Prof. Valmir F. Juliano

QUI624 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos

CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Baseados em propriedades físicas ( químicas em alguns casos ) Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Cromatográfico Espectrométrico Propriedades elétricas Propriedades ópticas Propriedades mistas*

*

Separação : interações físico-químicas.

Identificação/quantificação : propriedades ópticas ou elétricas.

Cromatografia

Histórico Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e éter de petróleo solventes variados.

mistura de pigmentos CaCO 3 pigmentos separados

1906

 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia

Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. • A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. • A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.

• A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias.

• A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.

Cromatografia

Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar • Centrífuga (Chromatotron®) • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) • Cromatografia em Papel (CP)

Cromatografia

Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a fase móvel • Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC)

Cromatografia

Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • De acordo com o modo de separação • Por Adsorção • Por Partição • Por Troca Iônica • Por Afinidade

Técnica

Cromatografia

Classificação das técnicas cromatográficas

Planar Coluna FM Líquido Gás Líquido FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Iônica Afinidade Fase Ligada Exclusão Tipo de cromato grafia CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE

Cromatografia

Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.

Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas.

Fase estacionária Analitos

Cromatografia

Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura.

Fase estacionária Analitos

Cromatografia

Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma

FASE ESTACIONÁRIA

(líquido ou sólido) e uma

FASE MÓVEL

(líquido ou gás).

Cromatografia

Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!

Fase estacionária líquida suportada na celulose.

Fase móvel Separação A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia

Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Termos e parâmetros técnicos

R f



ΔS mancha ΔS solvente

b c s

R f a R f b



a s



b s

a

R f c



c s

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

FASES ESTACIONÁRIAS

Sílica (SiO 2 ) Alumina (Al 2 O 3 ) Celulose Poliamida

Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 o C Ativação de 10 min a 105 o C

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

ANÁLISE QUALITATIVA

- Comparação com valores de R

f tabelados

- Comparação com padrão eluído em conjunto - Extração e aplicação de métodos instrumentais

Amostra

A B

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Conclusões: Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, eluir em outros solventes

Após Eluição

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia Bi-dimensional

Solvente 1 Solvente 2

Cromatografia

Cromatografia planar Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PROCESSOS DE SEPARAÇÃO

Exclusão Partição Adsorção Troca Iônica Afinidade

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

- Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida Processos de Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Diferença entre Absorção e Adsorção

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

Fase Estacionária Sólida: Polar Aumento da Atividade -CO 2 H > -OH > -NH 2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO 2 R > -OCH 3 > -CH=CH-

Cromatografia

Cromatografia em Coluna A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: a) Função solvente • Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente • Conduzir os componentes da mistura pela coluna • Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

Usos: a) Laboratórios de química orgânica  reagentes e materiais obtidos em síntese.

b) Laboratórios de produtos naturais separar e purificar  escala preparativa e analítica.

c) Laboratórios de análises clínicas  esteróides de urina ou de sangue, etc.

separação de

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PARTIÇÃO

Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade

O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PARTIÇÃO

Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade

O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

TROCA IÔNICA

Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos.

Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica

Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

TROCA IÔNICA

Resinas Catiônicas e Aniônicas

FE altamente carregada

Maior Interação

•

Íons de alta carga

•

Íons de menor tamanho

A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO

Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel

Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO

A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.

- Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO

Características desejáveis para os Géis

-Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto.

-Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH.

-Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO

Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

AFINIDADE

Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida

Propriedades Biológicas e Funcionais

FASE MÓVEL

Cromatografia

Teoria Básica

SOLUTO

Sem importância na CG, mas com grande importância na CLAE ⇌

FASE ESTACIONÁRIA

Cromatografia

Teoria Básica

Coluna cromatográfica

: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel:

Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM.

K C      FE FM

K C = Constante de Distribuição [A] FE [A] FM = concentração do analito na FE = concentração do analito na FM

Afinidade pela FE

MENOR RETENÇÃO !!!

