèrTiVintermefiiil
Yersinia krislensenii
Yersinia sUs
YefSinia eudolubercvfosis
Aeromonas h 'dro IIÎfa r. 1
Aeromonas h
hi/a r. 2
Aeromonrn sa/moojcida 55 safmonicide
Grimonfia hŒ!isae
PholobfJdéfium damselae
P/esiomonas sh' /lo!des
Vibrioa i
iws
VibriochOleroe
Vibrioflwialis
VibtiomimÎCus
Viboo arahaemol icus
Vibtio vùlnificiis
. Pasleurella ae enes
Pâsfeurel/a mu/focia"a f
Pasleurelia mull"dda 2
PasleurelJa f100m
~ Mannheimia Men:
Acinelobac1er b3umannJiJcafcœcelicus
BorrJelellarAlca!i enesflJoraxelJa sp ~
Burkhol(/eria cepaCia
Chromobaclerium vio/aceum
C/I
obadenum indot nes
Ch eobai:lerium menin se -ieum
EikMei/a cixrcxJens
M 'rksJChl seobaclerium indol
üchrobàclrum ar.YI(Q i
PseLidomonas aeru inosa
PseiKfotnonas nuolesœnsl. u!.ida
Pseudomonas lufeola
PseMomonas 0 "habifans,
Norrfermenter s
Shewanella ulrefadens fOU
Steoolr flOmonas mal/a ilia
• Brucelfa spp possible 1 mbglich 1 posible 1 possibHe 1 possivel/1Tl8avov 1 mojHg 1 mulig 1 MozliwoM.
bioMérieux SA
34
III
Interprétation des résultats en fonction des normes
Plan à trois classes - plan à deux classes
ABSENCE
PRÉSENCE
SATISFAISANT
NON
SATISFAISANT
Avec:
ID :
critère fixé par arrêté (du 21 décembre 1979) ;
n : le nombre d'unités composant l'échantillon;
c: nombre d'unités défectueuses de l'échantillon donnant des valeurs supérieures à 3m lors
d'un dénombrement ep. milieu solide, ou 10m lors d'un dénombrement en milieu liquide;
M : seuil limite d'acceptabilité, au-delà duquel les résultats ne sont plus considérés comme
satisfaisants, sans que pour autant le produit soit considéré comme toxique. Les valeurs de M
sont fixées en tenant compte de la variabilité analytique et statistique à :
M=10m lors du dénombrement en milieu solide
M=30m lors du dénombrement en milieu liquide.
Le produit doit être considéré comme toxique ou corrompu, lorsque la contamination a atteint
la valeur microbienne limite S, qui est fixé dans le cas général à 103m. Pour S. mll"eUS, cette
valeur Sne doit jamais excéder 5.10 4•
35
Gélose à l’ADN et au bleu de toluidine
Formule
Préparation
ADN
0,3 g
Ajouter tous les ingrédients, sauf le bleu de toluidine au tampon Tris et
CaCl2
1,1 mg
faire bouillir pour dissoudre l’ADN et la gélose. Ajouter le bleu de
NaCl
10,0 g
toluidine à la solution et répartir dans des bouteilles. Sceller
Bleu de toluidine
0,08 g
hermétiquement. Il n’est pas nécessaire de stériliser. Conserver à
Gélose
10,0 g
température ambiante et à l’obscurité. Le milieu est stable pendant au
Tampon Tris O,O5 M pH 9
1,0 L
moins 4 mois et conserve ses propriétés même après avoir été
régénéré à plusieurs reprises.
Lecture
36
: ~:..*.
Gélose de- Baird-Parker au jaune d'œuf
et au tellurite de potassium
la gélose de Baird-Parker avec ja<.Jne d'oe<.Jf est un milieu sélectif
pour la recherche et le dénombrement de Staphy/ococcus aureus
dans les prélèvements biologiques, les produits pharmaceutiques,
les produits cosmétiques et les prociuits.alimentaires.
caractéristiques
Microorganismes
Historique
5taphylococcus oureus
Croissance
Couleur des
colonies
Halo
d'éd.icissement
StJphy/ococcus aureus
ATC(!6S38
bonne
à excellente
noire
présence
Staphy/ococcus aureus
ATCC 25923
bonne
à excellente
noire
présence
noire
absence
absence
Staphy/CXO«lJS epidermidis ATCC 12228
ralentie
BadOus subti/is
ATCC 6633 partiellement
inhibée
Escherichia coli
ATCC25922
inhibée
brune
Stockage 1 Conservation
Principes
- la.croissance des staphylocoques est favorisée par Je pyruvate de
sodium et la glycine.
- la microflore secondaire est inhibée en ·présence de chlorure de
lithium, de tellurite de potassium (ajouté extemporanément), ainsi
que· par la forte concentration en glycine.
- L'addition de sulfaméthazine après autoclavage assure l'inhibition
de .Ia presque totalité des Proteus et en conséquence limite
fortement l'envahissement du milieu par ces microorganismes.
- L'enrichissement au jaune d'oeuf aide à l'identification en
démontrant l'action de la lécithinase.
- la caractérisation des Staphy/ococcus aureus qui présentent des
colonies noires (réduction du tellurite en tellure), entourées d'un
halo d'éclaircissement du jaune d'oeuf, pourra être complétée par
l'épreuve de la coaguJase et éventuellement de la
désoxyribonucléase et de la ph~phatase ..
Formule-Type du milieu complet
(pouvant être aJUstée de façon à obtenir des performances
optimales)
Pour 1 litre de milieu:
- Tryptone
- Extrait.de viande
. Extrait auto lytique de levure
- Pyruvate de sodium
- Glycine
- Chlorure de lithium
- Agar agar bactériologique
- Emulsion de jaune d'oeuf
- Tellurite de potassium à 3,5%
Contrôle Qualité
- Milieu de base déshydraté: poudre blanc-<:rème, fluide et
homogène.
- Milieu préparé (complet) : gélose jaunâtre, opaque.
- Réponse culturale typiq<.Je après 48 he<.Jres d'incubation à 37'C :
·Domaine d'utilisation
la formule a<.J jaune d'oeuf et aü tellorite de potassium, mise au
point par Baird-Parker en 1962, s'avéra satisfaisante pour le
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive. En 1964,
Smith et Baird-Parker montrèrent que l'addition de sulfaméthazine
au milieu permettait d'inhiber la croissance des Proteus. En 1971,
Tardio et Baer observèrent que parmi lS milieux d'isolement sélectif
testés, le milieu de Baird-Parker était moins inhibiteur que le milieu
de Vogel-Johnson antérieurement utilisé de façon fréquente.
Mode d'emploi
pH du milieu prêt à l'emploi à 25'C : 7,2 ± 0,2.
10 9
5g
19
10 9
12 9
5g
15 9
47 ml
3 ml
Milieu de base déshydraté (sans jaune d'oelif, ni tellurite) : 2-30·C.
- La date de péremption est mentionnée sur "étiquette.
Milieu préparé à partir du milieu de base (à titre indicatif) :
- Milieu de base en flacons: 6 mois à 2-S·C.
- Milieu complet en boîtes: 5 jours à 2-S°C.
Milieu précoulé en boites de Petri,
Emulsion stérile de jaune d'oeuf au tellurite de potassium,
Supplément sélectif Sulfaméthazine,
Plasma de Lapin lyophilisé:
- Stocker entre 2 et S'c, à l'abri de la lumière.
- les dates de péremption sont mentionnées sur les étiquettes.
Présentation :
Préparation
- Mettre en suspension 58,0 9 de milieu de
base déshydraté (BK055) dans 950 ml
d'eau distillée ou déminéralisée.
- Porter à ébullition lentement en agitant
jusqu'à dissolution complète.
- Répartir en flacons, à raison de 95 ml par
flacon.
- 5tériliser à l'autoclave à 121'C pendant 15
minutes.
Milieu précoulé en boites de Petri:
- Coffret de 20 boîtes: BM018DS
Milieu de base déshydraté (sans jaune d'oeuf, ni tellurite) :
- Flacon de 500 9 : BK055HA
.. - Fût de 5 kg : BK055GC
Emulsion stérile de jaune d'oeuf au tellurite de potassium:
- Flacon de So ml : BSool0S
Supplément sélectif Sulfaméthazine :
- Coffret de 10 flacons: BS02S0S
Plasma de Lapin lyophilisé:
- Coffret de 10 flacons (20 réactions par flacon) : BR0020S
- Faire fondre le milieu de base (s'il est
préparé à l'avance).
- Refroidir et maintenir à 47°C.
- Ajouter stérilement 5 ml d'émulsion stérile
de jaune d'oeuf au tellurite (B5001) et
éventuellement 1 ml d~ supplément
sélectif Sulfaméthazine reconstitué
(B5028), dans le cas où· la présence de
Proteus est suspectée.
- Agiter parfaitement de façon à bien
homogénéiser "ensemble. .
- Couler en boîtes de Petri.stériles.
.- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire sédler les boites à l'étuve, couvercle
entrouvert.
···A la surface des boîtes ainsi préparées ou
du m.ilieu précoulé (BM018) ramené
préalablement à température ambiante;
transférer 0,1 ml de l'échantillon à
analyser et de ses dilutioris décimales ou
provenant d'un mili~u·d'enrichissement:
bouillon hypersalé de .Buttiaux-Brogniart .
(BK081l, bouillon de Giolitti et Cantoni
(B1<080).
.
.
- Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un
étaleur stérile.
.
- Incuber à 37"C pendant 48 heures.
lecture 1 Interprétation
Staphy/ococcus aureus se caractérise par
la formation de colonies noires
(réduction du tellurite en tellure),
brillantes, convexes, entourées d'un
'halo d'éclaircissement du jaune d'oeu~
. (2 à 5 mm de diamètre, correspondant
à une protéolyse). A l'intérieur du halo,
il peut apparaître une zone opaque
. due à.l'action d'une lécithinase.
En principe, les autres microorganismes
sont inhibés. Toutefois, il est possible .
d'observer ·des colonies brunes ou.
verdâtres de microcoques, des· colonies
blanches de levures, des colonies
brunes de Baà/fus ou ·de Proteus.
Sur les colonies caractéristiq",es et/ou
non caractéristiques, il est nécessaire
d'effectuer l'épreuve de la coagulase
(se référer à la monographie
concernant le Plasma de lapin
lyophilisé, BR(02) p~ur confirmer le
pouvoir pathogène.
les staphylocoques à. coagulase
négative. sont presque totalement
inhibés ef si, cependant, une culture
apparaissait, les zones d'éclaircissement.
seraient absentes.
Bouillon caséine-soja
Domaine d'utilisation
Le bouillon caséine-soja constitue un milieu nutritif universel
convenant pour un large éventail d'emplois. Etant donné son
excellente valeur nutritive, il favorise la culture des
microorganismes les plus exigeants.
Il est utilisé dans l'industrie pharmaceutique pour satisfaire aux
tests de stérilité et répond à la formule décrite dans la
Pharmacopée américaine sous la rubrique: "Fluid Soybean Casein
Digest Medium". " convient également comme milieu
d'enrichissement pour la recherche de Staphylococcus aureus.
Principes
Préparation
- L'association entre la Tryptone et la peptone papa'inique de soja
réalise une synergie entre l'apport protidique de la caséine et
l'apport glucidique du soja, permetttant ainsi d'obtenir une
croissance optimale pour un nombre élevé de germes exigeants et
non exigeants.
- Le glucose constitue la source énergétique.
- Le chlorure de sodium maintient l'équilibre osmotique.
- Le phosphate dipotassique agit comme substance tampon pour le
maintien du pH.
- Mettre en solution 30,0 g de milieu déshy­
draté (BK046) dans 1 litre d'eau distillée ou
déminéralisée.
- Agiter lentement jusqu'à dissolution
complète.
- Répartir en tubes ou en flacons.
- Stériliser à l'autoclave à 121°( pendant
15 minutes.
Mode d'emploi
Formule-Type
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances
optimales)
Pour 1 litre de milieu:
- Tryptone
- Peptone papaïnique de soja
- Glucose
- Phosphate dipotassique
- Chlorure de sodium
Les milieux ensemencés à partir du milieu
ainsi préparé ou des milieux prêts à l'emploi
BM030 (tubes), BM009 (flacons) doivent être
incubés à 30 ou à 37°C de 3 à 15 jours.
17,0 g
3,0 g
2,5 g
2,5 g
5,0 g
Lecture
-=-=-.=.=-=-=------------­
La croissance est mise en évidence par l'ap­
parition d'une turbidité dans le milieu.
Des subcultures doivent être entreprises
pour pratiquer une purification des souches
destinées à être identifiées.
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,3 ± 0,2.
contrôle Qualité
- Milieu déshydraté: poudre blanc-crème, fluide et homogène.
