Transcript Purificação de Produtos Biotecnológicos

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
EEL / USP
Disciplina: Engenharia Bioquímica II A
Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro
Profº Arnaldo Márcio
Etapas de um Processo de Purificação
Etapa do processo
Clarificação
Rompimento de células
Operações unitárias
Princípio
Filtração convencional
Centrifugação
Filtração tangencial (membranas)
Tamanho de partículas
Tamanho e densidade de partículas
Tamanho de partículas
Floculação
Hidrofobicidade de partículas
H omegeneização
Ultra-som
Moagem em moinho de bolas
Cisalhamento
Cisalhamento
Cisalhamento
Hidrólise, solubilização ou desidratação de
moléculas que compõem a parede ou a
membrana celular
Solubilidade
Massa molar e raio hidrodinâmico de
moléculas
Rompimento químico ou enzimático
Precipitação
Purificação de baixa resolução
U Itrafiltração (membranas)
Extração em sistemas de duas fases líquidas Solubilidade, massa molar
Cromatografia de troca-iônica
Cromatografia de afinidade (biológica ou
química)
Cromatografia de imunoafinidade
Purificação de alta resolução
Cromatografia de interação hidrofóbica
Cromatografia de exclusão molecular
Membranas adsortivas
Cristalização
Tratamentos finais
Tipo e densidade de carga na superfície da
biomolécula
Sítios específicos da superfície de uma
proteína (adsorção)
Sítios específicos da superfície de uma
proteína (adsorção antígeno/anticorpo)
Hidrofobicidade
Massa molar
Massa molar e características para adsorção
ou sítios específicos da superfície de uma
proteína
Solubilidade e características de equilíbrio
líquido-sólido
Liofi I ização
Características de equilíbrio líquido-sólido
Secagem
Características de equilíbrio líquido-sólido
Rompimento Celular
Rompimento
Celular
Clarificação
Suspensão
Celular
Produtos
Intracelulares
 Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil
em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento
 Aplicados após a separação e lavagem das células;
 Células animais (possuem apenas membrana), fácil
rompimento com baixa força de cisalhamento;
 Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da
pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou
aplicação de ultra-som de baixa intensidade
Forma mais adequada de
Rompimento?
 Tipo de microrganismo
 Tamanho da célula;
 Tolerância a tensões de cisalhamento;
 Necessidade de controle de temperatura;
 Gasto de energia;
Parede Celular
Métodos de Rompimento Celular
Mecânicos
• Homogeneizador de alta pressão
• Moinho de bolas
• Ultrassom
Nãomecânicos
•
•
•
•
Choque osmótico
Congelamento-descongelamento
Aquecimento
Secagem
Químicos
•
•
•
•
Álcalis
Solventes
Detergentes
Ácidos
Enzimáticos
• Lize enzimática
Homogeneizador a alta pressão
Cavitação
Turbulência
Cisalhamento
Mecânico - Homogeneizador a
alta pressão
 Este tipo de rompimento provoca aumento da
temperatura do meio, por isso necessita de sistema de
refrigeração
 Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi,
velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s
e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa
úmida).
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
O desempenho pode ser afetado por:






Pressão de operação;
Velocidade de alimentação;
Temperatura;
Estado fisiológico do microrganismo;
Condições de cultivo;
Tipo de célula e sua concentração.
 tamanho das células (maior => rompimento mais fácil)
 pressão (maior => maior eficiência)
 número de passagens (múltiplas etapas aumenta o ren-
dimento)
Existe um modelo matemático para avaliar o
rompimento, que neste caso é de 1a ordem em
relação ao número de passagens e de potência
em relação à pressão de trabalho:
log
Rm
=
(Rm – R)
k . N . Pa
onde:
Rm é a concentração máxima de proteína
disponível para ser liberada (g/L)
R é a concentração de proteina liberada (g/L)
k é a constante de velocidade que depende de T,
X e do tipo de célula
N é o número de passagens
P é a pressão
a é constante que depende do tipo de
microrganismo e das condições de crescimento
(varia de 0,86 a 2,9) (tabela)
Mecânico – Moinho de Bolas
 Consiste na passagem da suspensão celular por uma
câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida
de um eixo com discos de agitação e preenchida com
esferas de vidro.
 O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento
aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular
das células.
Mecânico – Moinho de Bolas
Mecânico – Ultra-som
 O rompimento ocorre quando ondas sonoras
(~20kHz), são convertidas em vibrações em um
meio líquido e causam o fenômeno de cavitação.
 Escala de laboratório.
Mecânico - Ultrassom
Rompimentos Mecânicos
 Desvantagens:
 As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos
rompimentos mecânicos podem destruir organelas
celulares e desnaturar enzimas;
 Com o rompimento integral das células todo o conteúdo
intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e
fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo,
sendo que o homogeneizado celular pode conter grande
quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.