Volatilidade

[A] FE [A] FM

Cromatografia

Quantificação da eficiência Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de

PRATO TEÓRICO t R w b N

Coluna mais eficiente

Cromatografia

Quantificação da eficiência

ALTURA EQUIVALENTE A UM

PRATO TEÓRICO (H)

Valores típicos de H e N:

“Tamanho” de cada estágio de equilíbrio

d C d f H N (L = comprimento da coluna) Capilares, L = 30 m

d c d f = diâmetro da coluna em mm = espessura da fase estacionária em m m

0,10 0,25 0,25 0,25 0,32 0,32 0,32 0,50 0,32 1,00 0,32 5,00 0,53 1,00 0,53 5,00 0,081 0,156 0,200 0,228 0,294 0,435 0,426 0,683 370370 192308 150000 131579 102041 68966 70423 43924 Empacotadas, L = 2 m 2,16 10% 2,16 5% 0,549 0,500 3643 4000

Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes

Cromatografia

Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Fase móvel Detecção Separação

Cromatografia

Cromatografia em fase gasosa Injetor: submetido à temperatura controlada Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas

Cromatografia Gasosa

Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.

Misturas cujos constituintes sejam

VOLÁTEIS

(=“evaporáveis”)

DE FORMA GERAL:

CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que sejam termicamente estáveis.

Cromatografia Gasosa

Requisitos - Gás de arraste (FM)

INERTE:

Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO:

Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

H 2 O, O 2

oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE

hidrocarbonetos

ruído no sinal de DIC

Cromatografia Gasosa

Requisitos - Gás de arraste (FM)

CUSTO:

Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.

A B PUREZA C A B C

= 99,995 % (4.5) = 99,999 % (5.0) = 99,9999 % (6.0)

COMPATÍVEL COM DETECTOR:

Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:

DCT DIC DCE He , H 2 N 2 , H 2 N 2 (SS), Ar + 5% CH 4

Cromatografia Gasosa

Injetor

Os dispositivos para injeção (

INJETORES

ou

VAPORIZADORES

) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

t = 0

Injeção instantânea:

t = x t = 0

Injeção lenta:

t = x

2 4

Cromatografia Gasosa

Injetor “on column”

1

1 - Septo (silicone)

3

2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica

1

Cromatografia Gasosa

Injetor “on column”

2 3 1 2 3 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.

- Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.

- “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

Cromatografia Gasosa

Parâmetros de injeção

TEMPERATURA DO INJETOR:

elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.

Deve ser suficientemente

Regra Geral

:

T inj = 50 o C

componente menos volátil.

acima da temperatura de ebulição do

VOLUME INJETADO:

físico da amostra.

Depende do tipo de coluna e do estado COLUNA

Amostras Líquidas Amostras Gasosas Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta se a solução



empacotada 1 4 ”)

 0,2 m L ... 20 m L 0,01 m L ... 3 m L 0,1 mL ... 50 mL 1 m L ... 100 m L

Cromatografia Gasosa

Microsseringas para injeção

LÍQUIDOS:

Capacidades típicas: 1 m L, 5 m L e 10 m L

êmbolo agulha (inox 316)

Microsseringa de 10

m

L

: corpo (pirex) corpo

Microsseringa de 1

(seção ampliada):

m

L

guia agulha êmbolo (fio de aço soldado ao guia)

Cromatografia Gasosa

Colunas

EMPACOTADA



= 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m

Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)



CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de FE líquida ou sólida

m

m) de

Cromatografia Gasosa

Temperatura da coluna

Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua

PRESSÃO DE VAPOR ( p 0

).

p 0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE ( MENOR RETENÇÃO )

Cromatografia Gasosa

Temperatura da coluna

CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG

Cromatografia Gasosa

Programação linear de temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito

diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

T COL BAIXA: T COL ALTA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos - Componentes mais voláteis não são separados - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente

Cromatografia Gasosa

Programação linear de temperatura

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação

:

T FIM R T INI

Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo

t INI t FIM TEMPO T INI

- Temperatura Inicial

T FIM

- Temperatura Final

t INI

- Tempo Isotérmico Inicial

t FIM

- Tempo Final do Programa

R

- Velocidade de Aquecimento

Cromatografia Gasosa

Programação linear de temperatura

a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC

Cromatografia Gasosa

Programação linear de temperatura

Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE:

