Transcript ANALISIS ASAM AMNIO

ANALISIS ASAM AMNIO DAN PROTEIN
Abdul Rohman
Fakultas Farmasi UGM
Bahan Pembelajaran Analisis asam amino dan
Protein
Pendahuluan
2. Analisis Asam amino
a. Titrimetri
b. Gasometri
c. Spektrofotometri
d. Kromatografi
1.
Asam amino
 AA merupakan monomer penyusun protein. Kebanyakan
protein disusun oleh 20 asam amino
 Sumber utama diet AA pada manusia berasal dari protein,
yang secara enzimatis akan didigesti untuk membebaskan
AA-nya
 AA dapat berada dalam bentuk bebas atau terikat dalam
peptida atau protein  menentukan metode analisis dan
penyiapan sampelnya
What is amino acid?
What is amino acid?
Amino Acid: aminated carboxylic acid (R-COOH)
R group
Examples
NH2CH2COOH
-amino
acetic acid
NH2CH2CH2COOH
-amino
propanoic acid
NH2CH2CH2CH2CH2CHCOOH
NH2
,-2 amino caproic acid
Classification of Amino Acid
1. By the location of Amino-group ： / / -AA
2. By its acidity： neutral/ acidic/ basic AA
ratio of Amino-group to carboxylic group
3. By whether containing phenyl group
aromatic / non aromatic AA
4. By its occurrence in protein
Protein / non protein AA
5. By polarity of R group :
polar / apolar side chain AA
6. By its nutrient value to human:
Essential AA and non-essential AA
20 -AA commonly found in proteins
-aa structure
Name
NH2
glycine
CH2COOH
NH2
CH3 CHCOOH
alanine
CH3 NH2
CH3 CH CHCOOH
valine
CH3
NH2
CH3 CH CH2 CHCOOH
leucine
CH3 NH2
CH3 CH2 CH CHCOOH
isoleucine
Continued
-aa structure
NH2
Name
methionine
CH3SCH 2CH2 CHCOOH
CH2 NH
CH2
CH2 CHCOOH
NH2
CH2 CHCOOH
NH2
CH2 CHCOOH
N
proline
phenylalanine
tryptophan
H
NH2
HO CH2 CHCOOH
serine
continued
-aa structure
HO NH2
CH3CH CHCOOH
NH2
HS CH2 CHCOOH
HO
NH2
CH2 CHCOOH
NH2
NH2 COCH2 CHCOOH
NH2
H2NCOCH2CH2 CHCOOH
En name
threonine
cystine
tyrosine
asparagine
glutamine
continued
-aa structure
NH2
HOOC CH2 CHCOOH
NH 2
HOOC CH2CH2 CHCOOH
NH2
H2NCH2CH2CH2CH2 CHCOOH
Aspartic acid
Glutamic acid
lysine
=
NH2
NH
H2N C NH CH2CH2CH2 CHCOOH
En name
NH2
CH2 CHCOOH
N
N
H
arginine
histidine
Titrasi Formol
H2N
CH
C
O
HOH2C
O
OH
Formaldehid
R
N
+ HCOH
HOH2C
NaOH
HOH2C
CH
OH
N-dimetilol
O
N
C
R
Asam amino
HOH2C
CH
C
R
N-dimetilol
O
HOH2C
OH
N
HOH2C
CH
R
C
ONa + H2O
Gasometri
HO
NH2
R
C
COOH + HNO2
H
R
N
OH
N
C
COOH
H
R
COOH + N2
C
H
"intermediate"
Gugus alfa amino primer dari asam amino bereaksi dengan asam nitrit
dan menghasilkan gas nitrogen (N2).
Asam nitrit ini dibuat dengan mereaksikan natrium nitrit dengan asam
asetat.
Gas nitrogen yang terjadi dimurnikan dengan mengalirkannya pada
kalium permanganat, untuk selanjutnya dikumpulkan dan diukur
volumenya.
Spektrofotomeri UV
Aromatic AAs absorb light in the near ultraviolet
(230-300nm).
CH2
NH 2
CHCOOH
phenylalanine
NH2
CH2 CHCOOH
N
H
tryptophan
HO
NH2
CH2 CHCOOH
tyrosine
Note: This UV absorption property of
protein is solely determined by the
content of these 3 aromatic AAs. However,
far ultraviolet (190nm)absorption of
protein stems from the peptide bond.
UV Spectra
Derivative spectrophotometry
Spektroskopi visibel
Ninhidrin
Metode yang dikembangkan
Ninhidryn
FRIEDMAN, M. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 385−406
Contoh Metode yang dikembangkan
High performnce liquid Chromatography
Detektor
 Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling umum
digunakan untuk analisis bahan makanan menggunakan KCKT.
 AA dapat dideteksi secara langsung dengan UV karena AA mampu
menyerap di panjang gelombang antara 190 – 210. Meskipun
demikian, karena kebanyakan pelarut dan juga komponen matriks
sampel yang lain juga menyerap di daerah ini, maka AA harus
diderivatisasi terlebih dahulu sebelum dianalisis dengan KCKT
menggunakan detektor spektrofotometer UV-Vis.
 Derivatisasi AA dapat dilakukan sebelum pemisahan di kolom
kromatografi (pre-column derivatization) atau dilakukan setelah AA
keluar dari kolom (post-column derivatization).
