Transcript trans-10, cis-12共役リノレン酸によるPI3K、AMPK、AS160の活性化は

Activation of phosphatidylinositol-3 kinase,
AMP-activated kinase and Akt substrate-160
kDa by trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid
mediates skeletal muscle glucose uptake
Journal of Nutritional Biochemistry 24 (2013) 445–456
trans-10, cis-12共役リノレン酸によるPI3K、AMPK、
AS160の活性化は、骨格筋の糖取り込みを調節する。
2015/01/05
U4 眞野 僚
骨格筋における糖取り込みの経路
Exerc Sport Sci Rev. 2011;39(2):102-108.
CLA（conjugated linoleic acid）について
・自然界には、少なくとも28種類の異性体が存在する。
・c9,t11-CLAは、乳製品や反芻動物の肉に含まれる。
・リノール酸からステアリン酸を合成する過程で生成されるCLAには、
c9,t11-CLA、t10,c12-CLAがほぼ1対1で含まれている。
・健康機能食品に含まれている。
Kishino et al, PNAS, 2013
背景と目的
・ZDFラットに対して経口ぶどう糖負荷試験を行ったところ、CLAには
抗糖尿病作用が認められた。1)
・ZDFラットにおいて、t10,c12-CLAは肥満症を通じてインスリン抵抗
性を引き起こす。2)
⇒意見が割れていたが、近年はインスリン抵抗性を改善するという意
見が一般的
・骨格筋以外の細胞では、CLAのターゲットとなる分子の特定が行わ
れているが、CLAが骨格筋のGLUT4の膜移行にどのように関わるの
かについてはまだ分かっていない。3)
CLAの異性体が、骨格筋のGLUT4の膜移行に直接作用するであろう
という仮説の検証と、c9,t11-CLAとt10,c12-CLAの異性体特異的な糖
取り込みに与える影響を比較した。
1) Ryder J et al, Diabetes, 2001
2) Chung S et al, J Biol Chem, 2005
3) Schmidt J et al, J Biol Chem, 2011
CLAの添加濃度、時間の検討
1．L6細胞を24時間無血清培地で培養
2．それぞれの濃度、時間でCLAを添加
3．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコース
を10分添加
4．測定
これ以降のCLAの添加時間、濃
度は60 µM、15分で実験を行う。
2-NBDGによる糖取り込み量の確認
1．L6細胞にインスリン 100 nM、CLA
60µMを15分添加
2．100 µMの2-デオキシグルコースと2NBDGを10分添加
3．蛍光顕微鏡で画像を撮り、画像解析に
より定量化した。
C
CLA-mix：c9,t11-CLA、t10,c12-CLAを30 µM
ずつ添加
どちらのCLAもインスリンと同様に
糖取り込みを上昇させた。
また、c9,t11-CLAの添加の方がよ
り多く取り込んだ。
BSAに結合するべきかどうかの検討
1．L6細胞を24時間無血清培地で
培養
2．CLA 60 µMを15分添加
（1％w/vのBSA含有培地を用い
た）
3．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグ
ルコースを10分添加
4．測定
これ以降の実験では、BSA
は使わずにエタノール/無血
清培地を使用する。
※CLAはエタノールに溶かしてあるため
糖の流入経路の確認
1．L6細胞を24時間無血清培地で培養
2．サイトカラシンB 1 µMを15分添加
3．インスリン 100 nM、CLA 60 µMを15
分添加
（1％w/v BSA含有培地）
60 µM
4．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコース
を10分添加
5．測定
Cytochalasin B：GLUT4の膜移行阻害剤
240 µM
CLAもインスリンと同様に、GLUT4
を介した糖取り込みに影響を与え
る。
免疫染色による確認
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．L6細胞にインスリン 100 nM、CLA
60µM、CLA-mixを15分添加
3．GLUT4に対する抗体を用いて免疫
染色
CLAがGLUT4の膜移行を
促進していることが分かった。
GLUT4-EGFPの蛍光で膜移行の確認
1.L6筋芽細胞にFuGENE6を用い
て、GLUT4-EGFPを導入
2．無血清培地で一晩培養
3．インスリン 100 nM、CLA 60µM
を15分添加
4．GLUT4に対する抗体を用いて免
疫染色
CLAがGLUT4の膜移行
を促進していることが分
かった。
ウエスタンブロットでの確認
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15分添加
3．細胞分画キットを用いて、細胞膜、細胞質に分
画
4．GLUT4、IGF-1αの抗体を用いてウエスタンブ
ロット
細胞膜上のGLUT4
が細胞内のGLUT4
に比べて存在量が多
かった。
MAPKのシグナルについて
