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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC UNIVERSIDADE FEDERAL DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CEARÁ FARMACOLOGIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE MEDICINA LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa Fortaleza/CE 2014 História Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos; Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN, 2010) Câncer (Grego - caranguejo) ◦ Hipócrates – Grécia Antiga Conjunto de doenças ◦ Crescimento desordenado ◦ Poder invasivo (BROWN & ATTARDI, 2005) http://www.thedailygreen.com http://www.ciclodavida.com.br Câncer • 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública Em 2008: 7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo 70 % ocorreram em países de baixa ou média renda Brasil – 518.510 novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013) Até 2020: Cerca de 15 milhões de novos casos 60 % em países em desenvolvimento Fonte: OMS 2008 Brasil Fonte: INCA 2011 Câncer “ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.” ATIVAÇÃO DE ONCOGENES SILENCIAMENTO DE GENES SUPRESSORES DE TUMOR ALTERAÇÃO PROGRAMAS CELULARES: PROLIFERAÇÃO MIGRAÇÃO DIFERENCIAÇÃO APOPTOSE (HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009) Carcinogênese Dano ao DNA – mutação Falha mecanismos de reparo e na maquinaria apoptótica Agentes Citotóxicos Céls. transformadas Expanção clonal – câncer Dano ao DNA Reparação de céls. com menor intensidade proliferativa DNA reparado Mecanismos de morte funcionantes Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005 TIPOS DE MORTE CELULAR Apoptose Autofagia PS PS PS PS PS LC 3 LC 3 PS Catástrofe Mitótica Necrose NECROSE Alterações mitocondriais Vacuolização Inchaço Célula normal Perda da integridade de membrana Extravasamento de mediadores inflamatórios Desintegração de organelas APOPTOSE Diminuição do volume celular Condensação da cromatina Formação de Blebs Fragmentação internucleossomal do DNA Lise dos corpos apoptóticos Célula normal Formação dos corpos apoptóticos Ações Importantes: Promoção da saúde; Detecção precoce; Assistência aos pacientes; Vigilância; Formação de recursos humanos; Comunicação e mobilização social; Na pesquisa e gestão do SUS; Desenvolvimento de tratamento mais eficazes. Terapias Anticâncer Cirurgia Remoção da massa tumoral Mata rapidamente células tumorais em divisão, incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes Radiação Ionizante Imunoterapia Terapia Dirigida Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula tumoral Quimioterapia Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias) Terapia que se utiliza do sistema imune para combater o câncer KUMAR et al., 2004 Quimioterapia Definição: ◦ Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007). Objetivo primário: ◦ Destruir células neoplásicas preservando células normais. PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER Produtos Naturais Papaver somniferum Plantas Cryptotethya crypta Penicillium notatum Organismos Marinhos Microorganismos Síntese Química Drogas Anti-câncer Originadas de Plantas Derivados da Vinca Vimblastina Vincristina Vindesina Taxanos Vinca rosea Taxus brevifolia Paclitaxel Docetaxel Camptotecinas Topotecano Irinotecano Podofilotoxinas Etoposídeo Tenoposídeo Camptotheca accuminata Produtos Naturais x Derivados Contudo há necessidade do desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversos do tratamento; O trabalho da química medicinal tem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótipos de drogas; (MARKMAN, 1998) Produtos Naturais x Derivados Número de drogas Nº de Drogas Aprovadas nos EUA até 2007 Derivados de prod. nat. Produtos naturais anos Adaptado de LI & VEDERAS, 2010 Problemática da Quimioterapia Esquemas terapêuticos falhos; Altos índices de recidivas; Redução da sobrevida de pacientes; Efeitos adversos; Resistência ◦ Inerente ◦ Adquirida Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae) Utilizadas para tratamento: Hanseníase Cefaléia Dor de dente Doenças venéreas Dispepsia OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42 •Parte aérea seca (temp. Ambiente) •Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH. •Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida. •Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42) Quinonas Definição: Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado. Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural; Amplo espectro de atividades biológicas: Microbicida Tripanossomicidas Viruscidas Antitumorais benzoquinona naftoquinona antraquinona QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS Inibição de Topoisomerase Geração de espécies reativas de oxigênio Objetivos Geral: Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de ação da FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro. Objetivos Epecíficos: Determinar a IC50 da FR42 em um painel de linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue. Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence) Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina. METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO Manutenção das Linhagens Celulares 10mL Cultura de células • Meio de cultura RPMI 1640; •10 ou 20% de soro fetal bovino; • 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina); • 3% de fitohemaglutinina (linfócitos). 37°C / 5% de CO2 Repique em meio de cultura novo Contagem/Observação Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT Contagem Cultura de células Células plaqueadas e drogas diluídas usando o HTS (High throughput screening) Formasan 0,039 a 5µg/mL MTT 3h Absorbância em 595nm 72 h Formazan Doadores de eSuccinato MTT NADH + NADPH Citoplasma Berridge & Tan, 1993 meio extra-celular TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSP ENSAIO DO ALAMAR BLUE Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular. Forma oxidada Forma reduzida Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h Linhagens FR42 μM DOX Tumorais SF-295 HCT-116 2,0 (1,70 -2,45) 0,41 (0,34 – 046) 0,01-0,02 2,10 (1,72 – 2,48) 0,21 (0,15 – 0,29) 4,39 (3,53 – 5,40) 0,45 (0,29 – 0,52) OVCAR - 8 HL-60 2,20 (1,90 – 2,77) 0,02 (0,02 – 0,03) Normais CMSPH 16,82 (12,18 – 23,27) 1,78 (0,52 – 1,80) Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence). Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence). C- ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO CITOMETRIA DE FLUXO CITOMETRIA DE FLUXO Diluição com Corante desejado FR42 48 h Células SF-295 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha. Viáveis Não Viáveis Iodeto de propídeo não ligado Iodeto de propídeo ligado CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNA DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA. Quantidade de DNA por núcleo G1 S G2/M DNA Fragmentado 4n 2n G1 S G2 Interfase Mitose FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA CICLO CELULAR POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência. Despolarizadas Polarizadas POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA Microscopia Confocal SF-295 24h 20.000 céls/poço Tratar com os compostos testes 24h Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de meio novo Adicionar 4 uL da Anexina V/AlexaFluor568 Lavar com PBS 15 min – temp. ambiente Resuspende com 200 uL de meio novo Hoechst – 10 min CONCLUSÃO OBRIGADO!