- Milieu préparé: solution ambrée, limpide.
- Réponse culturale typique après 24-48 heures d'incubation à 3rc
Croissance
Microorganismes
Badl/us subtilis
Micrococcus luteus
Staphvlococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Neisseria meningitidis
Candida albicans
ATCC~
bonne à excellente
6633
ATCC 9341
bonne à excellente
ATCC 25923
bonne à excellente
ATCC 6303
bonne à excellente
ATCC 13090
bonne
ATCC 10231
bonne à excellente
Stockage 1 Conservation
Milieu déshydraté: 2-30°(,
- La date de péremption est mentionnée sur l'étiquette.
Milieu préparé (à titre indicatif) :
- Milieu en tubes ou en flacons: 6 mois à 2-25°(,
Milieu prêt à l'emploi en tubes ou en flacons:
- Stocker entre 2 et 25°C, à l'abri de la lumière.
- Les dates de péremption sont mentionnées sur les étiquettes.
38
:
Gélose casé"ine-soja
Domaine d'utilisation
la gélose caséine-soja est un milieu universel convenant pour un
large éventail d'emplois. Etant donné son excellente nutritivité, il
peut être utilisé d'une part pour la culture et l'isolement des
bactéries aérobies et anaérobies et d'autre part pour favoriser la
croissance des germes particulièrement exigeants.
Sa composition répond à la formule donnée par la pharmacopée
américaine (Soybean Casein Digest Agar Medium) pour la
numération des germes totaux.
Coulée en boîtes quadrillées ou sur languettes, elle convient dans
les tests rapides pour l'examen des surfaces.
Principes
- L'association entre la Tryptone et la peptone papa·inique de soja
réalise une synergie entre l'apport protidique de la caséine et
l'apport glucidique du soja, permettant ainsi d'obtenir une
croissance optimale pour un nombre élevé de germes exigeants et
non exigeants.
- le chlorure de sodium maintient l'équilibre osmotique.
Formule-Type
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances
optimales)
Pour 1 litre de milieu:
- Tryptone
- Peptone papaïnique de soja
- Chlorure de sodium
- Agar agar bactériologique
15 g
5g
5g
15 g
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,3 ± 0,2"
Contrôle Qualité
- Milieu déshydraté: poudre blanc-crème, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose ambrée.
- Réponse culturale typique après 48 heures d'incubation à 30-35°C;
Microorganismes
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Candida albicans
Aspergillus niger
ATCC'il 8739
Croissance
bonne à excellente
ATCC
6538
bonne à excellente
ATCC
6633
bonne à excellente
ATCC
10231
bonne à excellente
ATCC
16404
bonne à excellente
Stockage 1 Conservation
Milieu déshydraté: 2-30°C.
- la date de péremption est mentionnée sur l'étiquette.
Milieu préparé (à titre indicatif) :
- Milieu en tubes ou en flacons: 6 mois à 2-25°C.
- Milieu en boîtes: 1 mois à 2-8°C.
Milieu prêt à l'emploi en boîtes de Petri:
- Stocker entre 2 et 8°C, à l'abri de la lumière.
- la date de péremption est mentionnée sur l'étiquette.
Milieu prêt à l'emploi en flacons:
- Stocker entre 2 et 25°C, à l'abri de la lumière.
- la date de péremption est mentionnée sur l'étiquette.
39
Préparation
- Mettre en suspension 40,0 g de milieu
déshydraté (BK047) dans 1 litre d'eau distil.
lée ou déminéralisée.
- Porter à ébullition lentement, en agitant
jusqu'à dissolution complète.
- Répartir en tubes ou en flacons.
- Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant
15 minutes.
Avec le milieu prêt à l'emploi BM017 ou
BM049 (ou bien si le milieu est préparé à
l'avancé à partir du milieu déshydraté), faire
fondre la gélose pendant le minimum de
temps nécessaire à sa reliquéfa"ction totale.
Mode d'emploi
Utilisation en boîtes préalablement coulées
- Refroidir et maintenir le milieu à 4rc.
- Couler en boîtes de Petri stériles.
- laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire sécher les boîtes à l'étuve, couvercle
entrouvert.
- A la surface des boîtes préparées ou du
milieu précoulé (BM050) ramené préalable­
ment à température ambiante, transférer
0,1 ml de l'échantillon à analyser et de ses
dilutions décimales
- Incuber à la température optimale de
développement du germe ensemencé pen­
dant la durée nécessaire à l'obtention de
colonies luxuriantes.
Utilisation en boîtes pour numération
- Refroidir et maintenir à 4rc.
- Transférer 1 ml du produit à analyser et de
ses dilutions décimales dans des boîtes de
Petri stériles.
- Couler 10 à 15 ml de milieu.
- Homogénéiser parfaitement.
- laisser solidifier sur une surface froide.
- Incuber suiv~nt la norme analytique à
appliquer au produit à examiner.
- Pour la lecture des résultats, on tiendra
compte des boîtes contenant un nombre
de colonies compris entre 15 et 150.
GELOSE AU CETRIMIDE (base)
DOMAINE D'UTILISATION
La gélose au cétrimide est un milieu sélectif pour l'isolement et le dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans
les produits biologiques, les produits pharmaceutiques et les produits cosmétiques. Sa composition répond à la
formule donnée dans la pharmacopée américaine.
PRINCIPES
- Le cétrimide (bromure de cétyl-trlméthyl-ammonium), composé ammonium quaternaire, agit comme inhibiteur
d'une grande variété de germes, y compris les espèces de Pseudomonas autres que Pseudomonas aeruginosa.
- La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l'eau et le chloroforme) est stimulée en
présence de chlorure de magnésium et de sulfate de potassium.
- Le milieu favorise également la production de pigments fluorescents (pyoverdines) par certaines souches de
Pseudomonas aeruginosa.
- La plupart des Pseudomonas aeruginosa sont identifiables à leur odeur d'aminoacétophénone.
PRII'ARATION
-
Mettre en suspension 46,7 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée oudéminéralisée.
Ajouter 10 ml de glycérol.
Porter à ébullition lentement, en agitant jusqu'à dissolution complète.
Répartir en tubes ou en flacons.
Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 minutes.
MODE D'EMPLOI
-
Refroidir et maintenir le milieu à 48°C.
Couler en boites de Petri stériles.
Laisser solidifier sur une surface froide.
Faire sécher les boites à l'étuve, couvercle entrouvert.
Transférer 0,1 ml du produit et de ses dilutions décimales dans les boîtes de milieu.
Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur stérile.
Incuber à 3rC pendant 48 heures.
LECTURI
Considérer comme suspectes:
-les colonies présentant une pigmentation caractéristique bleue ou bleu-verte et une fluorescence sous ultra-violets
à 254 nm.
-les colonies muqueuses, grisâtres, pigmentées ou non.
La présence de pyocyanine peut être confirmée par extraction chloroformique. Pseudomonas aeruginosa produit.
typiquement à la fois la pyocyanine et la fluorescéine.
Occasionnellement, des souches de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Providencia, A/ca/igenes et
Aeromonas peuvent cultiver en provoquant un léger jaunissement du milieu. Cette coloration se distingue aisément
de la production de fluorescéine, car ce jaunissement ne fluoresce pas.
Les colonies isolées doivent subir les trois essais de confirmation suivants:
- Recherche de l'oxydase au moyen de réactif de Kovacs (solution à 1% de chlorhydrate de tétra-méthyl-p­
phénylène-diamine)
- Production de pyocyanine sur milieu de King A
- Culture à 42°C sur bouillon caséine-soja (BK 046).
Un bacille gram-négatif ayant cultivé sur gélose au cétrimide est considéré comme Pseudomonas aeruginosa
lorsqu'une colonie typique est caractérisée par les tests suivants:
- Oxydase:
positive
- Pyocyanine:
positive
- Culture à 42°C: positive.
fORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
.Pour 1 litre de milieu: -
Peptone pancréatique de gélatine
Cétrimide
Chlorure de magnésium
Sulfate de potassium
Agar agar bactérioiogique
..
20,0 g
0,3 g
1,4 g
10,0 g
15,0 g
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,2 ± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 10,7 litres de milieu.
CONTROLE QUALITE
- Milieu déshydraté: poudre blanc-crème, fluide et homogène.
- Milieu préparé complet: gélose blanchâtre, opalescente, pouvant présenter un léger précipité après autoclavage.
- Réponse culturale typique après 24 - 48 heures d'incubation à 37°C:
40
Gélose de Chapman au mannitol
Domaine d'utilisation
la gélose de Chapman au mannitol permet l'isolement sélectif, la
recherche et le dénombrement des staphylocoques pathogènes
dans le lait, les produits carnés, les produits de la mer, les autres
produits alimentaires, les produits pharmaceutiques et cosmétiques,
les prélèvements biologiques.
Historique
les expériences de Koch ont montré que I.es staphylocoques
supportent les milieux hypersalés à 7,5 %. Chapman a confirmé ces
premiers résultats en observant que les staphylocoques coagulant le
plasma de lapin présentaient des colonies jaunes sur le milieu
auquel il a donné son nom, alors que la plupart des autres bactéries
étaient inhibées.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Principes
- la forte concentration en chlorure de sodium inhibe la croissance
de la plupart des bactéries autres que les staphylocoques.
- la fermentation du mannitol, mise en évidence par le virage au
jaune de l'indicateur pH (rouge de phénol), permet d'orienter le
diagnostic.
- la mise en évidence des staphylocoques pathogènes devra être
confirmée par la recherche de la coagulase et, éventuellement.. de
la désoxyribonucléase et de la phosphatase.
Formule-Type
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances
optimales)
Pour 1 litre de milieu:
- Tryptone
- Peptone pepsique de viande
- Extrait de viande
- Mannitol
- Chlorure de sodium
- Rouge de phénol
- Agar agar bactériologique
5g
5g
1g
10 g
75 g
25 mg
15 g
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,4 ± 0,2.
Contrôle Qualité
- Milieu déshydraté: poudre rosée, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose rouge.
- Réponse culturale typique après 24-48 heures d'incubation
à3rc:
ATCC 25923
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Escherichia coli
- Mettre en suspension 111,0 g de milieu
déshydraté (BK030) da[1s 1 litre d'eaudistil­
lée ou déminéralisée.
- Porter à ébullition lentement, en agitant
jusqu'à dissolution complète.
- Répartir en tubes ou en flacons.
- ,Stériliser à l'aut9c1ave à 121°C pendant 15
minutes.
Mode d'emploi
- Faire fondre le milieu (s'il est préparé à
l'avance).
- Refroidir et maintenir à 47°(,
- Couler en boîtes de Petri stériles.
- laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire sécher les boîtes à l'étuve, 'couvercle
entrouvert.
- Transférer 0,1 ml du produit à analyser et
de ses dilutions décimales dans les boîtes
de Petri.
.'
- Etaler l'inoculum à la surface dumilieu a
l'aide d'un étaleur stérile'­
- Incuber à 37°C pendant 24 et 48 heures.
Lecture
Microorganismes
Staphylococcus aureus
ATCC' 6538P
Staphylococcus aureus
Préparation
ATCC 25922
Croissance
bonne
à excellente
bonne
à excellente
bonne
Caractéristiques
colonies jaunes, entourées
d'une auréole jaune
colonies jaunes, entourées
d'une auréole jaune
colonies roses, entourées
d'une zone rouge
inhibée
41
les staphylocoques pathogènes forment des
colonies luxuriantes, pigmentées, entourées
d'une auréole jaune due à la fermentation
du mannitol.
les staphylocoques non pathogènes forment
en général de petites colonies rouges qui ne
modifient pas la teinte du milieu.
Quelques souches de 5taphylococcus epider­
midis sont capables de fermenter le mannitol.
Après 48 heures d'incubation, quelques
souches d'entérocoques, de BacilJus, de
Mierococcus et de 5erratia peuvent cultiver.
•
•
A
•
I~ain Heart Broth
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la culture des différents microorganismes patho:
.nes exigeants.
.
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Les milieux correspondent aux recommandations des
Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater (1975). Le bouillon cœur-cerveau corres­
Pond à la norme DIN 10 163 pour l'analyse de la viande
el aux directives selon § 35 LMBG pour l'analyse des
aliments.
Mode d'action
Ces milieux reposent sur le principe du bouillon de
ROSENOW avec de la cervelle (ROSENOW 1919) et
~onviennent pour la culture de nombreuses bactéries
~xigeantes comme les streptocoques, méningocoques,
~tc. Les gonocoques poussent après l'addition d'ascite.
le
bouillon coeur-çerveau est surtout utilisé pour la culture
'des staphylocoques pour le test à la coagulase du
plasma. Le domaine d'application est étendu aux
,hémocultures pour la caractérisation d'une bactériémie.
la
bactériologique, pour la culture de champignons patho­
gènes. La croissance de la flore d'accompagnement
bactérienne peut être largement inhibée par l'addition de
20 U.I. de pénicilline et 40 Ilg de streptomycine par ml.
L'addition de 0,05 Ilg de cycloheximide et 0,5 Ilg/ml de
chloramphénicol est recommandée pour l'isolement
sélectif de champignons exigeants, surtout d'Histoplasma
capsulatum et de Blastomyces à partir d'un prélèvement
contaminé.
