Transcript Cytometrie2014_Adriana Delwail

CYTOMETRIE EN FLUX
BD FACSVerse
BD FACSAria III
Journée de Formation et Information 17/11/2014
[email protected]
CYTOMETRIE EN FLUX
• Principe
• Applications
• Tri
Qu’est que ce la cytométrie en flux?
•
•
•
•
•
•
Individuelle
Quantitative
Qualitative
Particules en suspension
Flux liquide
Source lumineuse
CYTOMETRIE EN FLUX: Principe
Fluidique
Electronique
Optique
Fluidique
Injecteur
Liquide
de gaine
Centrage
hydrodynamique
« Flow Laminar »
Faisceau Laser
CYTOMETRIE EN FLUX:
Analyses Multiparamétrique
Paramètres
LASER
SSC
Fluorescence
FSC
FSC: Forward Scatter—lumière diffractée
Dépend de la taille et de la surface cellulaire
SSC: Side Scatter—lumière réfléchie et réfractée
Dépend de la granularité et de la complexité cellulaire
• Fluorescence : auto fluorescence, marquages avec des
anticorps ou sondes spécifiques
Optique
Detector
arrays
Collection Optics
Fiber optics
Collection lens
Laser
Laser
Laser
FSC diode
Lens
Excitation optics
Flow cell
Sample core
Structure de collecte du signal:
Heptagones
507 LP
527/32
FITC
Signaux
d’émission
du laser
bleu
Blank
665 LP
700/54
PerCP-Cy5.5
560 LP
586/42
PE
752 LP
783/56
PE-Cy7
488/15
Side scatter
Fluorochromes
Lasers
(nm)
Position PMT
et filtres (nm)
Fluorochromes
488 (bleu)
A (750 à 810 nm)
PE-Cy7
B (>670 nm)
PerCP, PerCPCy5.5
IP, PE-Cy5.5, 7-AAD
D (564 à 606 nm)
PE
(IP)
E (515 à 545 nm)
FITC
GFP, Alexa 488, CFSE
F (483 à 493 nm)
Side Scatter (SSC)
A (750 à 810 nm)
APC-Cy7
APC-H7
C (650 à 670 nm)
APC
Alexa 633, Alexa 647
A (502 à 535 nm)
B (425 à 475 nm)
AmCyan, V500
Pacific blue, V450
Pacific orange
DAPI, Cascade Blue
633 (rouge)
407 (violet)
Autres sondes
Alexa 405
http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/index.jsp
Système Electronique
Conversion signaux optiques en signaux digitaux
proportionnels
Photon
In
Signal
Out
Analog to Digital
Conversion
Digital data
to memory
Voltage In
PMT
Power Supply
Levels 0–1000 Volts
Digitize
the pulse
Sample
the pulse
Système Electronique
Analyse digitale
Field
Programmable
Gate Arrays
Digital data
in memory
Digital
Signal
Processor
Computer
PE
Height
Area
FITC
width
Applications de la CMF
 Analyse morphologique
 Immunophénotypage
 antigènes membranaires
 antigènes intracellulaires
 Analyse du contenu en ADN
 Cycle cellulaire
 Viabilité
 Prolifération cellulaire
 Suivi de l’activité génétique par l’expression d’un gène
rapporteur (GFP)
 Mesure de l’apoptose
 Phagocytose
 Stress Oxydative
 Flux ioniques
 Signalisation cellulaire …
Forward Scatter: taille
Analyse morphologique
Granulocytes
Monocytes
Lymphocytes
Side Scatter: granularité
Immunophénotypage
ACM anti-CD3
PE
ACM anti-CD4
FITC
PE
ACM anti-CD19
APC
ACM anti-CD14
PE-Cy5
FITC
CD3 ?
CD19 ?
Leucocyte
FITC+ PE+ APC- PECy5CD4+ CD3+ CD19- CD14-
CD # : Cluster de différenciation
Immunophénotypage
Lymphocytes
CD19+ CD3-
CD19+CD3+
CD19-CD3-
CD19- CD3+
Marquage intracellulaire
Perméabilisation des cellules
FITC
Leucocyte
• Production
• Signalisation …
Signalisation cellulaire
1
2
Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and
clinical applications
Peter O. Krutzik a, b, c, Jonathan M. Irish b, c, Garry P. Nolan b, c
Clinical Immunology, 2004, (110) 206- 221,
Viabilité
Cellules THP1
+
2.4 %
Thalidomide ( #
conc.)
Incubation 48 HS
+
Iodure de Propidium
Intercalant
Imperméant
3.8 %
9.5 %
99.7 %
Apoptose:
Mise en évidence des différentes étapes
Induction:
T0
Condensation T2h
Fragmentation T6h
Chute du potentiel membranaire mitochondrial
(DiOC6)
Altérations de la membrane plasmique (Annexine V)
Expression des caspases, famille Bcl-2
Fragmentation DNA (TUNEL)
Apoptose: DiOC6
Détection des altérations de
potentiel de membrane
DiOC6: carbocyanines
La fluorescence est modifiée selon
l’environnement électrique
Cellules JURKAT +
Camptothecin (18 HS)
Apoptose: Annexine V
Détection des altérations de la membrane plasmique
Extériorisation des phosphatidyl-sérines (PS)
Annexine V: forte affinité pour résidues PS
Annexine V - APC
Cellules JURKAT
Cellules JURKAT +
camptothecin (4 HS)
Phagocytose
FITC
FITC-Labeled beads
Neutrophile
Cycle Cellulaire
Les Fluorochromes:
 DAPI
 Hoechst
 Chromomycine A3
 Iodure de Propidium
 Bromure d’éthidium
 Acridine Orange
 7-ADD
 TO-PRO-3
 Vybrant Dye Cycle
Caractéristiques:
 Spectre de fluorescence
 Mode de liaison aux acides
nucléiques
 Hydrosolubilité Liposolubilité
Flux calcique : Différentiation des sous populations
lymphocytaires
Th 2
Th1
Sonde: Fluo-3/AM
Ex-max: 506 nm
Em-max: 526 nm
Gergely T et al., Immunology 2012
Avantages de la CMF
Analyse quantitative
Sensibilité de
détection
Rapidité
Analyse
multiparamétrique
Tri
TRI : Principe
TRI: Principe
Déflection électrostatique de gouttes chargées
- Les cellules sont aspirées de l'échantillon
- injectées une à une par une buse dans un
courant continu (formation du jet)
- Le jet se rompre pour donner des
gouttes à un point précis appelé « break
of point »
- Chargement de goutes
- Les goutes sont déviées du côté de la plaque de
polarité opposée et collectée
En appliquant différent niveau de charge
à gauche et à droite, il est possible de
trier quatre populations simultanément
sur le BD FACSAria III.
TRI: Principe
Optimisation de paramètres
Pression
Liquide de gaine
Taille de la buse
Fréquence
Viabilité cellulaire
Taille de la
buse
Fréquence
(µm)
Pression
Liquide de
gaine
(psi)
70
70
90
85
45
47
100
130
20
10
20
12
Type cellulaire
(KHZ)
Lymphocytes T non activés, Lymphocytes B,
Bactéries, Levures.
Lymphocytes T activés, cellules plasmatiques, NK,
NK-T, Monocytes, mDC, pDC, cellules souches.
Cellules tissulaires, Neurones, Macrophages,
TRI: Principe
Précisions
Pureté
Rendement
« Single Cell »
BD FACSAria III
BD FACSAria III
Système Optique
Lasers
375 nm
405 nm
488 nm
561 nm
633 nm
BD FACSAria III
Système de collection
Le module ACDU (automated cell deposition unit)
Quelques exemples…
Tri des lymphocytes T (CD3 +) et monocytes (CD14 +) à partir de CMN de
sang périphérique
Avant Tri
Après Tri
99.7 %
8.6 %
54.1 %
98.0 %
Après Tri
Quelques exemples…
Tri des cellules GFP + à partir de lignée transfectée
Avant Tri
Après Tri
97 %
31.7 %
67.9 %
Après Tri
99.3 %
Le BD FACSAria III permet:
 Trier sur des microplaques de 24, 96 puits ou 384 puits, des lames ou des tubes.
 Trier dans des conditions de température contrôlée (4, 20, 37 et 42 °C) et
dans des conditions aseptiques.