A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade vazão

DERIVA LINHA DE BASE:

aumento de FE líquida

(“

DRIFT

”) NA

Devido ao volatilização de

Cromatografia Gasosa

Fase Estacionária

REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)

FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência

Cromatografia Gasosa

Fase estacionária sólida

• O fenômeno físico-químico responsável pela interação

analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

ADSORÇÃO

•

Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)

•

Solutos polares

•

Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)

Cromatografia Gasosa

Fase estacionária líquida

• O fenômeno físico-químico responsável pela interação

analito + FE líquida é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial)

ABSORÇÃO

•

Filmes espessos de FE líquida

•

Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste

•

Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)

Cromatografia Gasosa

Fase estacionária quirais

• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são

MUITO SIMILARES



FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos.

PRODUTOS BIOLÓGICOS -

Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).

FÁRMACOS -

Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.

Cromatografia Gasosa

Detectores

Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.

Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.

3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.

4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC.

8.Não destrutivo.

-8 a 10 -15 g de soluto/s.

5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.

6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.

7.Similaridade de resposta para todos os solutos.

Cromatografia Gasosa

Detectores

REGISTRO DE SINAL

ANALÓGICO

Registradores XY

DIGITAL

Integradores Computadores

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

DCT

Cromatografia Gasosa

Detectores

DCE DNP

UNIVERSAIS qualquer

:

Geram sinal para substância eluída.

SELETIVOS substâncias propriedade físico-química.

:

Detectam apenas com determinada ESPECÍFICOS

:

Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

Cromatografia Gasosa

Detectores - Funcionamento

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD):

Variação da condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):

Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H 2 + ar.

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):

Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos .

DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD):

do DIC. Os eluatos queimados na chama H

2 uma superfície moléculas de silicato de com N e P.

rubídio

Modificação

+ ar passam por onde se formam íons de

Cromatografia Gasosa

Detectores – Limites de detecção

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD):

Universal

. Observa-se para qualquer substância eluída .

Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de

m

g (10 4 ).

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):

Quase-universal

. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H.

(X=halogênio), Não responde a gases nobres, H 2 , O 2 , N 2 , CX 4 , SiX 4 CO, CO 2 , CS 2 , H 2 O, NO, N 2 O, NO 2 , NH 3 .

Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (10 7 – 10 8 ).

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):

Seletivo

. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e a 1 pg com linearidade até organometálicos . Sensibilidade: 0,01 ng. (10 4 ) (

DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD):

Responde a compostos

P

) e 0,4 a 10 pg (

N

orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg ) com linearidade até ng. (10 3 - 10 5 ) Específico.

Cromatografia Gasosa

Detectores – Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS):

Universal / Seletivo /

Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro eluída É de massas. Observa-se para qualquer um sinal, mesmo que complexo, no seletivo ou determinada específico razão m/z.

espectrômetro substância de massa.

quando monitora-se um fragmento de

Detecção

TIC

Universal Similar a DCT

SIM

Seletivo Maior Sensibilidade

Cromatografia Gasosa

Detectores – Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS):

Universal / Seletivo /

Específico.

Cromatograma de íons totais : TIM ou TIC Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.

MASSA / CARGA TEMPO

Cromatografia Gasosa

Detectores – Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS):

Universal / Seletivo /

Específico.

Cromatograma de íons selecionados : SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.

Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os demais .

TEMPO MASSA / CARGA

CG

Cromatografia Gasosa

Detectores – Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS):

Interface CG-EM

.

Câmara de Ionização EM Coluna Capilar Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve ( He ) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo.

Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.

Cromatografia Gasosa

Análise qualitativa

O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o

TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO , t R ’

:

t M t R t R ’ = t R t M TEMPO t R = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) t M = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) t R ’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

Cromatografia Gasosa

Análise qualitativa

Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar):

30 m x 0,25 mm x 0,25 m m Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 m L Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol.

Como se explica esta ordem de eluição?

1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade.

2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e ).

3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.

Cromatografia Gasosa

Análise quantitativa

O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: • Altura da banda cromatográfica • Área da banda cromatográfica .

: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica.

