Prof. Valmir F. Juliano QUI624 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Gravimetria Volumetria Baseados em propriedades físicas (químicas em.
Download ReportTranscript Prof. Valmir F. Juliano QUI624 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Gravimetria Volumetria Baseados em propriedades físicas (químicas em.
Prof. Valmir F. Juliano
QUI624 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Baseados em propriedades físicas ( químicas em alguns casos ) Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Cromatográfico Espectrométrico Propriedades elétricas Propriedades ópticas Propriedades mistas*
*
Separação : interações físico-químicas.
Identificação/quantificação : propriedades ópticas ou elétricas.
Cromatografia
Histórico Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e éter de petróleo solventes variados.
mistura de pigmentos CaCO 3 pigmentos separados
1906
Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
Cromatografia
Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. • A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. • A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar • Centrífuga (Chromatotron®) • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) • Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a fase móvel • Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • De acordo com o modo de separação • Por Adsorção • Por Partição • Por Troca Iônica • Por Afinidade
Técnica
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas
Planar Coluna FM Líquido Gás Líquido FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Iônica Afinidade Fase Ligada Exclusão Tipo de cromato grafia CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
Cromatografia
Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas.
Fase estacionária Analitos
Cromatografia
Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura.
Fase estacionária Analitos
Cromatografia
Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma
FASE ESTACIONÁRIA
(líquido ou sólido) e uma
FASE MÓVEL
(líquido ou gás).
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Fase móvel Separação A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos
R f
ΔS mancha ΔS solvente
b c s
R f a R f b
a s
b s
a
R f c
c s
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO 2 ) Alumina (Al 2 O 3 ) Celulose Poliamida
Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 o C Ativação de 10 min a 105 o C
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
ANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de R
f tabelados
- Comparação com padrão eluído em conjunto - Extração e aplicação de métodos instrumentais
Amostra
A B
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD Conclusões: Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, eluir em outros solventes
Após Eluição
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Cromatografia Bi-dimensional
Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Cromatografia planar Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão Partição Adsorção Troca Iônica Afinidade
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida Processos de Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Diferença entre Absorção e Adsorção
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida: Polar Aumento da Atividade -CO 2 H > -OH > -NH 2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO 2 R > -OCH 3 > -CH=CH-
Cromatografia
Cromatografia em Coluna A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: a) Função solvente • Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente • Conduzir os componentes da mistura pela coluna • Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
Usos: a) Laboratórios de química orgânica reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais separar e purificar escala preparativa e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas esteróides de urina ou de sangue, etc.
separação de
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade
O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade
O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos.
Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica
Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas e Aniônicas
FE altamente carregada
Maior Interação
•
Íons de alta carga
•
Íons de menor tamanho
A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Características desejáveis para os Géis
-Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH.
-Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
AFINIDADE
Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida
Propriedades Biológicas e Funcionais
FASE MÓVEL
Cromatografia
Teoria Básica
SOLUTO
Sem importância na CG, mas com grande importância na CLAE ⇌
FASE ESTACIONÁRIA
Cromatografia
Teoria Básica
Coluna cromatográfica
: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel:
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM.
K C FE FM
K C = Constante de Distribuição [A] FE [A] FM = concentração do analito na FE = concentração do analito na FM
Afinidade pela FE
MENOR RETENÇÃO !!!
Volatilidade
[A] FE [A] FM
Cromatografia
Quantificação da eficiência Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:
Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de
PRATO TEÓRICO t R w b N
Coluna mais eficiente
Cromatografia
Quantificação da eficiência
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
Valores típicos de H e N:
“Tamanho” de cada estágio de equilíbrio
d C d f H N (L = comprimento da coluna) Capilares, L = 30 m
d c d f = diâmetro da coluna em mm = espessura da fase estacionária em m m
0,10 0,25 0,25 0,25 0,32 0,32 0,32 0,50 0,32 1,00 0,32 5,00 0,53 1,00 0,53 5,00 0,081 0,156 0,200 0,228 0,294 0,435 0,426 0,683 370370 192308 150000 131579 102041 68966 70423 43924 Empacotadas, L = 2 m 2,16 10% 2,16 5% 0,549 0,500 3643 4000
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Fase móvel Detecção Separação
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa Injetor: submetido à temperatura controlada Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas
Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS
(=“evaporáveis”)
DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que sejam termicamente estáveis.
Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE:
Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO:
Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
H 2 O, O 2
oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE
hidrocarbonetos
ruído no sinal de DIC
Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO:
Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
A B PUREZA C A B C
= 99,995 % (4.5) = 99,999 % (5.0) = 99,9999 % (6.0)
COMPATÍVEL COM DETECTOR:
Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:
DCT DIC DCE He , H 2 N 2 , H 2 N 2 (SS), Ar + 5% CH 4
Cromatografia Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeção (
INJETORES
ou
VAPORIZADORES
) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
t = 0
Injeção instantânea:
t = x t = 0
Injeção lenta:
t = x
2 4
Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”
1
1 - Septo (silicone)
3
2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica
1
Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”
2 3 1 2 3 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.
- Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.
- “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
Cromatografia Gasosa
Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR:
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.
Deve ser suficientemente
Regra Geral
:
T inj = 50 o C
componente menos volátil.
acima da temperatura de ebulição do
VOLUME INJETADO:
físico da amostra.
Depende do tipo de coluna e do estado COLUNA
Amostras Líquidas Amostras Gasosas Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta se a solução
empacotada 1 4 ”)
0,2 m L ... 20 m L 0,01 m L ... 3 m L 0,1 mL ... 50 mL 1 m L ... 100 m L
Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeção
LÍQUIDOS:
Capacidades típicas: 1 m L, 5 m L e 10 m L
êmbolo agulha (inox 316)
Microsseringa de 10
m
L
: corpo (pirex) corpo
Microsseringa de 1
(seção ampliada):
m
L
guia agulha êmbolo (fio de aço soldado ao guia)
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
= 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de FE líquida ou sólida
m
m) de
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua
PRESSÃO DE VAPOR ( p 0
).
p 0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE ( MENOR RETENÇÃO )
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
T COL BAIXA: T COL ALTA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos - Componentes mais voláteis não são separados - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação
:
T FIM R T INI
Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo
t INI t FIM TEMPO T INI
- Temperatura Inicial
T FIM
- Temperatura Final
t INI
- Tempo Isotérmico Inicial
t FIM
- Tempo Final do Programa
R
- Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE:
A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.
viscosidade vazão
DERIVA LINHA DE BASE:
aumento de FE líquida
(“
DRIFT
”) NA
Devido ao volatilização de
Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida
ADSORÇÃO
•
Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)
•
Solutos polares
•
Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE líquida é a ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial)
ABSORÇÃO
•
Filmes espessos de FE líquida
•
Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste
•
Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são
MUITO SIMILARES
FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos.
PRODUTOS BIOLÓGICOS -
Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
FÁRMACOS -
Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.
Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.
4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC.
8.Não destrutivo.
-8 a 10 -15 g de soluto/s.
5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7.Similaridade de resposta para todos os solutos.
Cromatografia Gasosa
Detectores
REGISTRO DE SINAL
ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores Computadores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
DCT
Cromatografia Gasosa
Detectores
DCE DNP
UNIVERSAIS qualquer
:
Geram sinal para substância eluída.
SELETIVOS substâncias propriedade físico-química.
:
Detectam apenas com determinada ESPECÍFICOS
:
Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas
Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD):
Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H 2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos .
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD):
do DIC. Os eluatos queimados na chama H
2 uma superfície moléculas de silicato de com N e P.
rubídio
Modificação
+ ar passam por onde se formam íons de
Cromatografia Gasosa
Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD):
Universal
. Observa-se para qualquer substância eluída .
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de
m
g (10 4 ).
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal
. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H.
(X=halogênio), Não responde a gases nobres, H 2 , O 2 , N 2 , CX 4 , SiX 4 CO, CO 2 , CS 2 , H 2 O, NO, N 2 O, NO 2 , NH 3 .
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (10 7 – 10 8 ).
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo
. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e a 1 pg com linearidade até organometálicos . Sensibilidade: 0,01 ng. (10 4 ) (
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD):
Responde a compostos
P
) e 0,4 a 10 pg (
N
orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg ) com linearidade até ng. (10 3 - 10 5 ) Específico.
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS):
Universal / Seletivo /
Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro eluída É de massas. Observa-se para qualquer um sinal, mesmo que complexo, no seletivo ou determinada específico razão m/z.
espectrômetro substância de massa.
quando monitora-se um fragmento de
Detecção
TIC
Universal Similar a DCT
SIM
Seletivo Maior Sensibilidade
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS):
Universal / Seletivo /
Específico.