Ce milieu convient moins bien pour l'obtention d'hémo­
lyses caractéristiques après l'addition de sang du fait de
la teneur en glucose.
Composition type g/Iitre
Infusat de cerveau 12,5; infusat de coeur 5,0; protéose­
peptone 10,0; D(+)-glucose 2,0; chlorure de sodium 5,0;
dihydrogenophosphate de sodium 2,5; agar-agar
(manque dans le bouillon) 15,0.
Préparation
Dissoudre 52 g/Iitre pour l'agar ou 37 g/Iitre pour le
bouillon, autoclaver (15 min. à 121°C).
pH: 7,4 ± 0,2.
croissance des germes anaérobies ou micro-aéro­
philes est améliorée par l'addition de petites quantités
:~'ogar-{]gar (environ 0,05 à 0,2%) au bouillon. Sur la
.~se de l'agar cœur-cerveau, QUEIROZ et al. (1987)
nt développé un agar sélectif pour Campylobacter
pylori sous l'appellation de Milieu Belo Horizonte [BHM).
Les deux milieux sont faiblement brunâtres. Le bouillon est
limpide, tandis que le milieu à l'agar peut parfois être
faiblement opalescent.
l'ogar cœur-cerveau est utilisé, en plus du domaine
Dépend du but pour lequel le milieu est utilisé.
ê
Emploi et interprétation
frôle de qualité de l'agar cœur-cerveau
~ches test
~Ptococcus
----------r--­
pyogenes ATCC 12344
bonne
~ococcus pneumoniae ATCC 63'0-1---'
li$Ja
.~-.-.-------~----.
t phylococcus aureus
ATCC 25923 _._-----'.-_._--_------- -~--_
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Croissance
------------
bonne
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bonne
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abortus
~
bonne
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médiocre
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ATCC 4356
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médiocre
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~strjd~um ~erf~i~~~~~--.A.TCC-i0543
bonne
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Domaine d'utilisation
La gélose à la bile, à l'esculine et à l'azide de sodium (BEA) est un
milieu sélectif utilisé pour l'isolement et le dénombrement des
streptocoques fécaux (groupe D de Lancefield) dans les produits
alimentaires et les produits pharmaceutiques.
Elle est également utilisée pour le dénombrement des entérocoques
intestinaux dans les eaux.
Historique
Préparation
Rochaix a le premier montré l'intérêt de l'hydrolyse de l'esculine pour
l'identification des entérocoques, puis Meyer et Schonfeld ont
démontré que cette hydrolyse dans un milieu bilié constituait un
excellent test pour la mise en évidence des streptocoques du groupe D.
Les premières formulations décrites par Swan ont été modifiées par
Isenberg qui obtenu un milieu à la fois plus sélectif et en même
temps apte à favoriser une croissance rapide et une bonne
récupération des germes recherchés.
La formule actuelle est décrite dans la norme NF EN ISO 7899-2
comme milieu de confirmation des entérocoques intestinaux dans
les eaux, lorsque le dénombrement est effectué par la méthode de
filtration sur membrane.
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Principes
- L'azide de sodium provoque l'inhibition des bactéries
contaminantes Gram négatif.
- La bile de boeuf empêche la croissance des bactéries Gram positif.
- Les entérocoques hydrolysent l'esculirie en glucose et en
esculétine. L:esculétine produite forme un complexe noir en
présence des ions ferriques apportés par le citrate de fer.
Formule-Type
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances
optimales)
Pour 1 litre de milieu:
• Tryptone
- Peptone pepsique de viande
- Extrait autolytique de levure
- Bile de boeuf bactériologique
• Chlorure de sodium
• Esculine
- Citrate ferrique ammoniacal
- Azide de sodium
- Agar agar bactériologique
17,00 g
3,00 g
5,00 g
10,00 9
5,00 g
1,00 g
0,50 g
0,15 g
13,00 g
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,1 ± 0,2.
Contrôle Qualité
- Milieu déshydraté: poudre crème, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose ambrée, à reflet bleuâtre.
- Réponse culturale typique après 24 heures d'incubation à 3JOC :
Microorganismes.
Enterococcus faecalis
Streptococcus pyogenes
EScherichia coli
Croissance
ATCC" 29212
ATCC 19615
ATCC 25922
bonne
faible à nulle
inhibée
Hydrolyse de
l'esculine
positive
néqative
- Mettre en suspension 54,6 g de milieu
déshydraté (BK158) dans 1 litre d'eau
distillée ou déminéralisée.
..
- Porter à ébullition lentement, en agitant:
jusqu'à'dissolution complète.
'.
- Répartir en tubes ou en flacons.
- Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15'
minutes.
Mode d'emploi
- Refroidir et maintenir le milieu à 47'(,
- Couler en boites de Petri stériles.
• Laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire sécher à l'étuve, couvercle
entrouvert.
· Ensemencer l'inoculum à la surfate du
milieu.
• Incuber à 37'C pendant 24 à 72 heures.
Lecture
Les entérocoques se présentent sous forme
de petites colonies translucides entourées
d'un halo noir.
Les staphylocoques et les levures peuvent·
donner des colonies opaques sans halo noir.
11 est indispensable d'identifier les
microorganismes suspects, notamment pour
écarter toute confusion avec les listeria qui
peuvent donner des colonies similaires à
celles des entérocoques.
NOTA
Pour la confirmation des entérocoques dans les
eau!(, et s'il y a des colonies typiques sur le milieu
de dénombrement (Slanetz et Bartley), transférer
la membrane et les colonies sur une boite de
milieu préchauffé à 44'(, Incuber à 44'( pendant
2 heures.
Considérer comme positives, toutes les colonies
donnant une couleur brune à noire dans le
milieu. Les compter comme entérocoques
intestinaux.
GELOSE POUR LE COMPTAGE
·DES·GERMES-DE· SURFACE- -'-­
DOMA.INE D'UTILlSA.TION
La gélose pour le comptage des germes de surface permet de dénombrer les microorganismes par application
directe de gélose sur les surfaces à tester. Le milieu, dérivé de la gélose caséine-soja, contient 4 substances
neutralisantes qui assurent l'inactivation de la plupart des désinfectants pouvant se trouver éventuellement présents à
l'état de traces après un nettoyage. Cette association facilite le développement des microorganismes résiduels
revivifiables. La mise en oeuvre de cette technique simplifiée permet de bien vérifier l'état sanitaire de l'équipement
après le nettoyage et la désinfection. En outre, elle peut servir à l'estimation de la charge bactérienne des doigts et
des mains du personnel.
PRINCIPES
- L'association entre la Tryptone et la peptone de soja permet d'obtenir d'une croissance optimale qui est due à la
synergie réalisée entre l'apport protidique de la caséine et l'apport glucidique du soja.
- Le chlorure de sodium maintient l'équilibre osmotique.
- L'association lécithine-polysorbate-histidine-thiosulfate permet de neutraliser la plupart des désinfectants.
- Le polysorbate neutralise "hexachlorophène et les phénols.
- La lécithine neutralise l'activité de la chlorhexidine et des phénols.
- L'association entre la lécithine et le polysorbate provoque l'inhibition des ammoniums quaternaires.
- Le thiosulfate de sodiurn neutralise les dérivés halogénés.
PREPARATION
-
Mettre en suspension 52,2 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Porter à ébullition leflternent, en agitant jusqu'à dissolution complète.
Répartir en tubes ou en fiacons.
Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 rninutes.
MODE D'EMPLOI
- Refroidir et maintenir à 48°C.
- Couler la gélose dans une boîte de Petri quadrillée stérile, de 50 à 70 mm de diarnètre.
- La quantité de rnilieu versé doit perrnettre "obtention d'un rnénisque bien formé.
- Laisser solidifier sur une surface froide, sous flux laminaire d'air stérile et remettre le couvercle sur la boîte.
- Pour évaluer l'état sanitaire des surfaèes, appliquer directement la gélose sur la surface à tester, sans appuyer trop
fortement et sans déplacer la boîte, de telle façon que le rnénisque ne soit pas détérioré.
- Incuber à 30 ou à 37°C pendant 24 à 48 heures suivant le protocole utilisé.
LECTURE
Procéder au comptage des colonies.
Le quadrillage du fond des boîtes perrnet de faciliter la nurnération.
FORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: -
Tryptone
Peptone papainique de soja
Chlorure de sodium
Lécithine
Polysorbate (Tween 80)
Thiosulfate de sodiurn, 5H2ü
..
15,0 g
5,0 g
5,0 g
0,7 g
5,0 g
0,5 g
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pH du milieu prêt à l'emplcÜ-25~C; 7j±-O~2.
500 g de poudre permettent de prépôrer 9,5 litres de rnilieu.
44
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EAU PEPTONÉE
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exempte d'indole
L'Eau Peptonée (exempte d'indole) est un milieu liquide qui permet
la croissance des bactéries ne présentant pas d'exigences particu­
lières, Elle est surtout utilisée pour la recherche de production
d'indole.
Formule
(en gremme.
per litre
d'eeu di.tI1l6e)
Préparation
Id6.hydret6e)
Utilisation
Lecture
Présentations
Conservation
• Peptone bactériologique.
• Chlorure de sodium
10
DOMAINE D'UTILISATION
L'eau peptonée tamponnée est un diluant destiné à la préparation des suspensions-mères de laits en poudre et
concentrés. de yaourts, de produits laitiers. de produits d'origine animale et d'autres produits alimentaires.
Ce milieu peut également être utilisé pour le pré-enrichissement des salmonelles préalablement aux phases d'enri­
chissement sélectif et d'isolement.
5
pH final: 7.2
± 0.2
PRINCIPES
Mettre 15 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée.
Mélanger soigneusement jusqu'à dissolution complète.
Ajuster, si nécessaire, le pH à 7.2.
Répartir, puis stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Ensemencer avec la culture de la bactérie à étudier et incuber à 37°C
pendant 24 à 48 heures.
Lorsque la culture est suffisante, rechercher la production d'indole à
l'aide du réactif de Kovacs (1) :
• Ajouter dans le tube de culture 5 à 6 gouttes de ce réactif et agiter:
une coloration rouge intense apparaît à la surface du milieu s'il y a
production d'indole par les bactéries.
Milieu prêt à l'emploi
• 5 tubes de 10 ml
Milieu déshydraté
• boîte de 450 g
(1) Réactif de Kovacs
• flacon cgtt. de 5 ml
• flacon de 25 ml
• disponible également dans le Kit réactifs
pour galerie classique
- Le pré-enrichissement des salmonelles est utilisé pour ia revivification des microorganismes ayant subi des
dommages subléthaux au cours des traitements industriels de conservation des aliments tels que: atomisation,
pasteurisation. conservateurs. pressions osmotiques élevées, fortes acidités.
- Le chlorure de sodium maintient l'équilibre osmotique.
- Le milieu est tamponné au moyen des phosphates de sodium et de potassium.
PREPARATION
-
Mettre en solution 25.5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Agiter lentement Jusqu'à dissolution complète.
Répartir en flacons. à raison de 225 ml par flacon.
Stériliser à l'autoclave à 120C pendant 15 minutes.
MODE D'EMPLOI
Code: 54175
Code: 64 337
Code: 55 311
Code: 55 312
Code: 53 911
Milieu prêt à l'emploi: + 2-8 oC,
Milieu déshydraté: boîte soigneusement fermée dans un endroit frais
et sec.
Réactif de Kovacs : T.A. à l'obscurité.
La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le condi­
tionnement.
- Refroidir le milieu à 25C.
- Introduire aseptiquement 25 g de produit à analyser dans un flacon taré contenant 225 ml d'eau peptonée
tamponnée.
- Homogénéiser parfaitement.
FORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: - Peptone pancréatique de viande
- Chlorure de sodium
- Phosphate disodique
- Phosphate monopotassique
pH du milieu prêt à l'emploi à 25C: 7,2 ± 0.2
500 g de poudre permettent de préparer 19.6 litres de milieu.
10,0
5,0
9,0
1,5
g
g
g
g
Milieu d’Edwards modifié (Oxoid – Thermo Fisher Scientific)
46
GELOSE HEKTOEN
GELOSE HEKTOEN
DOMAINE D'UTILISATION
La gélose Hektoen est un milieu sélectif permettant l'isolement et la différenciation des entérobactéries pathogènes à
partir des préièvements biologiques, des eaux, des produits laitiers et des autres produits alimentaires. Ce milieu est
particulièrement adapté à la culture des Shigella. il évite l'envahissement par les Proteus.
fonnule en grammes par litre d'eau distillée.