Área Altura TEMPO

amostra

Cromatografia Gasosa

Análise quantitativa

tempo Concentração

Cromatografia Gasosa

Análise quantitativa

A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente

MASSA

O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área região / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação linear: da reta na

MASSA 1,05 S 0,95 S

Cromatografia Gasosa

Análise quantitativa

amostra concentração na amostra Concentração Adicionada tempo

Cromatografia Líquida

Cromatografia em fase líquida

Cromatografia Líquida - CLAE

Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.

DE FORMA GERAL:

CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.

Cromatografia Líquida

Aumento de polaridade Insolúvel em água Apolar Solúvel em água Polar não iônico Iônico

Tipos e Aplicações da Cromatografia Líquida

10 2 10 3

Partição Adsorção Partição em fase reversa Partição em fase normal Troca iônica

10 4 10 5

Permeação em gel Exclusão Filtração em gel

10 6

Cromatografia Líquida

Componentes típicos - CLAE

Cromatografia Líquida

Esquema de um equipamento para CLAE

Cromatografia Líquida

Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6.000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca ( também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma )

Cromatografia Líquida

Sistemas de injeção de amostras Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 m L Microamostragem: 0,5 a 5 m L

Cromatografia Líquida

Fase móvel para CLAE Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.

• Eluição isocrática: • Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. • Eluição com gradiente: • São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade.

• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.

A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.

Cromatografia Líquida

Eluição com gradiente Coluna C 18 , 5 m m, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm

Cromatografia Líquida

Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi.

Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.

Cromatografia Líquida

Colunas para CLAE •Remoção de material particulado Pré-coluna •Contaminantes do solvente •Contaminantes da amostra •Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS •Material: aço inox •Comprimento: 10 a 30 cm •Diâmetro: 4 a 10 mm •FE: Partículas de 5 a 10 m m •Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro

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Separação isocrática de alta velocidade Coluna de alta velocidade e alta eficiência - 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i.

- FE: spherisorb 3 m m 100.000 pratos/metro FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 1– p-xileno 2- anisol 3- acetato de benzila 4- dioctil-ftalato 5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato 7- dipropil-ftalato 8- dietil-ftalato

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Fase estacionária para CLAE

Basicamente são dois tipos de FE:

• Pelicular: • Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m m, recoberto com uma camada fina e porosa de: • Sílica • Alumina • Resina de poliestireno-divinil-benzeno • Resina trocadora de íons • Partícula porosa: • Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m m. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.

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Detectores

As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG.

Existem dois tipos de detectores:

• • Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica).

Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).

Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10 grandeza.

7.Não destrutivo.

-8 a 10 -15 g de soluto/s.

2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.

3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de 4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.

5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.

6.Similaridade de resposta para todos os solutos.

8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão .

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Detectores • Absorbância • UV/Vis – S: 10 -9 g/mL – FL: 10 5 • IV • Fluorescência – S: 10 -9 a 10 -12 g/mL – FL: 10 3 • Índice de refração (universal) – S: 10 -7 g/mL – FL: 10 4

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Detectores • Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.

• Amperométricos • Coulométricos • Condutométricos – S: 10 -8 g/mL – FL: 10 4 • Polarográficos – S: 10 -12 g/mL – FL: 10 6

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Detectores • Espectrometria de massa - universal • Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação • Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.

Interface CL-EM

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Detectores • Espectrometria de massa

TIC SIM MASSA / CARGA MASSA / CARGA TEMPO TEMPO

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Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.

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Tipos de CLAE • PARTIÇÃO : líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química . Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa.

Fase normal : Fase reversa FE de natureza fortemente polar (ex. água) : FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel.

FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.

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Tipos de CLAE • É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C 8 (n-octil) ou C 18 (n-octadecil)

Campo

Farmacêutico Bioquímico

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Tipos de CLAE

Misturas típicas

Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Produtos químicos Poluentes Química forense Clínica médica Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos

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Tipos de CLAE • ADSORÇÃO HPLC.

: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de • TROCA IÔNICA : líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica. • EXCLUSÃO : líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.

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Para refletir e responder:

Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas?

Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.

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Para refletir e responder:

A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito?

A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?

F I M