Cromatograma de íons totais : TIM ou TIC Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.
MASSA / CARGA TEMPO
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS):
Universal / Seletivo /
Específico.
Cromatograma de íons selecionados : SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.
Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os demais .
TEMPO MASSA / CARGA
CG
Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS):
Interface CG-EM
.
Câmara de Ionização EM Coluna Capilar Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve ( He ) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo.
Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO , t R ’
:
t M t R t R ’ = t R t M TEMPO t R = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) t M = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) t R ’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar):
30 m x 0,25 mm x 0,25 m m Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 m L Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol.
Como se explica esta ordem de eluição?
1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e ).
3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: • Altura da banda cromatográfica • Área da banda cromatográfica .
: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
Área Altura TEMPO
amostra
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
tempo Concentração
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente
MASSA
O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área região / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação linear: da reta na
MASSA 1,05 S 0,95 S
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
amostra concentração na amostra Concentração Adicionada tempo
Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
Cromatografia Líquida
Aumento de polaridade Insolúvel em água Apolar Solúvel em água Polar não iônico Iônico
Tipos e Aplicações da Cromatografia Líquida
10 2 10 3
Partição Adsorção Partição em fase reversa Partição em fase normal Troca iônica
10 4 10 5
Permeação em gel Exclusão Filtração em gel
10 6
Cromatografia Líquida
Componentes típicos - CLAE
Cromatografia Líquida
Esquema de um equipamento para CLAE
Cromatografia Líquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6.000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca ( também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma )
Cromatografia Líquida
Sistemas de injeção de amostras Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 m L Microamostragem: 0,5 a 5 m L
Cromatografia Líquida
Fase móvel para CLAE Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.
• Eluição isocrática: • Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. • Eluição com gradiente: • São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.
Cromatografia Líquida
Eluição com gradiente Coluna C 18 , 5 m m, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE •Remoção de material particulado Pré-coluna •Contaminantes do solvente •Contaminantes da amostra •Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS •Material: aço inox •Comprimento: 10 a 30 cm •Diâmetro: 4 a 10 mm •FE: Partículas de 5 a 10 m m •Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
Cromatografia Líquida
Separação isocrática de alta velocidade Coluna de alta velocidade e alta eficiência - 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 m m 100.000 pratos/metro FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 1– p-xileno 2- anisol 3- acetato de benzila 4- dioctil-ftalato 5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato 7- dipropil-ftalato 8- dietil-ftalato
Cromatografia Líquida
Fase estacionária para CLAE
Basicamente são dois tipos de FE:
• Pelicular: • Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m m, recoberto com uma camada fina e porosa de: • Sílica • Alumina • Resina de poliestireno-divinil-benzeno • Resina trocadora de íons • Partícula porosa: • Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m m. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia Líquida
Detectores
As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• • Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica).
Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10 grandeza.
7.Não destrutivo.
-8 a 10 -15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de 4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão .
Cromatografia Líquida
Detectores • Absorbância • UV/Vis – S: 10 -9 g/mL – FL: 10 5 • IV • Fluorescência – S: 10 -9 a 10 -12 g/mL – FL: 10 3 • Índice de refração (universal) – S: 10 -7 g/mL – FL: 10 4
Cromatografia Líquida
Detectores • Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos • Coulométricos • Condutométricos – S: 10 -8 g/mL – FL: 10 4 • Polarográficos – S: 10 -12 g/mL – FL: 10 6
Cromatografia Líquida
Detectores • Espectrometria de massa - universal • Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação • Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
Cromatografia Líquida
Detectores • Espectrometria de massa
TIC SIM MASSA / CARGA MASSA / CARGA TEMPO TEMPO
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE • PARTIÇÃO : líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento Adsorção e ligação química . Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa.
Fase normal : Fase reversa FE de natureza fortemente polar (ex. água) : FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel.
FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE • É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C 8 (n-octil) ou C 18 (n-octadecil)
Campo
Farmacêutico Bioquímico
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Misturas típicas
Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Produtos químicos Poluentes Química forense Clínica médica Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE • ADSORÇÃO HPLC.
: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de • TROCA IÔNICA : líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica. • EXCLUSÃO : líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.
Cromatografia
Para refletir e responder:
Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas?
Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.
Cromatografia
Para refletir e responder:
A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito?
A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?