12 g
Bio-Thione
Extrait de levure
Sels biliaires
Lactose
Saccharose
Salicine
3g
9g
12 g
12 g
2g
HISTORIQUE.
La gélose Hektoen a été formulée en 1967 par King et Metzger à l'Institut Hektoen afin d'augmenter la fréquence
d'isolement des Shigella et des Salmonella comparativement à ceile obtenue avec d'autres milieux d'isolement
sélectif.
Ce miiieu qui permettait d'isoler un large éventail d'entérobactéries pathogènes était en contrepartie moins inhibiteur
vis-à-vis des germes entériques non pathogènes. La formulation actuelle diffère de l'originale par l'élimination du
désoxycholate et par la concentration en sels biliaires qui a été réduite. Parallèlement, la concentration en peptones a
été augmentée afin de contrebalancer l'effet inhibiteur des sels biliaires.
rRINClrES
- L'inhibition de la flore gram-positive est due à la présence des sels biliaires qui peuvent également inhiber
légérement la croissance de quelques souches de microorganismes gram-négatifs.
_ Le milieu contient trois glucides: lactose, saccharose et salicine. La forte concentration en lactose favorise la
visualisation des entérobactéries en évitant le problème des fermentations tardives. Les autres glucides ont été
introduits afin d'assurer une différenciation plus performante et de réduire la toxicité engendrée par ies indicateurs
colorés, de manière à obtenir une excellente récupération des Shigella.
_ En presence de thiosulfate de sodium, les microorganismes producteurs de sulfure d'hydrogène réduisent le citrate
ferrique ammoniacal et se manifestent par un noircissement qui est du à l'apparition de sulfure de fer au centre des
colonies.
_ Le système d'indicateurs colorés composé de bleu de bromothymol et de fuchsine acide permet de colorer en
jaune-orangé les entérobactéries lactose-positives et en bleu-vert les lactose-négatives.
rRErARATION
_ Mettre en suspension 75,1 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
- Porter à ébullition lentement, en agrtant jusqu'à dissolution complète.
- Maintenir l'ébullition pendant 2 minutes.
- Ne pas autoclaver.
Citrate de fer ammoniacal
Chlorure de sodium
Hyposulfite de sodium
Bleu de bromothymol
Fuchsine acide
Gélose
pH 7,6
1,500 g
5,000 g
5,000 g
0,064 g
0,040 g
13,500 g
principe
Théoriquement inhibiteur de par sa concentration en sels
biliaires, ce milieu parsa richesse en peptones et en sucres
permet un bon développement des germes délicats
(Shigella en particulier) dont la croissance est ralentie sur
milieu sélectif ordinaire.
Le systéme d'identification original est basé sur la fermen·
tation éventuelle des trois sucres : lactose, saccha rose,
salicine. Les germes fermentantau moins un de ces sucres
donnent des colonies de couleur jaune saumon, les autres
restant bleues ou vertes.
La production d'H2S se traduit par un volumineux centre
noir pour les colonies ne fermentant pas les sucres,
les germes acidifiant le milieu par fermentation de l'un des
sucres ont un centre gris.
Remarque:
• le Vibrion cholérique cultive bien donnant des colonies
iaune saumon.
• le bacille pyocyanique cultive donnant des colonies
vertes, oxydase positive.
Aspect des colonies de différents germes
• colonies jaune saumon
Escherichia
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Arizona
• colonies jaune saumon il centre gris P. vulgaris
• colonies bleues à centre noir
P, mirabilis
Salmonella
• colonies vertes
Shigella
Providencia
Pseudomonas
(oxydase positive)
MODE D'EMrLOI
- Refroidir et maintenir le milieu à 4SoC.
- Couler en boîtes de Petri stériles.
- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire sécher les bo~es à l'étuve, couvercle entrouvert.
_ Ensemencer en stries l'inoculum, à partir des miiieux d'enrichissement utilisés pour la recherche des Salmonella.
- Transférer parailèlement l'inoculum sur un autre milieu sélectii.
- Incuber à 3rC pendant 24 et 48 heures.
Salmonella enteritidis
Proteus vulgaris
Colonies incolores à centre noir brillant sur milieu bleu-vert
Colonies jaunes à centre gris
Lactose
Saccharose
Salicine
0
0
0
+
LECTURE
H2S
Le principe de lecture est fondé sur la fermentation éventuelle des 3 glucides présents dans le milieu (lactose,
saccharose, salicine). Les microorganismes qui fermentent au moins l'un d'entre eux forment des colonies de couleur
"saumon", les autres donnant des colonies bleues ou vertes.
En présence de thiosulfate de sodium, les microorganismes producteurs de suifure d'hydrogène donnent avec le
citrate ferrique des colonies à centre noir.
Escherichia coli
H2S
0
+
+
+
Shlgella sonnei
Colonies iaune saumon
Lactose
Saccharose
Salicine
H,S
Lactose
Saccharose
Salicine
+
+
+
o
Colonies vertes devenant Jaunes en 36 à 48 heures pour lactose + lent
Lactose
Saccharose
Salicine
H,S
oou+ ient
o
o
o
Bouillon lactosé bilié
au vert brillant
BOUILLON D'ENRICHISSEMENT POUR L1STERIA
(L.E.B. selon F.I.L.)
Le bouillon lactosé bilié au vert brillant est utilisé pour rechercher et
dénombrer les coliformes dans le lait et les produits alimentaires. On
l'util.ise aussi pour dénombrer E. coli au moyen du test de Mackenzie
dans les mêmes produits et au cours de l'analyse·bactériologiq·ue des­
eaux.
DOMAINI.;._P'UTILISATION
1 .~
Formule
(en gramme.
par litre
d'eau di.tlllée)
10
Peptone bactériologique
Bile de bœuf.
Lactose . .
Vert brillant.
IJIIIICl!
LE.B. selon F.I.L. (Fédération Internationale de Laiterie) est utilisé pour
l·l~11I1o Illé,selllent sélectif des Listeriadans le lait et les produits laitiers.
20
10
0,0133
pH : 7,4 (environ)
PRINCIPE$
L:\ Ilyptone, la peptone de soja et l'extrait de levure apportent les éléments nutritifs
Ill'~r:';:,:;ailes
Préparation
Verser 40 g de poudre dans 1 litre d'eau distillée. Bien mélanger et
répartir dans des tubes contenant une cloche de Durham. Stériliser
à l'autoclave à.121"C pendant.15 minutes·,
à la croissance des~.
· 1. ~ ,:!Jlorure de sodium assure l'équilibre osmotique.
1 " ! >Ilm~pllate bipotassique agit comme substance tampon pour le maintien du pH.
l" cyclolleximide inhibe le développement des moisissures saprophytes
COIIi;lIl1innnles.
• 1 ',1<:I<lC nRlidixique bloque la réplication de l'ADN des germes sensibles à cel
<lnllh;\r:lcrien.
Utilisation
Lecture
Test
de Mackenzie
Introduire dans les tubes 1 ml du produit à examiner ou 1 ml de cha­
cune des différentes dilutions. Incuber à 3O"C de préférence (ou à
37"C) pendant 24 heures puis 48 heures.
L'apparition de gaz dans les cloches (volume au moins égal au
1{10 du volume total de la cloche), en 48 heures, traduit la fermentation
du lactose par les coliformes. Cette recherche peut être confirmée
par l'isolement et l'identification des germes producteurs de gaz;
à cet effet, on pratique une subculture du ,contenu des tubes gazo­
gènes sur· un milieu solide approprié, tel que la gélose lactosée à
l'éosine et au bleu de méthylène (E.M.B, fiche 44) ou la gélose lactosée
au bromocrésol-pourpre (B.C.P. fiche 17).
Une ose bouclée du contenu des tubes gazogènes est inoculée dans
un tube de bouillon lactosé bilié au vert brillant muni d'une cloche
à gaz et un tube d'eau peptonée (fiche 41). Ces tubes sont placés
aussitOt dans un bain-made à la température de 44"C (± 0,5 "C).
Après 24 heures puis 48 heures, on riote l'existence ou l'absence de
gaz dans le premier tube puis on recherche l'indole dans le second.
On interprète les résultats de la façon suivante:
E. coli
.
Autres coliformes
Gaz
Indole
+
+
+
+
~ll
1 ';l'~llllavine supprime partiellement la croissance de la microflore secondaire
dili-positive.
FORMULE - TYPE
(pouvant être ajustêe de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu:
- Polypeptone
· Extrait autolytique de levure
· Glucose
- Amidon
- Chlorure de sodium
- Esculine
- Citràte ferrique ammoniacal
· Chlorure de lithium
- D-mannitol
- Rouge de phénol
- Agar agar bactériologique
20,00 9
3.00 9
0.50 9
1,00 9
5,00 9
0,80 9
0.50 9
15.00g
10,00g
0,08 9
13,00 9
Gélose Lécithine-Polysorbate-Triton X
Domaine d'utilisation
Re~~~tiF~'·.·." • ·".
la gélose lécithine-Polysorbate-Triton X est utilisée pour le
dénombrement des germes totaux dans les produits cosmétiques
avec et sans conservateurs. Elle permet d'obtenir de luxuriantes
cultures pour la plupart des microorganismes.
Tau~ 4~i~~<imti.'ution :
ciri~~i.té{~og!i: '
pH(à2'5°t) :
Sypplément requis:
Principes
Stérilisation;
,',' f)B~éit~t~lé~ .•'
S2,4g/L.
63~
boîtes
1;Q± Ô,2.
Aucun.
121'C 115 minutes
- le milieu est constitué par un mélange de peptones, de cystine, de
glucose et de sels qui favorisent la croissance d'une grande variété
de microorganismes.
- le chlorure de sodium maintient la pression osmotique.
- la présence de lécithine et de tween permet de neutraliser
l'activité antibactérienne de la plupart des antiseptiques ou des
conservateurs tels que les dérivés phéniqués, les aldéhydes et les
ammoniums quaternaires.
- le triton X-l00 favorise la dispersion des germes et améliore ainsi
le dénombrement.
- Mettre en suspension 52,4 9 de milieu
déshydraté (8K138) dans 1 litre d'eau distil.
lée ou déminéralisée.
- Porter à ébullition lentement, en agitant
jusqu'à dissolution complète.
- Répartir en tubes ou en flacons.
- Stériliser à l'autoclave à 121'C pendant
15 minutes.
Formule-Type
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances
optimales)
Pour 1 litre de milieu:
- Tryptone
- Peptone papaïnique de soja
- l-cystine
- Glucose
- Chlorure de sodium
- Sulfite de sodium
- Lécithine
- Polysorbate (Tween 80)
- Triton X-l00
.
- Agar agar bactériologique
15,0 g
5,0 g
0,7 g
5,5 g
4,0 g
0,2 g
1,0 g
5,0 g
1.0 g
15,0 g
Mode d'emploi
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7.0 ± 0,2.
Contrôle Qualité
- Milieu déshydraté: poudre beige. homogène. légèrement mottée.
- Milieu préparé: gélose ambrée.
- Réponse culturale typique après 48 heures d'incubation
à 30 (1) ou à 37°C:
Microorganismes
ArcC· 8739
ATCC 6538P
ATCC 9027
ATCC 10231
ATCC 16404
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans
Aspergillus niger (1)
Préparation
":"':':=~='----------------
Croissance
bonne à excellente
bonne à excellente
bonne à excellente
bonne à excellente
bonne à excellente
Ensemencement en profondeur:
Avec le milieu prêt à l'emploi en tubes
(8M023) ou en flacons (8M044, BM045), ou
bien si le milieu est préparé à l'avance à par.
tir du milieu déshydraté. faire fondre la
gélose ,pendant le minimum de temps néces­
saire à sa reliquéfaction totale.
- Refroidir et maintenir à 47'C
- Transférer 1 ml du produit à analyser et de
ses dilutions décimales dans des boîtes de
Petri stériles.
- Couler 15 à 20 ml de milieu.
- Homogénéiser parfaitement.
- laisser solidifier sur une surface froide.
- Incuber à 30'C pendant 72 heures pour la
numération des bactéries mésophiles.
Ensemencement en surface;
- A la surface de boîtes préparées à partir de
tubes ou de flacons ou du milieu précoulé
(BM046) ramené préalablement à tempéra·
ture ambiante. transférer 0,1 ml de
l'échantillon à analyser et de ses dilutions
décimales.
Stockage 1 Conservation
Milieu déshydraté: 2-20°C.
- la date de péremption est mentionnée sur l'étiquette.
Milieux préparés (à titre indicatif) :
- Milieu en flacons ou en tubes: 6 mois à 2-8°C.