Beberapa agen penderivat yang
digunakan
O
O
COOH
-
COO
OH
+
+
H3N
C
OH
H
N
R
- CO2
R
Asam -amino
Ninhidrin
CH
- H2O
O
O
O
O
O
H
H
H 2O
N
C
O
R C H
R
O
H
NH2
O
HO
+
HO
O
O
O
N
- 2H2O
O
O
diketohidrindilen-diketohidrindamin
(senyawa berwarna ungu)
Dideteksi di panjang gelombang 570 nm
Dansil klorida
O
O
H2N
CH C
OH +
Cl
S
O
R
N(CH3)2
Asam amino
Dansil klorida
R
O
HO
C
CH
N
H
S
+ HCl
O
O
derivat dansil-asam amino
Source: Snyder et al., 1997
N(CH3)2
Dansil-AA dideteksi
dengan fluoresensi (λeks
360 nm; λemisi = 470
nm) dan dengan UV
(λmaks 250 nm)
Dabsil klorida
O
N
N
N
S
O
Cl
+
H2N
O
N
OH
Asam amino
O
O
N
C
R
dabsil klorida
N
CH
S
O
N
H
CH
C
OH
R
Derivat asam amino-dabsil klorida
Turunan dabsil menunjukkan serapan maksimal di 420 nm (daerah tampak),
serta sangat stabil, dan batas deteksinya berada di level pmol. Turunan ini
tetap stabil setelah penyimpanan selama 4 minggu di suhu ruang.
1-fluoro-2,4-dinitrobenzena (FDNB)
F
O
-
O-
O
N+
+
H2N
CH
C
N+
H
O
Asam amino
O
O
1-fluoro-2,4-dinitrobenzena
H
N
CH
C
H
-
O-
O
N+
N+
O
O
Derivat asam amino-dinitrobenzena
OH
OH
Fenilisotiosianat
O
H2N
CH
C
OH +
N
C
S
R
Asam amino
fenilisotiosianat
H
..N
S
H
H
C
N
C
R
C
HO
O
"senyawa antara"
H+, -H2O
siklisasi
S
C
Meskipun derivatisasi ini tidak sepeka
dibandingkan dengan teknik
derivatisasi yang menghasilkan derivat
yang dideteksi dengan fluoresen, akan
tetapi produk PTC-AA bersifat sangat
menyerap UV, sehingga AA dengan
level pmol dapat dideteksi.
H
N
N
C
Karena hasil derivatisasi bersifat tidak
berfluoresensi, maka teknik derivatisasi
dengan PITC dideteksi dengan
spektrofotometri UV-Vis, yang
umumnya dilakukan di 254 nm (λmaks
= 269 nm).
CH
R
O
derivat feniltiohidatoin
Batas sensitifitas agen penderivat ini
adalah 50 pmol pada rasio sinyal/derau
(S/N) 2,5
orto-ftalaldehid
O
O
H2N
H
CH C
OH
+
+
H
R
Asam amino
HS-CH2-CH2-OH
2-merkaptoetanol
O
O-ftalaldehid
R
N
CH
COOH
C
S-CH2-CH2-OH
derivat yang berfluoresensi
Derivat yang dihasilkan antara AA dengan OPA
dapat dideteksi dengan UV pada panjang
gelombang 330 nm, akan tetapi untuk
menghasilkan sensitifitas yang tinggi, maka
digunakan detektor fluoresen dengan λeks = 330
nm dan λ em = 430 nm.
Dietil 2(etoksimetiliden)propandioat
O
COOH
+ C2H5O
R
OC2H5
NH2
Asam amino
O
OH-
DEEMM
O
COOH
R
OC2H5
OC2H5
N
H
O
OC2H5
Deteksi UV: 280 nm
Kromatogram standar AA (atas)
dan AA dalam sampel madu
(bawah). Deteksi UV = 280 nm).
Konsentrasi standar AA (mg/kg) di
berikan dalam tanda kurung.1 =
histidin (6,4); 2 = arginin (15,4);
3= asparagin (20,8); 4 = glutamin
(41,8); 5 = serin (9,9); 6 = asam
aspartat (25,3); 7 = asam glutamat
(12,7); 8 = treonin (8,0); 9 =
glisin (5,1); 10 = β-alanin (3,5);
11 = asam γ-aminobutirat (2,4);
12 = α-alanin (7,0); 13 = prolin
(948,3); 14 = tirosin (15,7); 15 =
metionin (3,5); 16 = valin (4,7);
17 = cistein (15,1); 18 = triptofan
(7,2); 19 = ornitin (2,11); 20 =
fenilalanin (93,2); 21 = isoleusin
(14,5); 22 = leusin (15,5); 23 =
lisin (7,8)
Source: Rebane, R. and Herodes, K. 2010. Analytica Chimica Acta 672: 79–84
Gas Chromatography
Principle:
H O
H O
R C C OH + C4 H9OH HCl
100
NH2
R C C OC4 H9
+ H 2O
NH+
3Cl-
Non-volatile AA
H O
O
R C C OC4 H9 + ( CF3C ) O
2
NH+
3Cl-
H O
R C C OC4 H9
N C CF3
H O
Volatile AA-derivate
Automatic AA analyzer
From pH2.2 to pH 6.4