Transcript Μάθημα 5, 6, 7

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ
ΒΙΟΛΟΓΙΑ
ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ
• Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη
Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες
σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα,
τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.
Ενότητες
• Απομόνωση DNA, RNA
• Ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης
• Περιοριστικά ένζυμα
• Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
•
Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA
• Παραγωγή ανασυνδιασμένων πρωτεινών
• Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης
• Αλληλούχιση DNA μορίων (Sanger Sequencing)
• BLAST και εργαλεία στοίχισης DNA αλληλουχιών
• Εισαγωγή γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα
• Σύνθεση cDNA μορίων
• Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR, qRT-PCR)
• Μικροσυστοιχίες γονιδίων (Microarrays)
• Deep sequencing
• Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
• Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι
μέθοδος
παραγωγής
μεγάλου
αριθμού
αντιγράφων
συγκεκριμένων
μικρών
αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση
PCR: 1985, Βραβείο Nobel για τον
Kary Mullis in 1993
Αναλώσιμα
χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών
(primers) που έχουν συμπληρωματική
αλληλουχία με τα άκρα του DNA στόχου
+ MgCl2
+ Buffer διάλυμα
+ dNTPs
+ Taq polymerase
+ εκκινητές
ηλεκτροφόρηση
Ένας χώρος  χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, χρήση
απολυμαντικών και UV
•Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών!
•Χρονικός χωρισμός!
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
• Βασίζεται στην ιδιότητα των
αλυσίδων του DNA
α) να αποχωρίζονται σε
υψηλή θερμοκρασία και να
επανενώ νονται σε
χαμηλότερη θερμοκρασία και
β) να αντιγράφονται
• Παράγονται εκατομμύρια
αντιγράφων
PCR απαιτούνται:
• Magnesium chloride: .5-2.5mM
• Buffer: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polymerase: 1-2.5 units
• Target DNA: 1–10 μg/ml
ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ (PRIMERS)
 Εκκινητές : 20-30 νουκλεοτίδια  GC = 40-6-% ομοιογενώς
κατανεμημένα.
 Περίπου 104 αντίγραφα DNA απαιτούνται για την ανίχνευση προϊόντος PCR
μετά από 25-30 κύκλους αντίδρασης... 1–10 μg/ml DNA.
… ↑ DNA + αριθμοί κύκλων ↓ ειδικότητα εκκινητή
 Τm  Wallace formula:
Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C
 ΜgCl 2  απαραίτητο για την Taq polymerase!!!
Κινητική της αντίδρασης της PCR
ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR
Αντιδραστήρια PCR
συγκέντρωση Mg++
συγκεντρώσεις εκκινητών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα
θερμοκρασίες πρόσδεσης –(annealing)
Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην PCR.
•Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές
συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mM ως και
3mM
Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών
•Stock of primers: 100pmol/μl
•Υποδιπλάσιες αραιώσεις:
50pmol/μl,
25pmol/μl,
12,5pmol/μl,
6,25pmol/μl και
3,125pmol/μl
για κάθε έναν από τους εκκινητές.
Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών
Π.χ.
Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των
εκκινητών
•Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC
Π.χ.
Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA
ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 1/2
Cloning and selection markers
Antibiotics
The problem of self ligation
-Need for additional selection markers
Generation of engineered restriction sites on plasmids on selection
markers
LacZ, Blue-white selection
+
INSERT
LacZ, Blue-white selection
Applications of PCR
Basic Research
•Genotyping
•Genomic cloning
• Sequencing
Applied Research
•Detection of pathogens
•Pre-natal diagnosis
•Cancer research-Mutation detection
•Molecular Epidemiology
+Real time PCR
+cDNA synthesis and quantitative RT-PCR
Basic Research_Molecular cloning
Γονοτυπιση και Ταυτοποίηση γενομικου DNA
• Το γενομικό DNA περιέχει πολυμορφικές περιοχές που διαφέρουν
μεταξυ των ατόμων.
• Οι πολυμορφικές περιοχές περιέχουν αλληλοχίες μικροδορυφορικου
DNA. Το μικροδορυφορικό DNA (ή short tandem repeats STR) είναι
μικρές, επαναλαμβανόμενες, απλές αλληλουχίες DNA, μήκους 1-6 bp
• Οι πολυμορφικές περιοχές πολλαπλασιάζονται με multiplex PCR, και τα
παραγόμενα κομμάτια DNA διαχωρίζονται με βάση το μεγεθός τους. Το
παραγόμενο μοτίβο (pattern) λειτουργεί σαν πλαίσιο ταυτοποίησης
(unique barcode) ενός ατόμου.
Short tandem repeat
DNA FRAGMENT ANALYSIS
STR1
STR2
STR3
STR4
DNA-Based Human Identification
DNA detection of pathogens
Ανίχνευση DNA με τεράστια ευαισθησία 
ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ
μικρές συγκεντρώσεις σε ενα βιολογικό δείγμα
• Το PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μοριακή ταυτοποίηση
βακτηριακών
• Το PCR μπορεί να ανιχνεύσει γονίδια ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε
αντιβιοτικά
PRC diagnostics
RT-PCR can detect specific RNA sequences within a sample.
Example: Retroviruses have an RNA genome.
Retroviral RNA can be detected by RT-PCR to diagnose retroviral infections.
Viruses
• HIV, SARS, H5N1
Bacteria
• meningococcus, legionellosis
Analysis for resistant genes
• MRSA, VRE
Molecular Identification:
Detection Of Pathogens
Sensitivity of detection of PCR-amplified M. tuberculosis DNA. (Kaul et al.1994)
Mutation detection
Sanger Sequencing
Genomic PCR amplification
Sanger sequencing
PCR_ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ
cDNA synthesis
RECOMBINANT PROTEINS
Production of recombinant Insulin
pET System
T7 RNA Polymerase is an RNA polymerase from
the T7 bacteriophage that catalyzes the formation
of RNA in the 5'→ 3' direction.