- Milieu en boîtes: 1 mois à 2-8°C.
Milieu prêt à l'emploi en tubes. en flacons. en boîtes de Petri:
-,Stocker entre 2 et 8°C. à l'abri de la lumière.
- Les dates de péremption sont mentionnées sur les étiquettes.
lecture
On tiendra compte des boîtes de Petri conte·
nant un nombre de colonies compris entre
15 et 150.
Bouillon Lécithine- Polysorbate-Triton X
,..:M=od:::e=d...
·e".'m'tP"lo"'i
Domaine d'utilisation
Le bouillon Lécithine-Polysorbate-Triton X est utilisé pour
le dénombrement des germes totaux dans les produits cosmétiques
avec et sans conservateurs, par la méthode du "nombre
le plus probable".
Principes
Formule-Type
_
_ Ensemencer le milieu ainsi préparé ou le
milieu prêt à l'emploi (BM006, BM042,
BM043) avec l'inoculum.
.
- Incuber à 30 ou à 37'C de 7 à 10 jours SUi'
vant la norme analytique à respecter.
- Faire la numération en utilisant la tech­
nique du' "nombre le plus probable".
lecture
Idem gélose ci-dessus
la croissance est mise en évidence par l'ob·
tention d'une turbidité résultant de la multi­
plication microbienne.
49
LITSKY
(milieu de)
le milieu de litsky à l'éthyl-violet est utilisé pour la recherche et le
dénombrement des Streptocoques fécaux dans les eaux conformé­
ment à la circulaire du 21 janvier 1960 {J.O. du 15 mars 1960} relative
aux méthodes d'analyses bactériologiques des eaux d'alimentation.
Cette recherche comprend deux temps: présomption et confirma­
tion.le milieu de Rothe sert au test présomptif, le milieu de Utsky au
test confirmatif.
.
Formule
(en grammes
par litre
d'eau di.tillée)
•
•
~
•
•
•
5
5
2.7
2.7
0.3
0.0005
Glucose.
Chlorure de sodium
Phosphate dipotassique
Phosphate monopotassique
Azothydrate de sodium
• Ëthyl-violet. . '. . . . .
pH final: 6.8
Préparation
(déshydraté)
Utilisation
Lecture
Composition type g/Iitre
Peptone de caséine 5,0; extrait de levure 2,5; poudre de
lait écrémé (exempt d'inhibiteurl 1,0; glucose 1,0; agar·
agar 10,5.
20
Peptone . . . . .
± 0.2
Mettre 35,7 g de milieu déshydraté dans un litre d'eau distillée.
Mélanger soigneusement jusqu'à dissolution complète.
Ajuster, si nécessaire, le pH à 6,8.
Répartir à raison de 10 ml par tube.
Stériliser à l'autoclave à 115 oC pendant 20 minutes.
Ce milieu est ensemencé à partir d'une culture sur milieu de Rothe
(test présomptif). Agiter les tubes de Rothe "positifs". Prélever une
ose bouclée et la reporter dans le milieu de litsky. Incuber à 37 0ç
pendant 24 et 48 heures.
la présence de Streptocoques fécaux se manifeste par l'apparition
d'un trouble microbien dans tout le milieu et, éventuellement, par la
formation d'une pastille violette dans le fond du tube (dans ce dernier
cas, le trouble du milieu peut être très léger).
Pour identifier les espèces de Streptocoques ainsi dépistées, réisoler
une ose bouclée de milieu de Utsky positif, sur le milieu de Barnes,
Art. n° 15338
(500 g, 5 kg)
Plate Count Skimmilk Agar
Pour 10 détermination du nombre de germes dans le lait
et les produits laitiers selon les recommandations de DIN
10 192 et du lnternationaler MilchwirtschaFtsverband
(1958, 1981, 1982J. le présent milieu de culture corres­
pond dans sa composition à l'agar PCA (MERCK, Art.
nO 5463) avec addition de lait écrémé.
Mode d'action
Grâce à l'addition de lait écrémé, ce milieu de culture
possédant une base nutritive de grande qualité est
approprié de façon optimale aux conditions de vie natu­
relles des microorganismes présents dans le lait. Comparé
aux autres milieux de culture prévus pour la même utili­
sation, il identifie un spectre de germes plus grand
[TERPLAN et al. 1967).
Préparation
Mettre en suspension 20 g/litre et laisser reposer environ
15 minutes, chauffer lentement au bain-marie tout en
agitant fréquemment, jusqu'à la dissolution compléte,
autoelaver (15 min. à 121 cC).
pH: 7,1 ± 0,1.
Le milieu préparé est plus ou moins opalescent.
Selon les normes DIN, il peut être stocké au réfrigérateur
jusqu'à 3 mois à 5 c C maximum.
Emploi et interprétation.
Selon le but d'utilisation ou le mode opératoire concerné.
Souches test
Croissance
bonne
Streptococcus agalacfÎae ATCC 13813
Présentations
Conservation
Milieu prêt à "emploi
• 5 tubes de 10 ml
Milieu déshydraté
• boite de 450 9
Code: 78 655
Code: 64861
Milieu prêt à ('emploi: à + 2-8 oC.
Milieu déshydraté: boite soigneusement fermée dans un endroit frais
et sec.
la date de péremption et le numéro de lot sont indiqués su~ le condi­ .
tionnement.
Streptococcus lactis ATCC 19435
1
Listeria monocytogenes ATCC 19118
1
bonnel médiocre
- - - ­
bonne
Bacillus cereus ATCC 11778
bonne
Escherichia coli ATCC 11775
bonne
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
bonne
Candida albicans ATCC 10231
bonne
BOUILLON DE MACCONKEY
DOMAINE D'UTILISATION
Le bouillon de MacConkey est utilisé comme milieu présomptif de détection des bactéries coliformes dans l'eau le
lait et les produits de la mer (huîtres).
'
PRINCIPES
- La présence de bile purifiée inhibe la croissance des microorganismes gram- positifs.
- La fermentation du lactose par les coliformes est mise en évidence par l'acidification du milieu qui provoque le
virage au jaune de l'indicateur pH (pourpre de bromocrésol), ainsi que par la production de gaz dans les cloches de
Durham.
PREPARATION
Milieu simple concentration
- Mettre en solution 35 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
- Agiter lentement jusqu'à dissolution complète.
- Répartir en tubes 16 X 160 mm contenant une cloche de Durham.
- Stériliser à l'autqclave à 120°C pendant 15 minutes.
- Après refroidissement, les cloches de Durham ne doivent pas contenir d'air.
Milieu double concentration
- Mettre en solution 70 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
- Agiter lentement jusqu'à dissolution complète.
- Répartir en tubes 20 X 200 mm (sans cloche de Durham) à raison de 10 ml par tube.
- Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 minutes.
MODE D'EMPLOI
Milieu simple concentration
- Ensemencer les tubes avec 1 ml d'inoculum et de ses dilutions décimales successives.
Milieu double concentration
- Ensemencer les tubes avec 10 ml d'inoculum.
- Recouvrir d'un bouchon de gélose stérile (Agar type E) préalablement maintenue à 48°C.
Incubation
- Pour les coliformes, incuber pendant 24 heures à 30, 32 ou 3rC suivant la norme analytique à respecter.
- Pour les coliformes thermotolérant, incuber 24 heures à 44,5°C.
- A partir des tubes à double concentration, transférer un ose bouclée de culture dans un tube à simple
concentration et incuber à nouveau pendant 24 heures avant d'effectuer la lecture.
LECTURE
La fermentation du lactose qui se traduit par l'apparition de gaz dans les cloches de Durham (volume au minimum
égal au 1/10ème du volume de la cloche) en 24 heures, indique le présence de coliformes.
L'identification des germes peut être pratiquée à partir des tubes gazogènes au moyen de subcultures sur des
milieux gélosés appropriés:
.
- gélose lactosée au pourpre de bromocrésol (BK 023)
- gélose E.M.B. selon Levine (BK 056).
fORMULE-TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: -
Tryptone
Bile de boeuf bactériologique
Lactose
Pourpre de bromocrésol
..
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,3 ± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 14,2 litres de milieu.
51
20,00 g
5,00 g
10,00 g
0,01 g
GELOSE DE MACCONKEV
DOMAINE D'UTILISATION
La gélose de MacConkey est un milieu sélectif utilisé pour l'isolement des Salmonella, des Shigella, ainsi que des
bactéries coliformes dans les eaux, les produits alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques. Sa
formule est recommandée dans la pharmacopée française et dans la pharmacopée américaine pour le contrôle des
contaminations microbiennes.
PRINCIPES
- L'inhibition des microorganismes gram-positifs est due à la présence de sels biliaires et de cristal violet. Ce colorant
inhibe principalement le développement des entérocoques et des staphylocoques.
- La fermentation du lactose en acide est révélée en présence de rouge neutre par la formation de colonies roses ou
rouges.
- Les microorganismes lactose-négatifs présentent des colonies incolores.
- Le milieu peut être additionné de M.U.G. (4-méthyl-umbelliféryl-B-D-glucuronide) afin de détecter Escherichia coli.
PREPARATION
-
Mettre en suspension 50 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Porter à ébullition lentement, en agitant jusqu'à dissolution complète.
Répartir en tubes ou en flacons.
Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 minutes.
MODE D'EMPLOI
-
Refroidir et maintenir le milieu à 48°C.
Couler en boîtes de Petri stériles.
Laisser solidifier sur une surface froide.
Faire sécher les boîtes à l'étuve, couvercle entrouvert.
Ensemencer en stries l'inoculum à la surface des boîtes afin d'obtenir des colonies isolées.
Ensemencer simultanément un milieu non sélectif tel que la gélose lactosée au pourpre de bromocrésol (BK 023).
Incuber à 3JOC de 18 à 24 heures.
LECTURE
Les colonies lactose-positives présentent une coloration rouge et sont entourées d'un halo de sels biliaires précipités.
Les colonies lactose-négatives sont incolores.
fORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: -
Peptone pancréatique de gélatine
Tryptone
Peptone pepsique de viande
Lactose
Sels biliaires
Chlorure de sodium
Rouge neutre
Cristal violet
Agar agar bactériologique
17,0 g
1,5 g
1,5 g
10,0 g
1,5 g
.. 5,0 g
. 30 mg
1 mg
13,5 g
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,1± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 10,0 litres de milieu.
CONTROLE QUALITE
- Milieu déshydraté: poudre beige-rosé, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose rouge-violacé, légèrement opalescente.
- Réponse culturale typique après 24 heures d'incubation à 3JOC:
52
GELOSE DE MUELLER HINTON
DOMAINE D'UTILISATION
Le milieu de Mueller Hinton est reconnu par tous les experts comme étant le milieu de référence pour l'étude de la
sensibilité des germes aux antibiotiques et aux sulfamides. Il convient également à l'isolement .des Neisseria et
constitue un excellent milieu de base pour la fabrication de géloses au sang.
HISTORIQUE
Dans leurs travaux de mise au point d'un milieu transparent capable de résister à l'autoclavage, Mueller et Hinton ont
sélectionné le miliE)u complexe de Gordon et Hine pour essayer d'en déterminer les composants essentiels. Les
auteurs ont trouvé que l'amidon pouvait remplacer l'extrait de pois comme élément nutritif et aussi comme agent
protecteur agissant contre les substances toxiques présentes dans le milieu. Par la suite, ils trouvèrent que la
peptone pancréatique de viande pouvait être remplacée par de l'hydrolysat acide de caséine, favorisant ainsi la
croissance des gonocoques et des méningocoques.
En 1966, Bauer, Kirby, Shervis et Turck recommandèrent le milieu de Mueller Hinton pour l'étude de la sensibilité des
germes aux antibiotiques par la méthode des disques. Enfin, une procédure standardisée de contrôle a été publiée
par le "National Committee for Clinical Laboratory Standards" pour la méthode de Kirby-Bauer.
Dépôt des disques et incubation
- Poser les disques en appuyant légèrement pour qu'ils adhèrent bien à la gélose.
- Les disposer à 15 mm minimum de la périphérie de la boîte de manière à ce que les zones d'inhibition ne se
chevauchent pas.
LECTURE
Mesurer la zone d'inhibition à l'aide d'un compas.
Se rapporter aux tableaux d'interprétation des zones d'inhibition fournis par les fabricants de disques d'antibiotiques
pour établir les corrélations entre la zone d'inhibition et la concentration minimale inhibitrice (C.M.L).
FORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: -
Hydrolysat acide de caséine
Infusion de viande
Amidon soluble
Agar agar bactériologique
17,5 g
2,0 g
1,5 g
17,0 g
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,3 ± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 13,1 litres de milieu.
CONTROLE QUALITE
- Milieu déshydraté: poudre blanchâtre, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose de couleur ambrée, opalescente.