http://www.cstj.co.jp/reference/pathway/MAPK_Cascades.php
CLAの作用点はどこか？①
1．L6細胞を無血清培地で一晩培
養
2．インスリン 100 nM、CLA 60µM
を15分添加
3．それぞれの抗体を用いてウエス
タンブロット
MAPK
SAPK
JNK
: Mitogen-activated Protein Kinase
: Stress-Activated Protein Kinase
: c-jun NH2-terminal kinase
CLAはNullと同じ結果となった。
→CLAは細胞外、環境ストレス、酸化ストレス、分裂促進スト
レスには関与しない。
CLAの作用点はどこか？②
1．L6細胞を無血清培地で一晩培
養
2．インスリン 100 nM、CLA 60µM
を15分添加
3．それぞれの抗体を用いてウエス
タンブロット
CLAはIR、Akt、IRS-1
のリン酸化には関与し
ない。
CLAの作用点はどこか？③
CLAはPI3K、AS160の
リン酸化を通じて糖取り
込みを調節する。
CLAは、PI3Kに干渉して、Akt
には干渉しない経路によって、
AS160のリン酸化を増加させ
るかもしれない。
CLAの作用点はどこか？④
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．LY294002 10 µMを15分添加
3．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15分添加
（Fig.3E)
4．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコースを10分添
加
5．測定
(Fig.3F)
4’.AS160に対する抗体を用いてウエスタンブロット
LY294002：PI3K阻害剤
LY294002によって、CLA
による影響が妨げられた。
CLAの作用点はどこか？（AMPKのシグナル）①
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15
分添加
3.それぞれの抗体を用いてウエスタン
ブロット
LKB1：AMPKの上流のシグナル分子
ACC：AMPKの下流のシグナル分子
CLAは、異性体毎に異な
るAMPKのシグナル分子
に関与する。
CLAの作用点はどこか？（AMPKのシグナル）②
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．AICAR 1mM、Dorsomorphin 1µMを15分添
加
3．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15分添加
（Fig.4B)
4．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコース10分添
加
(Fig.4C)
4’.AS160に対する抗体を用いてウエスタンブロッ
ト
AICAR：AMPKのアクティベータ―
Dorsomorphin：AMPKの阻害剤
AICARの添加では、CLAによる糖取り込
みの増加が見られない。
Dorsomorphinの添加では、t10,c12CLAのみ糖取り込みの減少が見られた。
CLAの作用点はどこか？（AMPKのシグナル）③
1．アデノウイルスを用いて、L6細胞にAMPKαWT、AMPKα-DNを遺伝子導入（36時間培養）
2．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15分添加
（Fig.4D)
3．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコース10分
添加
(Fig.4E)
3’.AS160に対する抗体を用いてウエスタンブ
ロット
DN：dominant negative
AMPKのDNでは、Insulin、CLA
による糖取り込み量の増加が抑
制される。
CLAがAS160のリン酸化を通じて糖取り込みを増加させる
ためには、インスリン依存性（PI3K）、あるいは非依存性
（AMPK）のエフェクターを必要とする。
CLAとインスリンの同時添加による影響①
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．インスリン、CLAをそれぞれの濃度で15
分添加
3．1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコースを
10分添加
インスリンの濃度に応じて
糖取り込み量が増加した。
CLAとインスリンの同時添加による影響②
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15
分添加
3.AMPK、Aktに対する抗体を用いてウエ
スタンブロット
・インスリンは、AMPKのリン
酸化には影響しない。
・同時添加により、Aｋｔのリ
ン酸化の割合が増加した。
インスリンの濃度が、CLAの糖取り込みに与える影響
1．L6細胞を無血清培地で一晩培養
2．インスリン 100 nM、CLA 60µMを15
分添加
（Fig.5D）
3. 1 µCi/mlの[3H]-2-デオキシグルコース
を10分添加
(Fig.5E)
3‘．Aktに対する抗体を用いてウエスタン
ブロット
t10,c12-CLAは、200 nM以上、
c9,t11-CLAは200 ｎM以内でイン
スリンの効果を高める。
AMPKが関与する経路
細胞内のcAMP濃度の上昇
LKB1
AMPK
TBC1D1