Trier à différentes pressions (5 à 75 psi) et avec quatre tailles de buses (70, 85, 100 et
130 µm) pour trier divers types des particules.
 l’analyse simultanée de 18 paramètres (FSC, SSC et 16 fluorescences).
 l’acquisition à une vitesse maximale de 70.000 évènements/sec.
 Trier avec un maximum de pureté ou un maximum de rendement (pour une petite et
précieuse population) ou un maximum de précision pour un clonage.
 Récupérer des cellules viables
Et après tri…….
Cellules viables





Mise en culture,
Etudes fonctionnelles,
analyses de biologie moléculaire, protéinique, génomique,
Clonage,
Observation en microscopie confocal…
Qualité des résultats
• optimiser, calibrer et contrôler le cytomètre
• Préparation de l’échantillon
• choisir la bonne combinaison des
fluorochromes
• inclure des contrôles appropriés
• Optimiser les conditions d’acquisition
• Analyses des données
Interprétation des résultats
CYTOMETRIE EN FLUX
Informations pratiques…..
Responsables et
contacts
Adriana Delwail
Tél: 05 49 45 40 56
Mail: Adriana. [email protected]
Jean-François Jégou
Tél: 05 49 45 36 45
Mail: [email protected]
Localisation
PBS
secteur α
Niveau 1
Salle MS Q24
Matériel
Cytomètre analyseur
BD FACSVerse
Cytomètre trieur
BD FACSAria III