- Réponse culturale (*) typique après 24 heures d'incubation à 37°C:
(*) Se référer aux standards du NCCLS pour les tests de sensibilité aux antibiotiques.
STOCKAGE / CONSERVATION
- Milieu déshydraté: 15 - 30°C.
- Milieu préparé en flacons: 6 mois à 2 - SoC.
- Milieu préparé en boîtes: 1 mois à 2 - SoC.
53
PAlCAM listeria Selective Agar Base acc. to VAN NETIEN et al.
Art. n° 11755
(500 9]
flacon de supplément sélectif PALCAM Listeria selon VAN
NETIEN et al. avec l ml d'eau distillée stérile et l'ajouter
au milieu nutritif stérile refroidi à 50°e. Rincer si néces­
saire le flacon du supplément avec 1 ml d'eau distillée
stérile. Bien mélanger et couler en boîtes.
pH: 7,2 ± 0,1.
Emploi et interprétation
Avec l'agar PALCAM, Listeria monocytogenes peut être
isolé quantitativement tandis que, dans le même temps,
les bactéries gram-négatives et la plus grande partie de
la flore d'accompagnement gram-positive sont suppri­
mées. La sélectivité résulte de l'utilisation de substances
inhibant la pousse: polymyxine, acriflavine, chlorure de
lithium et cehazidime. Listeria monocytogenes hydrolyse
le glucoside esculine en glucose et esculétine. Ces
dernières formes se complexent en présence d'ions fer III
et passent du vert olive au noir pour colorer ensuite les
colonies de L. monocytogenes. Si une pousse des germes
secondaires mannitol-positifs, par ex. staphylocoques,
intervient malgré l'inhibition, elle se présente sous forme
de colonies jaunes.
Composition type g/Iitre
Peptone 23,0; amidon 1,0; chlorure de sodium 5,0;
agar-agar 13,0 (::: Agar Columbia); D[-j-mannitol 10,0;
ammonium fer-Ill-citrate 0,5; esculine 0,8; glucose 0,5;
chlorure de lithium 15,0; rouge de phénol 0,08.
Préparation
Ensemencer le milieu par la méthode d'ensemencement
en surface et incuber ensuite de 30 à 37°C jusqu'à 48
heures de préférence sous atmosphère microaérophile (à
préparer avec Anaérocult® C ou Anaérocult® C mini).
Listeria monocytogenes pousse sous forme de colonies
gris-vert avec halo brun-noir. Si les colonies sont très den.
ses, l'ensemble du milieu de culture peut se colorer en
brun-noir.
Si, en dépit de la haute sélectivité de l'agar PALCAM,
une pousse d'entérocoques ou de staphylocoques manni·
toi-positifs intervient, celle-ci donnera des colonies jaunes
auréolées également de jaune.
Procéder à une identification biochimique plus précise.
Les colonies suspectes doivent être confirmées dans tous
les cas par des tests biochimiques et sérologiques.
Additifs et produits auxiliaires
Merck Art. n°
Produit
12122
Supplément sélectif PALCAM listeria
Dissoudre 34,4 g dans 500 ml d'eau déminéralisée,
autoclaver 115 min. à 121°C). Dissoudre le contenu d'un
selon VAN NETTEN et al.
. : S. : o_=_uc_=_h:. : e_=_s..: te:. : s. : t
!
..
Listeria monocytogenes ArCC 19118
. _..
Listeria monocytogenes ArCC 7644
=-=-:..:..:::....:.:.:.::..:..:..:...:..!......~~...:...::....:...::.-=-------------
~~~ance
__ ,
bonne
;
bonne
.
bonne
.. ;~----~_....:.- ...- - _ ....
-i
Halo no~
!
+
_---;-'_
.... _ . _ - - - - - ._--
,
+
.. --.--.L---·-··-----------i----·.. ---------~
Lisleria innocua
,
+
. . . . . . : : - - = . . . . . . : : - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -...---... ---1··-----_·_---------:-_·_---_·_·_-_·_--
. _..;.__..__a_u_c_un_~ __ .__-;----
Staphylococcus aureus ArCC 25923
Streplococcus faecalis ArCC 19433
_
aucune
---- --i--' ---------;--------­
~E::..,ry~s:.:.Jip:..:e:..:.:lo:..:t_=_hr:..:.ix:.:....::in:..::s.:..:id_=_io_=_s:..:a=__
..._.
...._ _a_u.c_u_n_e__.__._.__..
Escherichia coli ATCC 25922
aucune
....:....:..:..........:...::...::....::._...:...::....:...::.-=--=------------_.. ----- _. - - _ . _
----
PAlCAM listeria Selective Supplement acc. to VAN NETIEN et al.
o.
._ _
•
__
Art. n° 12122
(emballage de 16 flacons)
Composition (par flacon)
Sulfate de polymyxine-B 5,0 mg; cehazidime 10,0 mg;
acriflavine 2,5 mg.
Mode d'action
Emploi
Le PALCAM supplément sélectif pour Listeria est un
mélange de deux antibiotiques et d'un colorant sous
forme lyophilisée. Il inhibe largement la flore secondaire
pendant la culture sélective de Listeria monocytogenes.
Dissoudre le Iyophilisat dans le flacon d'origine par
l'addition d'eau distillée stérile (env. 1 ml). Ajouter le
contenu d'un flacon à 500 ml de milieu de base stérile,
refroidi à environ 50-45°C et homogénéiser.
54
DÉNOMBREMENT (P.CA.)
(gélose standard avec glucose)
La gélose standard pour dénombrement (P .C.A.) est préparée selon la
norme française N.F. 04-505 et les recommandations de 1"'American
Public Health Association".
Elle est utilisée pour le dénombrement des aérobies totaux dans les
eaux, le lait, les viandes et produits à base de viande, et autres
denrées alimentaires.
Formule
• Peptone
• Extrait de levure.
(en gremmes
per litre
d'eeu distillée)
5
2.5
1
• Glucose.
• Agar.
15
pH final: 7.0
Préparation
± 0.2
Mettre 23,5 g de poudre dans 1 litre d'eau distillée.
Attendre 5 minutes, puis mélanger jusqu'à obtention d'une suspen­
sion homogène.
Chauffer lentement en agitant fréquemment puis porter à ébullition
jusqu'à dissolution complète.
Ajuster, si nécessaire, le pH à 7,0.
Répartir, puis stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
(déshvdratée)
Utilisation
1) Ensemencement en profondeur:
Placer dans des boîtes de Petri stériles 1ml de l'échantillon homo­
généisé ou 1 ml des différentes dilutions (en solution de Ringer au
114 ou en Tryptone-sel). Verser rapidement dans chacune 10 à
15 ml de milieu de culture fondu et ramené à la température de
45-50 oC environ. Homogénéiser parfaitement. Après solidifica­
tion, recouvrir avec une couche de gélose blanche; lorsque cette
couche est solidifiée, retourner les boîtes et les incuber dans cette
position.
2) Ensemencement en surface:
Couler le milieu en boîte de Petri et après refroidissement, déposer
à la surface 0,1 ml de l'échantillon homogénéisé ou 0,1 ml des
différentes dilutions. Étaler l'inoculum rapidement et soigneuse­
ment à l'aide d'un étaleur en verre stérile. Retourner les boîtes et
les incuber dans cette position.
La température et la durée d'incubation varient selon les bactéries
que l'on désire dénombrer (mésophiles, psychrotrophes, thermo­
philes).
Lecture
Dénombrer les colonies dans les boîtes qui contiennent au moins 30
et au plus 300 colonies. Exprimer le résultat par 1 ml ou par 1 g de
l'échantillon examiné.
Gélose au Sang (milieu de base)
Culture des pneumocoques r streptocoques et germes exigeants
.' 5J43.1
51433
Q~a'is~o.e"'··5~Q,gQ:.S.·.4.h.?~~até,:,.
.
Miliel.l>pr'êt à l'emploi:
4'1435Flacond,iilQOiril
.
Le milieu de base pour Gélose au sang
convient très bien à la culture des germes
exigeants. Il peut être utilisé pour la mise en
évidence des germe~ hémolytiques.
Formule en g/I d'eau distillée:
Infusion de cœur et de muscle
375
bio-Thione
10
Chlorure de sodium
5
Gélose....................................
15
pH 7.3
PRÉPARATION
Mettre en suspension 40 g de poudre dans 1 litre d'eau distillée. Laisser reposer 5 min.,
puis mélanger. Chauffer en agitant fréquemment. Porter à ébullition 1 minute. Répartir
et stériliser à l'autoclave à 120° C pendant 20 minutes (pour des quantités de l'ordre de
100 ml). Après autoclavage, agiter les flacons pour assurer une distribution homogène
des composants du milieu. Si le milieu est réparti en tubes, stériliser 15 min. à 120° C.
UTILISATION
- Préparation d'une gélose au sang:
Ajouter 5 à 10 % de sang défibriné stérile à la gélose stérile fondue puis refroidie à 45° C
environ. Agiter par rotation pour mélanger en évitant d'inclure des bulles d'air dans la
gélose. Couler en boîtes de Pétri. Ensemencer et incuber 18 à 24 heures à 37° C.
Au cours d'une étude portant sur les streptocoques, Snavely et Brahier ont comparé les
résultats obtenus avec les sangs de cheval, de lapin et de mouton, et constaté que le sang
de mouton donnait les meilleurs résultats tant du point de vue de l'aspect des colonies
et de leur nombre, que de la netteté des zones d'hémolyse, aussi bien en 24 heures qu'en
48 heures.
Remarque
Pour les prélèvements pharyngés, le sang de mouton présente certains avantages sur le
sang de cheval: bien que de qualité équivalente pour la révélation de l'hémolysine du
Streptocoque A, le sang de mouton révèle moins souvent les hémolysines 13 de certains
Streptocoques D et inhibe les haemophilus hémolytiques. Le dépistage des colonies de
Streptocoque A s'en trouve ainsi facilité.
L'association acide nalidixique + colimycine (mélange ANC lyophilisé, Réf. 5567 1) est
un excellent inhibiteur pour la flore bactérienne Gram (-) et des Bacillus. Les autres ger­
mes aérobies Gram (+) cultivent bien, et aucun effet inhibiteur n'est observé à l'encontre
des Streptocoques.
- Préparation des antigènes:
Schubert et al. l'ont employé par exemple pour la préparation de l'antigène Vi de S. typhi.
55
BOUILLON AU CHLORURE DE MAGNESIUM ET
AU VERT MALACHITE (Rappaport-Vassiliadis)
DOMAINE D'UTILISATION
Le bouillon au chlorure de magnésium et au vert malachite de Rappaport et Vassiliadis est utilisé pour l'enri­
chissement sélectif des Salmonella dans les produits alimentaires, l'eau et les autres prélèvements susceptibles d'en
contenir.
HISTORIQUE
La composition du milieu a été développée par Rappaport comme suite à l'observation de la plus grande résistance
des Salmonella aux milieux hypertoniques que la plupart des autres entérobactéries.
Dans ses expérimentations, Rappaport démontra que le chlorure de magnésium s'avérait être le plus efficace de tous
les sels testés. Par addition de vert malachite, il augmenta la sélectivité du milieu . Vassiliadis a par ailleurs montré
que pour récupérer un grand nombre de Salmonella, il fallait réduire la teneur en vert malachite et porter l'incubation
de 37 à 43°C. Par la suite, les travaux de Peterz et coll. ont déterminé les incidences de la température d'incubation
et de la teneur en chlorure de magnésium sur le pouvoir récupérateur du milieu.
PRINCIPES
- La forte concentration en chlorure de magnésium ainsi que la présence de vert malachite ralentissent la croissance
des germes autres que les salmonelles.
- La culture de Salmonella typhi et des Shigella est inhibée par le vert malachite.
- L'utilisation en parallèle de bouillon au sélénite et de bouillon de Rappaport-Vassiliadis est recommandée pour les
prélèvements contaminés par Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis et par d'autres sérotypes de salmonelles.
PREPARATION
-
Mettre en solution 26,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Agiter lentement jusqu'à dissolution complète.
Répartir en tubes ou en flacons.
Stériliser à l'autoclave à 115°C pendant 15 minutes.
MODE D'EMPLOI
- Refroidir le milieu jusqu'à 25°C.
- Transférer 1 ml d'inoculum dans 100 ml de bouillon (respecter le ratio: 1/100), à partir d'un milieu de
préenrichissement: bouillon nutritif lactosé (BK 082) ou eau peptonée tamponnée (BK 018, BK 131).
-Incuber à 42°C pendant 24 heures.
- Effectuer un isolement sur plusieurs milieux sélectifs pour salmonelles: gélose au vert brillant et au rouge de phénol
(BK 091), gélose au désoxycholate citrate lactose saccharose (BK 085), gélose X.LD. (BK 058), gélose Hektoen
(BK 067), au moyen d'une anse bouclée.
FORMULE-TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: -
Tryptone
.
Chlorure de sodium .
Phosphate monopotassique ...
Chlorure de magnésium anhydre.
Vert malachite (oxalate) .
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 5,2 ± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 18,8 litres de milieu.
CONTROLE QUALITE
- Milieu déshydraté: poudre bleuâtre, fluide et homogène.
- Milieu préparé: solution bleue, limpide, sans précipité significatif.
56
.
4,50 g
7,20 g
.1,44 g
........ 13,30 g
..36 mg
.
GELOSE DE SABOURAUD
DOMAINE D'UTILISATION
La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des
moisissures saprophytes ou pathogènes.
Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en
bactéries, les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des
moisissures en vue de réaliser leur identification.
Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloram­
phénicol.
La gélose de Sabouraud peut servir de base à la préparation de milieux spéciaux par addition d'antibiotiques
(chloramphénicol, gentamicine), de sang ou de vitamines.
L'ajout de triphényltétrazolium à raison de 100 mg par litre en fait un milieu de différenciation pour les Candida.
PRINCIPES
La gélose de Sabouraud est un milieu peptoné et glucosé permettant la croissance des levures, des moisissures, et
en particulier des dermatophytes.
PREPARATION
-
Mettre en suspension 60 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Porter à ébullition lentement, en agitant jusqu'à dissolution complète.
Répartir en tubes ou en flacons.
Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 minutes.
NOTA:
Tout chauffage excessif du milieu conduit à la dénaturation de l'agar en pH acide et par conséquent à l'obtention
d'un milieu trop mou.
MODE D'EMPLOI
- Refroidir et maintenir le milieu à 48°C.
- Ajouter éventuellement le contenu d'un flacon de supplément sélectif reconstitué: gentamicine (SM 009) oulet
chloramphénicol (SM 021) à 500 ml de milieu.
- Bien homogénéiser l'ensemble.
- Couler en boîtes de Petri stériles.
- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire sécher les boîtes à l'étuve, couvercle entrouvert.
- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu.
- Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur stérile.
- Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours.
LECTURE / INTERPRETATION
Les boîtes doivent être examinées chaque semaine, pendant plusieurs semaines avant de conclure à l'absence de
cultures.
Dénombrer séparément les levures et les moisissures.
Faire les observations microscopiques et les tests spécifiques appropriés pour confirmer les résultats.
FORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: - Peptone pepsique de viande
- Glucose
.
,.,.,
,­
- Agar agar bactériologique
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 5,7 ± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 8.3 litres de milieu.
CONTROLE QUALITE
- Milieu déshydraté: poudre blanc-crème, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose ambre-clair, légèrement opalescente.
- Réponse culturale typique après 72 heures d'incubation à 25 - 30°C:
57
.
.
........10 g
...:.35g
. .. 15 g
BOUILLON SELENITE-CYSTINE
DOMAINE D'UTILISATION
Le bouillon sélénite-cystine est utilisé pour l'enrichissement sélectif des salmonelles dans les produits
pharmaceutiques, les produits laitiers et les autres produits alimentaires.
HISTORIQUE
Guth, confirmant les premières observations de Handel et Thodorascu, a employé le sélénite de sodium comme
agent sélectif dans un bouillon d'enrichissement pour Salmonella typhi, après avoir mis en évidence la toxicité de
cette substance vis-à-vis d'Escherichia coli.
Leifson, reprenant les travaux de Guth, a développé la formule d'un bouillon au sélénite pour l'enrichissement sélectif
des Salmonella typhi et paratyphi à partir de prélèvements pathologiques en montrant que pendant les douze
premières heures d'incubation, le nombre de coliformes diminuait tandis que parallèlement le nombre de bacilles
typhiques augmentait rapidement.
Le bouillon sélénite-cystine constitue une modification de la formule originale de Leifson.
Cette formulation a été proposée par la Food and Drug Administration pour une utilisation spécialement destinée à la
détection des Salmonella dans les produits alimentaires. La composition est conforme à la pharmacopée américaine.
PRINCIPES
- La teneur en sélénite permet d'assurer l'inhibition des microorganismes autres que les salmonelles et notamment
des coliformes et des entérocoques. Les Pseudomonas et les Proteus ne sont pas inhibés,
- Le phosphate disodique contribue à assurer le maintien du pH et à réduire la toxicité du sélénite afin d'augmenter la
capacité de récupération du milieu.
l'REl'ARAliON
-
Mettre en suspension 23 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Porter à ébullition lentement, en agitant jusqu'à dissolution complète,
Maintenir l'ébullition pendant 2 minutes.
Ne pas autoclaver.
Refroidir rapidement.
Répartir en tubes ou en flacons stériles en remplissant les contenants aux 2/3 de leur capacité maximale.
NOTA:
- Une surchauffe entraîne l'apparition d'un sédiment rouge brique de sélénium précipité qui dénature le milieu. Celui­
ci doit alors être détruit.
- Afin d'augmenter la durée de conservation du milieu prêt à l'emploi, il est recommandé d'utiliser la technique de
stérilisation par filtration sur membrane.
MODE D'EMPLOI
- Refroidir le milieu jusqu'à 25°C.
- Transférer 10 ml d'inoculum dans 100 ml de bouillon sélénite-cystine, à partir d'un milieu de préenrichissement
(bouillon nutritif lactosé BK 082 ou eau peptonée tamponnée BK 018, BK 131),
- Incuber pendant une durée maximale de 24 heures à 3rC ou à 43°C, suivant la norme analytique à respecter.
- Effectuer un isolement sur plusieurs milieux sélectifs:
- Gélose au vert brillant et au rouge de phénol (BK 091).
- Gélose au désoxycholate citrate lactose saccharose (BK 085),
- Gélose X.LD. (BK 058).
- A partir des colonies bien isolées, on inoculera une gélose de Kligler (BK 034) ou une gélose T.S.1. (BK 059), qui
serviront de point de départ pour l'identification.
NOTA:
Ne' pas dépasser une durée d'incubation de 24 heures en raison de ~a diminution d~ l'effet in,hibiteur après les 12
premières heures; les salmonelles étant rapidement détruites au dela de cette duree lorsqu elles se trouvent en
présence de puissants compétiteurs comme les Proteus.
Par contre, une durée de 48 heures est requise pour l'enrichissement sélectif de Salmonella pul/orum.
fORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obten'Ir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: -
..
Tryptone .
Lactose
.
Phosphate disodique .
Sélénite de sodium .
L-cystine .'
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,0 ± 0,2.
58
5g
4g
... 10 g
... 4 g
.... 10 mg
Milieu TCBS
SLANETZ et BARTLEY
(milieu de base et milieu complet)
MILIEU T.C.B.S. POUR ISOLEMENT DU VIBRION
CHOLËRIQUE
La gélose de Slanetz et Bartley est un milieu qui permet la recherche
et le dénombrement des streptocoques fécaux dans les eaux, par
utilisation de membranes filtrantes.
formule
(an
Q~mm ••
d·.. u
dl.tUlh)
p.r IItr.
Milieu de base
•
HydrolYl4t trypsiqut d. cashine
.• Elttrait d. levure. . .
• Gluco.e
.
• Phosp"ate d,sodique
• Alida de sodium. .
• Agir
.
Milieu complet
même formule que milieu de base +
• Chlorure d. triph'nva.tr.zolium (T.T.C.). . .
(pour 1.. deux) pH final: 7,2 ± 0.2
. 20
5
2
4
Ce milieu est particulièrement recommandé pour la croissance de
Vibrio cholerae, Vibrio el tor, Vibrio parahaemolyticus et alginolyticus.
Formule
(en gramme.
par litre
d'eau dl.tlllée)
0,4
10
........
0.1
Peptone . . . . .
Extrait de levure .
Citrate de sodium
Thiosulfate de sodium
Chlorure de sodium
Bile de bœuf. .
Citrate ferrique. . .
Saccharose . . . .
Bleu de bromothymol.
Bleu de thymol.
Agar
10
5
10
10
10
8
1
20
0,04
0,04
14
.
pH : 8,6 (environ)
Préparation
ldbhy~r.th)
Utilisation
Milleu da basa
Mettre 41.4 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée.
Attendre 5 minutes, puis mélanger jusqu'à obtention d'une suspen­
sion homogène.
Chauffer lentement en agitant fréquemment, puis porter li ébullition ­
jusqu'à dissolution complète.
Après filtration de l'eau à examiner, la membrane est déposée li la
surface du milieu.
Incubation li 37 oC pendant 24 heures ou pendant 48 heures, si
aucune colonie n'est apparue au cours des premières 24 heures.
Dans un but de revivification de bactéries déficientes, l'incubation
peut avoir lieu en deux temps et li deux températures différentes:
e 4 heures li 37 oC,
• 48 heures li 44-45 oC.
Les streptocoques fécaux apparaissent sur cette gélose sous l'aspect
de colonies d'un rouge violacé ou marron, avec ou sans auréole
blanche.
Remarqua:
Les streptocoques fécaux éventuellement présents dans les aliments
peuvent égelement être recherchés sur ce mîiieu. Les échantillons à
analyser sont préalablement dilués en eau physiologique de façon à
obtenir 15 li 150 colonies environ par boite.
Préparation
Verser 88 9 de poudre dans 1 litre d'eau distillée. Porter à ébullition
jusqu'à dissolution complète. NE PAS AUTOCLA VER. Couler en
boites de Petri et laisser sécher. avant utilisation.
Utilisation -La plupart des bactéries sont inhibées au moins.pe.ndant 24 heures ..
Toutefois, certaines colonies de Pro/eus ou de S/rep/ococcus faecalis
peuvent apparaître sur le milieu mais elles sont aisément reconnais­
sables par rapport aux colonies de Vibrio.
Ce milieu permet une croissance abondante des souches de vibrio
lors d'une incubation d'une nuit à 37 ·C.
Lecture
Colonie jaune brun, 2 à 3 mm de diamètre: V. cholerae.
Colonie incolore à centre vert, 3 à 4 mm de diamètre: V. parahaemo­
Iyticus.
Le milieu ne secolore-p-as en iaune-pour les petitescolonies-suivantes
qui pourraient apparaître': E. coli, Salmonel/a /yphi; Klebsiel/a-, Shigel/a.
Pseudomonas aeruginosa. Pro/eus.
GELOSE SALMONELLA· SHIGELLA
DOMAINE D'UTILISATION
La gélose Salmonella - Shigella est utilisée pour l'isolement des salmonelles et des shigelles dans les produits
alimentaires ainsI que dans les autres prélèvements susceptibles d'en contenir, après enrichissement préalable,
PRINCIPES
- La gélose S,S. est un milieu modérément sélectif où l'inhibition des microorganismes gram-positifs est due à la
présence de sels biliaires, de vert brillant et de citrate de sodium.
- Les concentrations élevées en citrate et thiosulfate de sodium limitent le développement des coliformes et évitent
l'envahissement du milieu par les Proteus.
- La fermentation du lactose en acide est révélée en présence de rouge neutre par la formation de colonies rouges.
Les microorganismes lactose-négatifs présentent des colonies incolores.
- En présence de thiosulfate et de citrate ferrique, les microorganismes producteurs de sulfure d'hydrogène donnent
des colonies à centre noir,
- Il est particulièrement recommandé de réaliser au préalable un enrichissement sur un bouillon au sélénite ou sur un
bouillon au sélénite-cystine et d'ensemencer simultanément d'autres milieux moins sélectifs:
.. gélose de MàcConkey
- gélose Hektoen
- gélose X,L.D.
PREPARATION
-
Mettre en suspension 63 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Porter à ébullition lentement, en agitant jusqu'à dissolution complète.
Maintenir l'ébullition pendant 2 minutes.
Ne pas autoclaver.
MODE D'EMPLOI
-
Refroidir et maintenir le milieu à 48°C.
Couler en boîtes de Petri stériles,
Laisser solidifier sur une surface froide.
Faire sécher les boît,es à l'étuve, couvercle entrouvert,
Ensemencer en stries l'inoculum à partir des milieux d'enrichissement utilisés.
Transférer parallèlement l'inoculum sur un autre milieu sélectif.
Incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures,
LECTURE
Les Salmonella qui ne fermentent pas le lactose présentent des colonies incolores, transparentes, avec ou sans
centre noir (production d'H2S),
Les Shigella sont incolores.
Les coliformes présentent des colonies rouges ou rosées.
Les colonies suspectes seront repiquées sur gélose de Kligler (BK 034) ou T.S.I. (BK 059) en vue de leur identification
ultérieure.
FORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales).
Pour 1 litre de milieu: :... Peptone pancréatique de viande
- Extrait de viande ..
- Lactose.
- Sels biliaires
- Citrate de sodium
- Thiosulfate de sodium
- Citrate ferrique ammoniacal ...
- Rouge neutre
- Vert brillant ,
- Agar agar bactériologique ...
.
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,0 ± 0,2.
500 g de poudre permettent de préparer 7,9 litres de milieu.
CONTROLE QUALITE
- Milieu déshydraté: poudre rosée, fluide et homogène.
- Milieu préparé: gélose rose-orangé, très légèrement opalescente.
- Réponse culturale typique après 24 heures d'incubation à 37°C:
60
..5,Og
5,Og
".,,10,Og
8,5g
",10.0g
8.5g
.................... 1,Og
.
25 mg
"
0.33 mg
..... 15,Og
T.S.C.
(tryptone-su Ifite-cycloséri ne)
(gélose de base)
Le milieu T.S.C. est utilisé pour le dénombrement des anaérobies
sulfito-réducteurs et, tout particulièrement, pour celui de Clostridium
perfringens dans les produits alimentaires.
Décrit par HARMON (1), il a fait l'objet d'études comparatives avec
d'autres milieux (2, 3) et donne de bons résultats lors de la recherche
de cette bactérie dans les eaux par la méthode de filtration sur
membrane (4).
Il est recommandé comme milieu de dénombrement des anaérobies
sulfito-réducteurs dans l'arrêté ministériel du 29 décembre 1979 (5).
Formule
(en gramm••
par IItr.
d' eau di.tillé.,
•
•
•
•
•
•
Tryplone
.
Soytone
.
Extrait de levure. .
Métebisulfite de sodium anhydre.
Citrate de fer ammoniacal
Agar
.
pH final: 7.6 :t 0.2
. 15
5
5
1
1
15
Préparation
Mettre 42 g de poudre dans 1 litre d'eau distillée.
Attendre 5 minutes, puis mélanger jusqu'à obtention d'une suspen·
sion homogène.
Chauffer lentement en agitant fréquemment, puis porter à ébullition
jusqu'à dissolution comp~te.
Ajuster, si nécessaire, le pH à 7,6.
Répartir en tubes ou en flacons et stériliser à l'autoclave à 121°C
pendant 15 minutes. Ce milieu doit être conservé à + 2-8 OC durant un
maximum de 15 jours.
Utilisation
et lecture
1. Milieu de base + Cyclosérine
Au moment de l'emploi, ajouter à 100 ml de milieu de base fondu.
puis refroidi à 45-50 oC :
• 1 ml d'une solution à 4 % de D. cyclosérine stérilisée par filtra·
tion.
Un millilitre de chacune des dilutions décimales du produit a
analyser sont placés dans une série de boites de Petri vides, puis le
milieu ramené à la température de 50 oC environ est coulé à raison
de 20 ml par boite.
Après homogénéisation et solidification, les boites sont incubées a
37 oC ou à 46 oC pendant 24 heures en anaérobioses. La tempéra­
ture de 46 oC renforce la sélectivité du milieu vis-à-vis de Clostri·
dium perfringens.
Les colonies d'anaérobies sulfito-réducteurs sont entourées
d'auréoles noires.
2. Milieu de base + Cyclosérine + jaune d'œuf
La formule précédente peut être additionnée de jaune d'œuf:
• 8 ml d'une solution à 50 %en eau physiologique pour 101 ml de
la préparation précédente.
Dans ce cas, les dilutions décimales du produit sont étalées a
raison de 0,1 ml par boite. L'incubation est réalisée à 37 oC en
anaérobiose pendant 24 heures.
Les colonies de Clostridium perfringens sont noires et habituelle­
ment entourées d'une auréole opaque due à la lécithinase de cette
bactérie.
Présentation
.Conservation
Milieu déshydraté
• boite de 450 g
Code: 69 641
Boite soigneusement fermée dans un endroit frais et sec.
La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le condl'
tionnement.
61
Gélose lactosée au T.T.C.
et tergitol
b) Après 16 à 24 heures d'incubation à 44'C :
Colonies jaunes
Halos profonds jaunes
4 % sont des Klebsiella d'origine fécale.
Le dénombrement',des colonies jaunes à halos donnera le nombre
d'E. coli présents dans le volume d'eau filtrée sur la membrane
incubée à 44 ·C. Il sera évalué pour 100 ml.
Les divers Coliformes doivent ensuite être identifiés.
(base déshydratée)
La gélose de Chapman lactosée au T.T.C. et au tergitol 7 est un
milieu solide qui permet la recherche et le dénombrement des Coli­
formes. Il est utilisé surtout pour la colimétrie des eaux par la méthode
des membranes fIltrar,tes.
Formule
(en 9tammes
par litre
d'eau distillee)
Extr.lit de vl,lndl::"
5
Pt'ptone .
10
Edr.llt de 1I:",Jurt:>
6
Lactose
Bleu de bromoth~mol
Agar.
,
.
pH final = 7.2
Préparation
Milieu Viande-foie 'complet
20
0,05
14
Mettre 54 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée. Attendre
5 minutes. puis mélanger jusqu'à obtention d'une suspension homo­
gène, Chau Rer lentement, en agitant fréquemment, puis porter à
l'ébullition iusqu'à complète dissolution.
Ajuster si nécessaire le pH à 7,2. Répartir à raison de 100 ml par
flacon de 150 ml, puis stériliser à l'autoclave â 115'C pendant
20 mi'l1utes,
(Sulfite-citrate)
La miliau vianda·foia complat est utilisé pour la racherche et le dénombre­
ment des spores de Clostridium sulfito-r'ducteurs, dans les produits ali­
mentaires.
Fonnule
(en gremmu
par 111.­
d'eau dia\illbl
Utilisation
Faire fondre le milieu de base au bain-marie bouillant, le refroidir à
45-50'C et ajouter à 100 ml :
5 ml de solution stérile de chlorure de 2-3-5 tripbényltétrazolium
(T.T.C.) à 0,05 % en eau distillée;
-,5 'ml de solution de Tergitol 7 à 0,2 % en eau distillée.
Bien mélanger la base gélosée et les solutions, en évitant la forma­
tion de bulles. Couler en boites de Petri stériles. L'épaisseur du
milieu dans la boite doit être d'au moins 5 mm. Les milieux ainsi
répartis peuvent être conservés à + 4·C pendant 8 jours.
Au moment de l'emploi, sécher les boites à l'étuve à 37 'C, cou­
vercle ouvert, selon la technique habituelle.
Si l'on utilise la méthode des membranes filtrantes: pour chaque
écha~tillèln à analyser, utiliser au moins deux membranes qui 'seront
placées sur deux boites de milieu. L'une est incubée à 37·C pen­
dant 24 heures, l'autre est incubée à 44' !, l'C en atmosphère
humide, pendant 16 à 24 heures.
a) Après 24 r.eures d'incubation à 37'C :
La lecture nécessite:
- I;examen des colonies. Leur coloration est due à la réduction
(couleur violette) ou à l'absence de réduction (couleur jaune) du
triphényltétrazolium;
- l'e:xamen des halos dans la couche de gélose sous-Jacente aux
colonies. Ces halos indiquent l'absence de fermentation (bleu)
oü la fermentation du lactose (jaune).
Colonies jau nes
Escherichia coli, Ci/robac/er, Klebsiella aeroHalos profonds jaunes genes, En/erobac/er.
Le 'dénombrement de ces colonies do'nnera le nombre présomptif
des Coliformes présents dans le volume d'eau filtrée sur la membrane
incubée à 37 ·C.
BaSil Viande-Foie . . . . . . . . . . • • . • . • • . • . • . . • • • . . .
Glucose . . . . . . . . . . . • . • • . . . • • . . . • • • • . • • • , •..•..•
Amidon . . . . . . • . . • • • • . . . • . . . . . • . . ,., •.. , ••..•••
Sulfite de sodium, . • '. . . • . . . . . • . . • . • • • . • . . . • • . • • • • ••
Citrate de fer ammoniacal • . . . . • . . • . • . . . . • • . . . • . • . • • .
Agar ..•••.•.••••.•.•...•..•.•.•..••••••••••••
30
2
2
1
0,5
11
pH final - 7,2
-
Lecture
96 % de ces colonies sont des Escherichia
coli,
Pr'paratlon
Mettre 46,5 g de milieu désl:lydraté dans un litre d'eeu distillée. Attendre
5 minutes, puis mélanger jusqu'à obtention d'une suspension homogène.
Chauffer lentement, en agitant fréquemment, puis porter à l'ébullition
jusqu'à complète dissolution. Ajuster. si nécessaire, le pH à 7,2. Répartir.
raison de 20 ml de milieu par tube. Stériliser à l'autoclave. 115°C pen­
dant 20 minutes.
UtlUsation
al Chauffer 1.0 ml de l'échantillon. analyser (ou d'une dilutionl au bain­
marie à' 80 oC pendant 10 minutes, afin de détruire .les :ormes végétatives
des bactéries. Aefroidir rapidement.
'
bl Aegénérer les tubes de milieu V.F. au bain-marie bouillant pendant
20 minutes, refroidir à 55°,C.
cl Au premier tube de milieu, ajouter 5 ml de "échantillon préalablement
chauffé (al;
Au deuxième tube, ajouter 5ml d'une dilution au 1/10 ;
Au troisième tube. ajouter 5 ml d'une dilution su 1/100 ;
Au Quatrième tube, aJouter 5 ml d'une dilution au 1/1000.
Melanger doucement sans introduire d'air. Refroidir SOus l'eau du robinet.
Dans tous les cas, il est indispensable de complèter le volume du milieu il
25 ml avec de l'eau distillée stérile.
Incuber à 37°C et effectuer la lecture après 18,24 et 48 heures,
Lacture
Sur ce milieu. les Clostridium sulfito-réducteurs donnent aprb 18, 24 ou
48 heures, des colonies entourées d'una auréole noire. Les colonies de
Clos(ridlum perfringens apparaissent en générsl en 18 heures. Pour cette
espèCll, on peut rendre le milieu plus sélectif, en incubant les tubes ense­
mencés, à 46°C.
'
GELOSE LACTOSEE BILIEE AU CRISTAL VIOLET
ET AU ROUGE NEUTRE (V.R.B.L.)
DOMAINE D'UTILISATION
La gélose !actosée biliée au cristal violet et au rouge neutre est un milieu sélectif utilisé pour la recherche et le
dénombrement des coliformes dans l'eau, le lait. les produits laitiers et les autres produits alimentaires.
HISTORIQUE
Ce milieu a été étudié. par un grand nombre de chercheurs: MacCrady en 1932 pour le "Committee on Standards
Methods of Milk Analysis of the American Public Health Association", puis ensuite par Bartram et Black pour
l'isolement des coliformes dans le lait cru et le lait pasteurisé, et également par Miller et Prickett dans une note
concernant la recontamination du lait. Tous ces auteurs trouvèrent le milieu satisfaisant en raison de l'obtention de
résultats complets en 24 heures d'incubation.
PRINCIPES
- La présence simultanée de cristal violet et de sels biliaires assure l'inhibition des bactéries gram-positives.
- La fermentation du lactose se traduit par une acidification révélée par le virage au rouge de l'indicateur pH (rouge
neutre) et par la précipitation d'acides biliaires autour des colonies.
- Le milieu peut être additionné de M.U.G. (4-méthyl-umbelliféryl-B-O-glucuronide) afin de détecter Escherichia coli.
(Se référer à la monographie concemant le supplément M.U.G., SM 024).
PREPARATION
-
Mettre en suspension 41,5 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée.
Porter à ébullition lentement, en agitant jusqu'à dissolution complète.
Maintenir "ébullition pendant 2 minutes.
Ne pas autoclaver.
MODE D'EMPLOI
- Refroidir et maintenir le milieu à 48°C.
- Transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales dans des boîtes de Petri stériles.
- Couler 12 ml de gélose.
- Homogénéiser parfaitement.
- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Couler à nouveau 4 ml de milieu, de façon à former une deuxième couche.
- Laisser solidifier.
.
-Incuber:
- à 30°C pendant 24 heures pour la recherche et le dénombrement des coliformes.
- à 44,SoC pour les coliformes thermotolérants. .
LECTURE
Les coliformes présentent des colonies violacées de diamètre egal ou supérieur à 0.5 mm après 24 heures
d'incubation.
Les entérobactéries lactose-négatives sont incolores.
fORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales)..
Pour 1 litre de milieu: -
Tryptone
Extrait autolytique de levure
Lactose
Sels biliaires
Chlorure de sodium
Rouge neutre
.
Cristal violet ..
.
Agar agar bactériologique
;
.
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,4 ± 0,2.
500 9 de poudre permettent de préparer 12,0 litres de milieu.
63
7,0 g
3,0 g
10,0 g
1,5 g
. 5,0 9
30 mg
. 2 mg
15,0 g